CN116219064A - 一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒 - Google Patents
一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，对隐球菌基因组DNA中一个目的片段的6个区域设计了6条特异引物组，包括上游外部引物F3、下游外部引物B3、上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游环化引物LF和下游环化引物LB；利用链置换Bst DNA聚合酶以及特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，实现核酸指数扩增，保证LAMP扩增的高度灵敏度和快速性；该技术对隐球菌的检测灵敏度高、操作简便，成本低，通过核酸染料可以实时观察荧光曲线变化。
Description
技术领域
本发明是关于生物检测的技术领域，特别是关于一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。
背景技术
新型隐球菌和格特隐球菌是中枢神经系统感染的重要原因，常引起艾滋病患者的机会性感染及一些天然免疫缺陷或医源性免疫抑制乃至免疫健全个人的感染，死亡率很高，在世界范围内仍是一个巨大的公共威胁。目前，隐球菌性脑膜炎(CM)的诊断通常是基于细菌培养，显微镜检及胶体金免疫层析法或乳胶凝集试验。但细菌培养周期长；显微镜检相对不灵敏，需要依靠有经验的工作人员；乳胶凝集试验及胶体金免疫层析法虽然灵敏快速，但由于勾状效应等原因也存在一定局限会影响诊断。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，其能够解决细菌培养周期长和显微镜检不灵敏的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组，根据NCBI中隐球菌28s rRNA基因序列号28S EF211264.1中目的片段设计引物组，包括上游外部引物F3、下游外部引物B3、上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游环化引物LF和下游环化引物LB，具体序列如下：
上游外部引物F3：gcggaggacttgaaagttct(SEQ ID NO.1)；
下游外部引物B3：accaaagtcccccacgac(SEQ ID NO.2)；
上游内部引物FIP：aagcaccagctcccaagtcccacttaccaggccatcgc(SEQ ID NO.3)；
下游内部引物BIP：agcatatgtgtatgtcgcggggctggttgactctacttgccg(SEQ IDNO.4)；
上游环化引物LF：agtagcgtacactgccaactt(SEQ ID NO.5)；
下游环化引物LB：gacttggggtaagacgcctt(SEQ ID NO.6)。
本发明还提供一种隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包括上述隐球菌的环介导等温扩增检测引物组。
进一步地，还包括环介导等温扩增反应试剂、指示剂、阳性对照质粒和阴性对照。
优选地，所述环介导等温扩增反应试剂包括：8U/μL Bst DNA聚合酶，1mM dNTP、20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、0.1％ Tween20、2mM MgSO4和0.8M Betaine。
进一步地，所述环介导等温扩增反应试剂还包括镁离子、甘油、二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻糖和/或PEG8000。
优选地，所述指示剂为SYBR green I、羟基茶酚蓝指示剂或钙黄绿素/Mn2+染色剂。
优选地，所述试剂盒内隐球菌的环介导等温扩增反应体系为25μL，各组分的用量为：环介导等温扩增反应试剂13-20μL、引物组1μL，指示剂1μL，加灭菌纯化水至25μL体系。
优选地，所述引物组内上游外部引物F3浓度为0.2μM、下游外部引物B3浓度为0.2μM、上游内部引物FIP浓度为1.6μM、下游内部引物BIP浓度为1.6μM、上游环化引物LF浓度为0.8μM、下游环化引物LB浓度为0.8μM。
优选地，所述阳性对照质粒为含隐球菌28s rRNA基因序列号28SEF211264.1中目的片段的质粒，通过提取到隐球菌目的片段和pUC57载体连接转化得到。
优选地，所述阴性对照为无菌无核酸酶去离子水。
与现有技术相比，根据本发明的一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，具有如下技术效果：
(1)针对隐球菌基因的6个区域设计6条特异性引物，扩增产物具有高度特异性，试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优势；
(2)反应时间仅需要45min，提高了检测效率，在恒温条件下反应，不需要价值昂贵、步骤繁琐的温度循环仪器，降低了检测成本，检测隐球菌方便快捷、成本低廉，适合基层医疗单位推广使用；
(3)仅需要观察荧光曲线或者浑浊度判断反应结果，不需要打开反应管，避免污染的发生。
附图说明
图1是根据本实施例1的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒检测临床疑似隐球菌感染的荧光曲线示意图；
图2是根据本实施例2的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒检测临床分离出来的隐球菌的荧光曲线示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
根据本发明优选实施方式的一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒，根据NCBI中隐球菌28s rRNA基因序列号28S EF211264.1中目的片段(SEQ ID NO.7)，设计引物，隐球菌的环介导等温扩增检测引物组由上游外部引物F3(SEQ ID NO.1)、下游外部引物B3(SEQ ID NO.2)、上游内部引物FIP(SEQ ID NO.3)、下游内部引物BIP(SEQ ID NO.4)、上游环化引物LF(SEQ ID NO.5)和下游环化引物LB(SEQ ID NO.6)组成，针对隐球菌基因的6个区域设计6条特异性引物，扩增产物具有高度特异性，具体序列如下：
目的片段：
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上游环化引物LF：agtagcgtacactgccaactt(SEQ ID NO.5)；
下游环化引物LB：gacttggggtaagacgcctt(SEQ ID NO.6)。
特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，实现核酸指数扩增。
环介导等温扩增(LAMP)是日本科学家在2000年左右发明的技术，通过识别模板序列200bp左右的序列中的六段位置实现，链置换酶发挥链置换作用来形成环介导等温扩增核心元件，形成指数扩增。环介导等温扩增技术，引物设计简单，操作方便，对机器要求低，可以在水浴锅进行反应，非常适合基层临床实时检测。同时，由于环介导等温扩增中会产生焦磷酸盐沉淀，从外观上会直接表现出浑浊度的变化，可以直接肉眼观察，初步筛选。也可以通过核酸染料进行实时荧光检测，从荧光曲线Ct值判断反应进行情况。技术选择性非常多，非常适合临床实时检测的要求，可以在1h内直接出诊断报告，极大压缩诊断消耗的时间。
隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，包括引物组、环介导等温扩增反应试剂、指示剂、阳性对照质粒和阴性对照无核酸酶水。
环介导等温扩增反应试剂包括：8U/μL Bst DNA聚合酶，1mM dNTP、20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、0.1％ Tween20、2mM MgSO4和0.8M Betaine。
利用链置换Bst DNA聚合酶以及特殊发卡引物在恒温条件下构造特异性扩增元件，实现核酸指数扩增，保证LAMP扩增的高度灵敏度和快速性。
环介导等温扩增反应试剂中可通过加入镁离子、甘油、二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻糖和/或PEG8000来改变荧光曲线到达平衡点的时间。
指示剂可选择使用SYBR green I、羟基茶酚蓝指示剂或钙黄绿素/Mn2+染色剂，优选使用SYBR green I。
LAMP检测的隐球菌LAMP反应体系为25μL，各组分的用量为：环介导等温扩增反应试剂(1mM dNTP混合物、20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、0.1％ Tween20、2mMMgSO4和0.8M Betaine、8U Bst DNA聚合酶)13-20μL、引物组1μL，指示剂1μL，加灭菌纯化水至25μL体系。
其中引物组的各引物浓度分别为上游外部引物F3浓度为0.2μM、下游外部引物B3浓度为0.2μM、上游内部引物FIP浓度为1.6μM、下游内部引物BIP浓度为1.6μM、上游环化引物LF浓度为0.8μM、下游环化引物LB浓度为0.8μM。
阳性对照质粒为含隐球菌28s rRNA目的片段(SEQ ID NO.7)的质粒，其构建方法是首先提取隐球菌目的基因DNA片段，通过PCR扩增方法将两个酶切位点分别加在DNA片段两头，然后用两种限制性内切酶分别酶切DNA片段和pUC57载体，分别进行胶回收，再通过连接，转化，涂平板，挑取单克隆，测序正确菌株直接扩增，提取质粒，冻干成粉末。
隐球菌的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样本DNA；
(2)将待测样本DNA和阳性对照质粒分别与引物组、环介导等温扩增反应试剂和指示剂混合；
(3)将步骤(2)的混合物先短暂离心再置于63℃荧光定量PCR仪反应45min，每30s读取一次信号，检测通道为FAM通道；
(4)应结束后观察荧光曲线变化或反应使馆浑浊度以及电泳产物来判断反应有无进行，判断结果。
本发明在恒温条件下反应，不需要价值昂贵、步骤繁琐的温度循环仪器，降低了检测成本。本发明反应时间仅需要45min，提高了检测效率。仅需要观察荧光曲线或者浑浊度判断反应结果，不需要打开反应管，避免污染的发生。本发明的试剂盒具有特异性强、灵敏度高等优势；检测隐球菌方便快捷、成本低廉，适合基层医疗单位推广使用。
实施例1隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒的特异性检测
(1)样本采集，采集患儿脑脊液，标本放置-80℃保存。
(2)提取待测样本DNA，利用Qiagen公司的DNeasy Blood&Tissue Kit DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA。
具体流程如下：
A、加入200uL冻存的脑脊液，样本需要预先融化；
B、加入Proteinase K 20uL；
C、加入200uL Buffer AL，涡旋5s；
D、56℃水浴10min；
E、加入无水乙醇200uL，涡旋15s，此步可能会出现絮状沉淀；
F、将上一步所得混合物加入QIAmp Mini吸附柱中，10000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放回收集管中；
G、加入500uL Buffer Buffer AW1，10000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
H、加入500uL Buffer Buffer AW2，10000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；
I、吸附柱放回收集管中，10000rpm离心2min，倒掉废液。开盖，将吸附柱室静置3min；
J、将吸附柱转入灭过菌的离心管中，向吸附膜中部滴加200uL Buffer AE或去离子水(TE会影响部分后续实验)，室温放置5min，10000rpm离心2min，将液体再一次加入吸附柱离心，将DNA溶液收集到新的离心管中；
K、提取到的基因组DNA产物测浓度和纯度，纯度达到要求后，储存在-20℃备用。
(3)LAMP检测
隐球菌LAMP反应体系为25μL，各组分的用量为：环介导等温扩增反应试剂(1mMdNTP混合物、20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、0.1％ Tween20、2mM MgSO4和0.8MBetaine、8U Bst DNA聚合酶)13-20μL、引物组1μL，指示剂(SYBR Green I或钙黄绿素等)1μL，加灭菌纯化水至25μL体系。混匀后将混合物置于63℃荧光定量PCR仪器反应45min，每30s读取一次荧光，检测通道为FAM通道。
同时设置阴性对照无菌无核酸酶去离子水和隐球菌阳性对照质粒，用以判定结果。阴性对照没有出峰且阳性对照出峰，则判定试剂有效；阴性对照没有出峰，阳性对照没有出峰，则判定试剂过期；阴性对照出峰，阳性对照出峰，则判定试剂污染，阴性对照出峰，阳性对照没有出峰，则判定试剂污染且过期。
(4)结果判定
结果如图1所示，其中1号为阳性对照，2-5号为临床样本4例，6号为阴性对照，判定临床样本2-5号和隐球菌阳性质粒1号为阳性，阴性对照6号为阴性，反应有效，结果可信。证明样本中存在隐球菌，同时证明该发明具有高特异性。
实施例2隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒的灵敏度检测
将临床样本在固体培养基上进行培养，挑取单克隆，进行扩增，提取基因组DNA，进行定量，然后依次定量成10μg/μL，1μg/μL，100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，在25μL隐球菌LAMP反应体系加入1μL进行反应，根据荧光信号判断反应进行情况。结果如图2所示，可以看出该检测试剂盒的检测限可以达到1ng，具有很高的灵敏度。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于，根据NCBI中隐球菌28srRNA基因序列号28S EF211264.1中目的片段设计引物组，包括上游外部引物F3、下游外部引物B3、上游内部引物FIP、下游内部引物BIP、上游环化引物LF和下游环化引物LB，具体序列如下：
上游外部引物F3：gcggaggacttgaaagttct(SEQ ID NO.1)；
下游外部引物B3：accaaagtcccccacgac(SEQ ID NO.2)；
上游内部引物FIP：aagcaccagctcccaagtcccacttaccaggccatcgc(SEQ ID NO.3)；
下游内部引物BIP：agcatatgtgtatgtcgcggggctggttgactctacttgccg(SEQ IDNO.4)；
上游环化引物LF：agtagcgtacactgccaactt(SEQ ID NO.5)；
下游环化引物LB：gacttggggtaagacgcctt(SEQ ID NO.6)。
2.一种隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述隐球菌的环介导等温扩增检测引物组。
3.如权利要求2所述的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，还包括环介导等温扩增反应试剂、指示剂、阳性对照质粒和阴性对照。
4.如权利要求3所述的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增反应试剂包括：8U/μL Bst DNA聚合酶，1mM dNTP、20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、50mM KCl、0.1％Tween20、2mM MgSO4和0.8M Betaine。
5.如权利要求4所述的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述环介导等温扩增反应试剂还包括镁离子、甘油、二甲基亚砜、单链结合蛋白、海藻糖和/或PEG8000。
6.如权利要求3所述的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述指示剂为SYBR greenI、羟基茶酚蓝指示剂或钙黄绿素/Mn2+染色剂。
7.如权利要求3所述的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内隐球菌的环介导等温扩增反应体系为25μL，各组分的用量为：环介导等温扩增反应试剂13-20μL、引物组1μL，指示剂1μL，加灭菌纯化水至25μL体系。
8.如权利要求7所述的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述引物组内上游外部引物F3浓度为0.2μM、下游外部引物B3浓度为0.2μM、上游内部引物FIP浓度为1.6μM、下游内部引物BIP浓度为1.6μM、上游环化引物LF浓度为0.8μM、下游环化引物LB浓度为0.8μM。
9.如权利要求3所述的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照质粒为含隐球菌28s rRNA基因序列号28S EF211264.1中目的片段的质粒，通过提取到隐球菌目的片段和pUC57载体连接转化得到。
10.如权利要求3所述的隐球菌的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为无菌无核酸酶去离子水。
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| CN117051167A (zh) * | 2023-10-11 | 2023-11-14 | 北京量觉科技有限责任公司 | 一种检测隐球菌的引物对、方法以及试剂盒 |
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