CN101153327A - 沙门氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒 - Google Patents

沙门氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN101153327A
CN101153327A CNA200710030437XA CN200710030437A CN101153327A CN 101153327 A CN101153327 A CN 101153327A CN A200710030437X A CNA200710030437X A CN A200710030437XA CN 200710030437 A CN200710030437 A CN 200710030437A CN 101153327 A CN101153327 A CN 101153327A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
inv
reaction
salmonellas
amplification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA200710030437XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN101153327B (zh
Inventor
魏泉德
张彩虹
谭爱军
张丽荣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ZHUHAI DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER
Original Assignee
ZHUHAI DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ZHUHAI DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER filed Critical ZHUHAI DISEASE PREVENTION AND CONTROL CENTER
Priority to CN200710030437XA priority Critical patent/CN101153327B/zh
Publication of CN101153327A publication Critical patent/CN101153327A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101153327B publication Critical patent/CN101153327B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop－mediated isothermal amplification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。一种沙门氏菌amplification，LAMP)检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为沙门氏菌的invA－GenBank登陆号：DQ644633，所述引物与所述靶基因的382－580bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明通过提供一种对沙门氏菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在沙门氏菌特定基因片段，进而确定标本中是否存在沙门氏菌。

Description

沙门氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
技术领域
本发明涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对沙门氏菌特定基因片段具有特异性的引物及引物组；还涉及将所述引物及引物组用环介导等温扩增法检测沙门氏菌的检测方法和检测试剂盒。
背景技术
食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱弧菌，副溶血性弧菌以及E.coli O157:H7，轮状病毒以及诺如病毒引起的食物中毒，其发病率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题。
目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且免疫学方法的特异性和敏感性均较低。
随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌PR72H序列的特异性，通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术(国际专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65℃左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩增法检测沙门氏菌的检测方法和检测试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种对沙门氏菌特定基因片段具有特异性的引物。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种沙门氏菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为沙门氏菌的invA---GenBank登陆号：DQ644633，所述引物与所述靶基因的382---580bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
本发明的另一个目的在于，提供一种对沙门氏菌特定基因片段具有特异性的引物组。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种沙门氏菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物F3-inv    GAACGTGTCGCGGAAGTC
反向外引物B3-inv    CGGCAATAGCGTCACCTT
正向内引物FIP-inv GCGCGGCATCCGCATCAATATCTGGATGGTATGCCCGG
反向内引物BIP-inv GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA
可以扩增沙门氏菌的invA(DQ644633)基因序列的382---580bp位的核酸序列的一部分或其互补链。
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增法检测沙门氏菌的检测方法。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种沙门氏菌的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在沙门氏菌，其特征在于，以沙门氏菌的invA(DQ644633)基因序列的382---580bp位的核酸序列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用上述引物或引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。
具体检测方法为：
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本；细菌待检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0ml增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20～30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul上清液做待检模板DNA；
2)沙门氏菌的环介导等温扩增(LAMP)
取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul～100ul的反应体系，混匀点离后在约65℃条件下恒温保温约60分钟，然后置于80℃的环境下2分钟灭活酶。
反应体系为(反应总体积20ul～100ul)：
成分   终浓度或量
  待检模板 核酸模板   1-10ul
扩增反应液 正向内引物FIP-inv反向内引物BIP-inv正向外引物F3-inv反向外引物B3-inv甜菜碱betainedNTPmgsO4反应缓冲液Bst DNA Polymerase Buffer 10×   1.0-2.0uM1.0-2.0uM0.15-0.3uM0.15-0.3uM0.8-1.5M1.0-1.6mM2-6mM1/10反应体积(ul)
  酶 Bst DNA Polymerase   0.16-0.64U/ul
  双蒸水 ddH2O   加至预定反应体积(ul)
3)LAMP反应产物的检测：
A)肉眼检测：与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；或，
B)加染料后检测：每25ul体系的反应管加1000×SYBR Green I(Invitrogen)1-2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，
C)电泳检测：2-3％琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，最小片段在130bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。
本发明的另一个目的在于，提供一种利用上述引物组基于环介导等温扩增法检测沙门氏菌的检测试剂盒。
上述目的是通过如下技术方案实现的：
一种沙门氏菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有上述引物组的扩增反应液、酶。
所述扩增反应液中包括如下试剂：
  成分   终浓度或量
扩增反应液   正向内引物FIP-inv反向内引物BIP-inv正向外引物F3-inv反向外引物B3-inv甜菜碱betainedNTPmgsO4反应缓冲液Bst DNA Polymerase Buffer 10×   1.0-2.0uM1.0-2.0uM0.15-0.3uM0.15-0.3uM0.8-1.5M1.0-1.6mM2-6mM1/10预定反应体积(ul)
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
所述酶为每微升含8-16个活性单位的Bst DNA酶。
所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为肠炎沙门菌基因组DNA(1～100nM)。
本发明通过提供一种对沙门氏菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在沙门氏菌特定基因片段，进而确定标本中是否存在沙门氏菌。本发明检测试剂和检测方法具有敏感性高、特异性强、方便快捷、不需特殊仪器、适用范围广等优点，可解决食源性病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，与现有的PCR方法相比具有特异性强、敏感性比PCR高或相当、比PCR省时约2小时、不需特殊仪器(扩增反应在水浴锅中即可完成)等优点。
附图说明
图1本发明所述引物组合进行环介导等温扩增(LAMP)后可通过肉眼观察的结果。图例：1、阳性扩增结果；2、阴性扩增结果。
图2本发明所述引物组合进行环介导等温扩增(LAMP)后加入染料观察的结果。图例：1、阴性扩增结果；2，3、阳性扩增结果。
图3本发明所述引物组合进行环介导等温扩增(LAMP)结果的电泳图。图中，1：100bp marker；2、3：肠炎沙门氏菌；4：鼠伤寒沙门氏菌；5：伤寒沙门氏菌；6-14：分别为金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌产肠毒素A菌株、金黄色葡萄球菌产肠毒素B菌株、金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株、痢疾志贺氏杆菌、大肠杆菌O157：H7、变形杆菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌，上述细菌均为标准菌株。
具体实施方式
下面通过具体的沙门氏菌检测过程来对本发明进行说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例一  对已知菌株的invA基因的扩增
一)引物组的设计
通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出沙门氏菌特异性基因inV的382---580bp核酸序列，针对该片段的六个位点(这六个位点分别：382-399bp；471-490bp；414-431bp；563-580bp；493-512bp；534-552bp。)设计出LAMP引物并合成，得到如下的引物；引物设计通过LAMP专用引物设计软件结合分子生物学分析软件Advance Vector NTI完成。
序列编号1
正向外引物F3-inv    GAACGTGTCGCGGAAGTC
序列编号2
反向外引物B3-inv    CGGCAATAGCGTCACCTT
序列编号3
正向内引物FIP-inv  GCGCGGCATCCGCATCAATATCTGGATGGTATGCCCGG
序列编号4
反向内引物BIP-inv GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA
所述6个位点的序列分别为：
382-399bp：gaacgtgtcgcggaagtc
414-431bp  tctggatggtatgcccgg
471-490bp  tattgatgcggatgccgcgc
493-512bp  gaacggcgaagcgtactgga
534-552bp  ttcctttgacggtgcgatg
563-580bp  aaggtgacgctattgccg
其中，
所述正向外引物F3：扩增始于382-399bp(gaacgtgtcgcggaagtc)；
所述正向内引物FIP：扩增始于471-490bp的互补序列(gcgcggcatccgcatcaata)和414-431bp(tctggatggtatgcccgg)；
所述反向外引物B3：扩增始于563-580bp互补序列(cggcaatagcgtcacctt)；
反向内引物BIP：扩增始于493-512bp(gaacggcgaagcgtactgga)和534-552bp互补序列(catcgcaccgtcaaaggaa)。
上述引物组中各引物的共性在于：与沙门氏菌特异性基因invA的382---580bp核酸序列互补。
二)本实施例实验的菌株与各菌株的扩增结果如下表一
表一(为了便于理解，本申请人将下列序号与图1中编号设置成一致)
  序号   分子量标准品及供试菌株   有无扩增
  1 100bp marker
  2   肠炎沙门菌(ATCC-13076)   阳
  3   肠炎沙门菌(ATCC-13076)   阳
  4   鼠伤寒沙门菌(CMCC-50115)   阳
  5   伤寒沙门菌(CMCC-50071)   阳
  6   金黄色葡萄球菌标准株(CMCC-26003-25) 阴
  7   金黄色葡萄球菌产肠毒素A菌株(ATCC-13565)   阴
  8   金黄色葡萄球菌产肠毒素B菌株(ATCC-14458)   阴
  9   金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株(ATCC-19095)   阴
  10   痢疾志贺菌(CMCC-51252)   阴
  11   大肠杆菌O157:H7(CMCC-44050-3)   阴
  12   副溶血性弧菌(VPL 4-90)   阴
  13   奇异变形杆菌(CMCC-49005)   阴
  14   霍乱弧菌(569B)   阴
上述供试菌株均为标准菌株，购自中国医学微生物菌种保藏管理中心。“阴”表示无扩增反应，“阳”表示有扩增反应。
三)上述各菌株基因DNA的提取
细菌待检标本(除金黄色葡萄球菌以外)用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0ml增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒(如TIANamp Bacteria DNA Kit)提取模板DNA或加30ul三蒸水煮沸5分钟，直接取2ul上清液作模板DNA；金黄色葡萄球菌标本需用肠道增菌液增菌培养8-12小时后用基因组DNA提取试剂盒(TIANampBacteria DNA Kit)提取DNA。
四)基于LAMP法的基因扩增
取扩增反应液14.6ul，加2.0ul待检模板，加1ul酶，再加7.4ul ddH2O，形成如下表总体积为25ul的反应体系，在温度为65℃的恒温水浴锅保温约60分钟，然后置于80℃、2分钟灭活酶。
反应体系为：(反应总体积为25ul)
  成分   储存液浓度   量(ul)   终浓度
  核酸模板FIP-invBIP-invF3-invB3-invbetainedNTPmgsO4Bst DNA Polymerase BufferBst DNA PolymeraseddH2O 40uM40uM10uM10uM5M10mM150mM10×8U/ul   2.01.01.00.50.55.03.50.62.51.07.4 1.6uM1.6uM0.2uM0.2uM1M1.4mM3.6mM0.32U/ul
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液：包含1/10预定反应体积的10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、3.6mM硫酸镁、1.6uM正向内引物FIP-inv、1.6uM反向内引物BIP-inv、0.2uM的正向外引物F3-inv、0.2uM的反向外引物B3-inv、1.4mM dNTP和1M甜菜碱(betaine)；
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
酶：Bst DNA聚合酶(每微升含8个活性单位)。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定的反应体积。
五)扩增产物的检测
随着扩增反应的进行，从dNTP析出的焦磷酸根离子和反应液中存在的镁离子将形成焦磷酸镁沉淀。因此，只有在发生核酸扩增的反应液中才会出现白色浑浊。这样可以通过如下方式进行判断。
A)肉眼检测：与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；(参见图1) 或，
B)加染料后检测：每25 ul体系的反应管加1000×SYBR Green I(Invitrogen)1-2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；(参见图2)或，
C)电泳检测：2-3％琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，最小片段在130bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。(参见图3)
经对扩增产物的检测，表明上述引物组对伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌出现LAMP扩增反应，对照菌未出现扩增反应，显示了良好的特异性。
6)灵敏度比较：
以肠炎沙门菌作为检测菌，将1×106CFU/mL的菌液做一系列稀释：106、105、104、103、102、101、100，分别用LAMP方法和PCR方法(上下游引物分别为F3-inv、B3-inv)来检测，检测结果表明LAMP反应敏感性达100CFU/mL；PCR反应敏感性达101CFU/mL；结果显示LAMP反应敏感性比PCR反应敏感10倍。
实施例二
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反应体系为：
反应体系为：(反应总体积为25ul)
  成分   储存液浓度   量(ul)   终浓度
  核酸模板FIP-invBIP-invF3-invB3-invbetainedNTPmgsO4Bst DNA Polymerase BufferBst DNA PolymeraseddH2O 25uM25uM7.5uM7.5uM4M10mM100mM10×8U/ul   1.01.01.00.50.55.02.50.52.50.510.0 1.0uM1.0uM0.15uM0.15uM0.8M1.0mM2.0mM0.16U/ul
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液：包含1/10预定反应体积的10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、2mM硫酸镁、1.0uM正向内引物FIP-inv、1.0uM反向内引物BIP-inv、0.15uM的正向外引物F3-inv、0.15uM的反向外引物B3-inv、1.0mM dNTP和0.8M甜菜碱(betaine)；
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
酶：Bst DNA聚合酶(每微升含8个活性单位)。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定的反应体积。
实施例三
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反应体系为：
反应体系为：(反应总体积为25ul)
 成分   储存液浓度   量(ul)   终浓度
 核酸模板FIP-invBIP-invF3-invB3-invbetainedNTPmgsO4Bst DNA Polymerase BufferBst DNA PolymeraseddH2O 50uM50uM15uM15uM7.5M10mM150mM10×16U/ul   1.01.01.00.50.55.04.01.02.51.07.5 2.0uM2.0uM0.3uM0.3uM1.5M1.6mM6.0mM0.64U/ul
除核酸模板外，上述反应体系可以简化为扩增反应液，酶和双蒸水。
扩增反应液A：包含1/10预定反应体积的10×Bst DNA PolymeraseBuffer反应缓冲液、6mM硫酸镁、2.0uM正向内引物FIP-inv、2.0uM反向内引物BIP-inv、0.3uM的正向外引物F3-inv、0.3uM的反向外引物B3-inv、1.6mM dNTP和1.5M甜菜碱(betaine)；
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-HCl)、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
酶：Bst DNA聚合酶(每微升含16个活性单位、终浓度0.64U/ul)。
双蒸水的加入原则是，在其他试剂的量确定后，加入双蒸水使反应体积到达预定的反应体积。
实施例四
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反应体系为：(反应总体积为100ul)
  成分   储存液浓度   量(ul)   终浓度
  核酸模板FIP-invBIP-invF3-invB3-invbetainedNTPmgsO4Bst DNA Polymerase BufferBst DNA PolymeraseddH2O 40uM40uM10uM10uM5M10mM150mM10×8U/ul   10.04.04.02.02.020.014.02.410.04.027.6 1.6uM1.6uM0.2uM0.2uM1M1.4mM3.6mM0.32U/ul
实施例五
本实施例与实施例一的区别在于，本实施例中，基于LAMP法的基因扩增使用的反应体系为：(反应总体积为20ul)
  成分   储存液浓度   量(ul)   终浓度
  核酸模板FIP-invBIP-invF3-invB3-invbetainedNTPmgsO4Bst DNA Polymerase BufferBst DNA PolymeraseddH2O 40uM40uM10uM10uM5M10mM150mM10×8U/ul   2.00.80.80.40.44.02.80.482.00.85.52 1.6uM1.6uM0.2uM0.2uM1M1.4mM3.6mM0.32U/ul
实施例六  从呕吐物中分离的菌株的检测
菌株基因DNA的提取及扩增、检测
取食物中毒者呕吐物25g，用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0ml增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，加30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul上清液。另用前述肠道增菌培养液接种分离培养平板，菌落用生物-梅里埃GNI+卡及VITEC 32全自动微生物分析仪进行分离株的鉴定。
对上述提取的基因DNA与实施例一同样的通过LAMP法进行核酸扩增和扩增产物的检测。扩增结果与VITEC鉴定结果比对，如下表二。
    菌株序号     有无扩增     鉴定结果
菌株1 有     肠炎沙门菌
菌株2 无     粪大肠杆菌
如表二所示，鉴定结果表明分离的菌株含有沙门氏菌和粪大肠杆菌，基于VITEC 32全自动微生物分析仪的鉴定结果与使用引物组扩增的结果一致，只有在鉴定为沙门氏菌的标本中观察到上述引物组产生的扩增。
                  序列表
<110>珠海市疾病预防控制中心
<120>沙门氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
<160>5
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
GAACGTGTCGCGGAAGTC    18
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
CGGCAATAGCGTCACCTT    18
<210>3
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
GCGCGGCATCCGCATCAATATCTGGATGGTATGCCCGG    38
<210>4
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA    39
<210>5
<211>199
<212>DNA
<213>沙门氏菌
<400>5
382 gaacgtgtc gcggaagtcg cggcccgatt ttctctggat
421 ggtatgcccg gtaaacagat gagtattgat gccgatttga aggccggtat tattgatgcg
481 gatgccgcgc gcgaacggcg aagcgtactg gaaagggaaa gccagcttta cggttccttt
541 gacggtgcga tgaagtttat caaaggtgac gctattgccg

Claims (9)

1.一种沙门氏菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为沙门氏菌的invA---GenBank登陆号：DQ644633，所述引物与所述靶基因的382---580bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
2.一种沙门氏菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成：
正向外引物F3-inv    GAACGTGTCGCGGAAGTC
反向外引物B3-inv    CGGCAATAGCGTCACCTT
正向内引物FIP-inv GCGCGGCATCCGCATCAATATCTGGATGGTATGCCCGG
反向内引物BIP-inv GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA可以扩增沙门氏菌的invA基因序列的382---580bp位的核酸序列的一部分或其互补链。
3.根据权利要求2所述的沙门氏菌检测用引物组合，其特征在于，所述引物组可以扩增沙门氏菌的如下片断或互补链：
所述正向外引物F3：扩增382-399bp；
所述正向内引物FIP：扩增471-490bp的互补序列和414-431bp；
所述反向外引物B3：扩增563-580bp互补序列；
反向内引物BIP：扩增493-512bp，和534-552bp的互补序列。
4.一种沙门氏菌的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在沙门氏菌，其特征在于，以沙门氏菌的invA---基因库登陆号：DQ644633基因序列的382---580bp位的核酸序列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用权利要求1所述的引物或权利要求2所述的引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。
5.根据权利4所述的沙门氏菌的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体为：
1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本；细菌待检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1.0ml增菌液10000rpm离心2分钟，弃其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20～30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul上清液做待检模板DNA；
2)沙门氏菌的环介导等温扩增
取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul～100ul的反应体系，混匀点离后在约65℃条件下恒温保温约60分钟，然后置于80℃的环境下2分钟灭活酶。
反应总体积20ul～100ul的反应体系为：
  成分   终浓度或量   待检模板   核酸模板   1-10ul 扩增反应液   正向内引物FIP-inv反向内引物BIP-inv正向外引物F3-inv反向外引物B3-inv甜菜碱betainedNTPmgsO4反应缓冲液Bst DNA Polymerase Buffer 10×   1.0-2.0uM1.0-2.0uM0.15-0.3uM0.15-0.3uM0.8-1.5M1.0-1.6mM2-6mM1/10反应体积(ul)   酶   Bst DNA Polymerase   0.16-0.64U/ul   双蒸水   ddH2O   加至预定反应体积(ul)
其中10×Bst DNA Polymerase Buffr反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
所述酶为每微升含8-16个活性单位的Bst DNA酶。
3)LAMP反应产物的检测：
A)肉眼检测：与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；或，
B)加染料后检测：每25ul体系的反应管加1000×SYBR Green I Invitrogen1-2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，
C)电泳检测：2-3％琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，最小片段在130bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。
6、根据权利5所述的沙门氏菌的检测方法，其特征在于，当反应总体积为25ul时，所述反应体系具体为：
成分   储存液浓度   量(ul)   终浓度 核酸模板FIP-invBIP-invF3-invB3-invbetainedNTPmgsO4Bst DNA Polymerase BufferBst DNA PolymeraseddH2O 40uM40uM10uM10uM5M10mM150mM10×8U/ul   2.01.01.00.50.55.03.50.62.51.07.4 1.6uM1.6uM0.2uM0.2uM1M1.4mM3.6mM0.32U/ul
6.一种沙门氏菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有权利要求1所述的引物或权利要求2所述的引物组的扩增反应液、酶。
7.根据权利要求7所述的沙门氏菌检测用试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液中包括如下试剂：
  成分   终浓度或量 扩增反应   正向内引物FIP-inv反向内引物BIP-inv正向外引物F3-inv反向外引物B3-inv甜菜碱betaine   1.0-2.0uM1.0-2.0uM0.15-0.3uM0.15-0.3uM0.8-1.5M
  液   dNTPmgsO4反应缓冲液Bst DNA Polymerase Buffer 10×   1.0-1.6mM2-6mM1/10预定反应体积(ul)
其中10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液含有200mM pH 8.8的三羟基甲硫氨酸甲烷-盐酸、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X-100；
所述酶为每微升含8-16个活性单位、终浓度0.16-0.64U/ul的Bst DNA酶。
8.根据权利要求8所述的沙门氏菌检测用试剂盒，其特征在于，
所述扩增反应液：包含10×Bst DNA Polymerase Buffer反应缓冲液、3.6mM硫酸镁、1.6uM正向内引物FIP-inv、1.6uM反向内引物BIP-inv、0.2uM的正向外引物F3-inv、0.2uM的反向外引物B3-inv、1.4mM dNTP和1M甜菜碱；
所述酶为每微升含8个活性单位，终浓度0.32uM的Bst DNA酶。
9.根据权利要求8或9所述的沙门氏菌检测用试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为肠炎沙门菌基因组DNA。
CN200710030437XA 2007-09-21 2007-09-21 沙门氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒 Expired - Fee Related CN101153327B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200710030437XA CN101153327B (zh) 2007-09-21 2007-09-21 沙门氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200710030437XA CN101153327B (zh) 2007-09-21 2007-09-21 沙门氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101153327A true CN101153327A (zh) 2008-04-02
CN101153327B CN101153327B (zh) 2010-11-03

Family

ID=39255213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200710030437XA Expired - Fee Related CN101153327B (zh) 2007-09-21 2007-09-21 沙门氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101153327B (zh)

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102199665A (zh) * 2011-03-29 2011-09-28 镇江出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 沙门氏菌lamp快速检测试剂盒及其检测方法
CN102329882A (zh) * 2011-10-15 2012-01-25 浙江省质量技术监督检测研究院 三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒
CN102382884A (zh) * 2011-11-04 2012-03-21 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 肠炎沙门氏菌的链置换恒温扩增(sda)快速检测试剂盒及其检测方法
CN102424842A (zh) * 2011-12-21 2012-04-25 中国人民解放军疾病预防控制所 沙门氏菌的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒
CN102424861A (zh) * 2012-01-06 2012-04-25 扬州大学 检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法及试剂盒
CN102719424A (zh) * 2012-05-30 2012-10-10 曹际娟 肠炎沙门氏菌核酸标准样品、其建立方法及应用
CN102851383A (zh) * 2012-09-21 2013-01-02 武汉真福医药科技发展有限公司 快速检测沙门氏菌的lamp试剂盒
CN101880709B (zh) * 2009-12-29 2013-01-09 重庆市畜牧科学院 基于环介导等温扩增技术的肠炎沙门氏菌检测试剂盒及方法
CN103224988A (zh) * 2013-05-16 2013-07-31 汇智泰康生物技术(北京)有限公司 一种用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒及其使用方法
CN103627811A (zh) * 2013-12-11 2014-03-12 东北农业大学 一种快速检测肉中沙门氏菌的试剂盒及其应用
CN103725755A (zh) * 2012-10-10 2014-04-16 苏州四同医药科技有限公司 一种高特异高敏感检测沙门氏菌的方法
CN104164486A (zh) * 2014-06-18 2014-11-26 四川农业大学 一种桉树焦枯病原菌的lamp检测试剂盒及其使用方法
CN105803064A (zh) * 2015-09-30 2016-07-27 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心 检测肠杆菌科食源性致病菌的lamp方法、核酸及引物对
CN106868152A (zh) * 2017-03-14 2017-06-20 宁波海洋研究院 一种食源性致病菌沙门氏菌的检测方法
CN107988401A (zh) * 2017-12-29 2018-05-04 广东环凯微生物科技有限公司 沙门氏菌干粉化lamp快速检测试剂盒
CN109402271A (zh) * 2017-08-14 2019-03-01 中国科学院微生物研究所 用于检测沙门氏菌的引物系统和试剂盒以及他们的应用和检测沙门氏菌的方法
CN109652575A (zh) * 2019-03-05 2019-04-19 许绍坤 一种针对沙门氏菌的核酸快速检测方法
CN110093426A (zh) * 2018-01-30 2019-08-06 电子科技大学中山学院 肉鸽致病菌沙门氏菌lamp快速检测试剂盒
CN111057775A (zh) * 2019-12-30 2020-04-24 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 鉴定沙门氏菌属的特异性新分子靶标及其快速检测方法
CN111073985A (zh) * 2016-08-30 2020-04-28 上海生物信息技术研究中心 沙门氏菌的快速恒温检测方法、引物组及试剂盒

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110218806A (zh) * 2019-06-27 2019-09-10 华南农业大学 沙门菌fimW基因新型可视化LAMP快速检测引物组与试剂盒

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100395347C (zh) * 2004-08-20 2008-06-18 深圳太太基因工程有限公司 一种用于检测沙门氏菌核苷酸片段的引物和探针序列

Cited By (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101880709B (zh) * 2009-12-29 2013-01-09 重庆市畜牧科学院 基于环介导等温扩增技术的肠炎沙门氏菌检测试剂盒及方法
CN102199665A (zh) * 2011-03-29 2011-09-28 镇江出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心 沙门氏菌lamp快速检测试剂盒及其检测方法
CN102329882A (zh) * 2011-10-15 2012-01-25 浙江省质量技术监督检测研究院 三种食源性致病菌多重快速检测法及检测引物组和试剂盒
CN102382884A (zh) * 2011-11-04 2012-03-21 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 肠炎沙门氏菌的链置换恒温扩增(sda)快速检测试剂盒及其检测方法
CN102424842B (zh) * 2011-12-21 2013-08-07 中国人民解放军疾病预防控制所 沙门氏菌的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒
CN102424842A (zh) * 2011-12-21 2012-04-25 中国人民解放军疾病预防控制所 沙门氏菌的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒
CN102424861A (zh) * 2012-01-06 2012-04-25 扬州大学 检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法及试剂盒
CN102424861B (zh) * 2012-01-06 2013-07-31 扬州大学 检测食品中沙门菌的环介导等温扩增方法及试剂盒
CN102719424A (zh) * 2012-05-30 2012-10-10 曹际娟 肠炎沙门氏菌核酸标准样品、其建立方法及应用
CN102851383A (zh) * 2012-09-21 2013-01-02 武汉真福医药科技发展有限公司 快速检测沙门氏菌的lamp试剂盒
CN103725755A (zh) * 2012-10-10 2014-04-16 苏州四同医药科技有限公司 一种高特异高敏感检测沙门氏菌的方法
CN103224988A (zh) * 2013-05-16 2013-07-31 汇智泰康生物技术(北京)有限公司 一种用于检测食品中的沙门氏菌的试剂盒及其使用方法
CN103627811A (zh) * 2013-12-11 2014-03-12 东北农业大学 一种快速检测肉中沙门氏菌的试剂盒及其应用
CN103627811B (zh) * 2013-12-11 2015-07-01 东北农业大学 一种快速检测肉中沙门氏菌的试剂盒及其应用
CN104164486A (zh) * 2014-06-18 2014-11-26 四川农业大学 一种桉树焦枯病原菌的lamp检测试剂盒及其使用方法
CN104164486B (zh) * 2014-06-18 2016-07-06 四川农业大学 一种桉树焦枯病原菌的lamp检测试剂盒及其使用方法
CN105803064A (zh) * 2015-09-30 2016-07-27 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心 检测肠杆菌科食源性致病菌的lamp方法、核酸及引物对
CN105803064B (zh) * 2015-09-30 2020-05-15 杭州海关技术中心 检测肠杆菌科食源性致病菌的lamp方法、核酸及引物对
CN111073985A (zh) * 2016-08-30 2020-04-28 上海生物信息技术研究中心 沙门氏菌的快速恒温检测方法、引物组及试剂盒
CN111073985B (zh) * 2016-08-30 2022-09-20 上海市生物医药技术研究院 沙门氏菌的快速恒温检测方法、引物组及试剂盒
CN106868152A (zh) * 2017-03-14 2017-06-20 宁波海洋研究院 一种食源性致病菌沙门氏菌的检测方法
CN109402271A (zh) * 2017-08-14 2019-03-01 中国科学院微生物研究所 用于检测沙门氏菌的引物系统和试剂盒以及他们的应用和检测沙门氏菌的方法
CN107988401A (zh) * 2017-12-29 2018-05-04 广东环凯微生物科技有限公司 沙门氏菌干粉化lamp快速检测试剂盒
CN110093426A (zh) * 2018-01-30 2019-08-06 电子科技大学中山学院 肉鸽致病菌沙门氏菌lamp快速检测试剂盒
CN109652575A (zh) * 2019-03-05 2019-04-19 许绍坤 一种针对沙门氏菌的核酸快速检测方法
CN111057775A (zh) * 2019-12-30 2020-04-24 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 鉴定沙门氏菌属的特异性新分子靶标及其快速检测方法
CN111057775B (zh) * 2019-12-30 2022-06-14 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） 鉴定沙门氏菌属的特异性新分子靶标及其快速检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN101153327B (zh) 2010-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101153327B (zh) 沙门氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
CN101153330B (zh) 副溶血性弧菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
CN101153329B (zh) 金黄色葡萄球菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
CN101153326B (zh) 志贺氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
CN101153331A (zh) 大肠杆菌o157:h7检测用引物、检测方法、检测试剂盒
CN101153332B (zh) 霍乱弧菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
CN101153342B (zh) 轮状病毒a组g3型检测用引物组、检测试剂盒
CN106434917A (zh) 一种金黄色葡萄球菌的lamp引物组及检测试剂盒与使用方法
Bertrand et al. Evaluation of enrichment-free PCR-based detection on the rfbE gene of Escherichia coli O157—application to municipal wastewater
CN102367475B (zh) 不同血清型霍乱弧菌的m-PCR检测试剂盒及检测方法
CN101418335A (zh) 致病性嗜水气单胞菌检测用试剂及其检测方法
CN102424842A (zh) 沙门氏菌的lamp检测方法及其专用引物与试剂盒
CN102242197B (zh) 用于检测ndm-1基因的lamp试剂盒及其专用引物
CN101153328B (zh) 变形杆菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
CN103898227A (zh) 一种对克罗诺杆菌o抗原特异的核苷酸及其应用
CN102154497B (zh) 食品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和沙门氏菌的m-PCR引物和探针及检测方法
CN101153341B (zh) 诺如病毒gⅱ型检测用引物、检测方法、检测试剂盒
CN107022638A (zh) 快速检测沙门氏菌的lamp引物组及其应用
CN102559912A (zh) Taqman探针实时定量PCR检测双歧杆及大肠杆菌的方法
CN116219064A (zh) 一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒
CN103305613B (zh) 大鲵致病性嗜水气单胞菌pcr诊断试剂盒
CN102154469A (zh) 致病性弧菌通用检测法及所用的核酸等温扩增检测试剂盒
Wang et al. Endonuclease restriction-mediated real-time PCR for simultaneous detection of Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii
CN106222291B (zh) 一种分子检测和鉴定甘蔗赤条病菌不同株系的试剂盒
CN104328113B (zh) 一组核苷酸序列及在单增李斯特菌鉴定中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20101103

Termination date: 20120921