CN117210455B - 基于lamp方法检测东阳病毒的引物组、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于LAMP方法检测东阳病毒的引物组、试剂盒及方法。本发明的引物组包括一对外引物F3和B3以及一对内引物FIP和BIP，利用该引物组制备的荧光可视化快速检测试剂盒可实现对东阳病毒的高灵敏度和高特异性检测，最低检测限可达到1.98×100 copies/μL，不与穿山甲其它相关病毒反应，反应时间快，全程只需要40分钟就能完成检测，反应后可通过在紫外灯下观察反应产物颜色直接读取结果，不需依赖大型实验设备。这些优势使得本发明开发的基于LAMP的检测方法方便用于实验室和临床医学中对东阳病毒的快速检测和诊断。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及基于LAMP方法检测东阳病毒的引物组、试剂盒及方法。
背景技术
东阳病毒（Dong yang pangolin virus，DYPV）是一种新型瘟病毒，其具有高度可变的单链正义RNA基因组，包含一个大的开放阅读框(ORF)。该病毒可引起一系列临床症状，包括急性腹泻、急性出血性综合征、急性致命性疾病等消耗性疾病。有研究显示，感染DYPV的穿山甲出现肝肺充血、皮肤病变、肝细胞的癞核，脾脏淋巴细胞皮细胞增多，肝板坏死和肾小球坏死等病理变化。虽然国内外对DYPV的相关研究及报道较少，但其潜在的感染性应引起高度重视，避免DYPV的爆发和流行，危害动物或人类健康。新型瘟病毒DYPV的出现，可能严重危害动物或人类健康，因此对DYPV的检测和诊断等相关研究值得广大研究者关注。
环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性的核酸扩增酶-Bst DNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。执行LAMP检测只需要一个恒温模块，避免了PCR的热循环需求。LAMP检测技术具有高灵敏度、特异性、便利性和高效率的特征，已被广泛用于病原体诊断。
综上，开发基于环介导的等温扩增DYPV的引物组、试剂盒及相应的检测方法在本领域具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供基于LAMP方法检测东阳病毒的引物组、试剂盒及方法。
本发明的第一个目的是提供基于LAMP方法检测东阳病毒的引物组，包括一对外引物F3和B3以及一对内引物FIP和BIP；所述的外引物F3，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的外引物B3，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的内引物FIP，其核酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述的内引物BIP，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二个目的是提供一种基于LAMP方法检测东阳病毒的试剂盒，其包括环介导等温扩增试剂和所述的基于LAMP方法检测东阳病毒的引物组。
优选，所述的环介导等温扩增试剂包括Bst 3.0 DNA Polymerase、10×Isothermal Amplification Buffer II、dNTP mix、Betaine和MgSO4。
优选，所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为含有东阳病毒的 5’-UTR基因的重组质粒，所述的阴性对照品为DEPC处理的ddH2O。
本发明还提供所述的基于LAMP方法检测东阳病毒的引物组在制备用于检测穿山甲东阳病毒的试剂中的用途，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本。
本发明的第三个目的是提供一种非疾病诊断目的的基于LAMP方法检测东阳病毒的方法，其利用所述的基于LAMP方法检测东阳病毒的引物组检测东阳病毒。
优选，所述的方法，包括如下步骤：
S1. 提取待检样品中的RNA并反转录为cDNA；
S2. 利用所述的基于LAMP方法检测东阳病毒的引物组、以步骤S1获得的cDNA为模板进行环介导等温扩增反应；
S3. 扩增反应程序完成后，通过判断扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物来判断待检样品中是否含有东阳病毒。
优选，所述的步骤S2中，所述的环介导等温扩增反应的体系为25 μL：10 μM F3和B3引物各1.0 μL、40 μM BIP和FIP引物各1.0 μL、2.5 μL 10X Isothermal AmplificationBuffer II、1.0 μL 8U/μL Bst 3.0 DNA Polymerase、2.5 μL 10 mM dNTP Mix、1.5 μL100 mM MgSO4、2.5 μL 10 mM Betaine、1.0 μL cDNA模板，添加无核酸酶超纯水至25 μL；所述的环介导等温扩增反应的程序为：65℃下恒温反应60 min，然后在80℃下恒温处理5min。
优选，所述的步骤S3中，判断的方法为SYBR Green I荧光染色显色法：向扩增反应体系溶液中加入SYBR Green I，然后直接用肉眼观察；如果溶液变成绿色，则待检样品中含有东阳病毒；如果溶液保持橙色，则待检样品中不含有东阳病毒。
优选，所述的步骤S3中，判断的方法为琼脂糖凝胶电泳法：将扩增反应体系溶液进行琼脂糖凝胶电泳，如果出现梯形电泳条带，则待检样品中含有东阳病毒；如果无梯形电泳条带出现，则待检样品中不含有东阳病毒。
本发明的检测DYPV的LAMP引物组，引物组包括F3、B3、FIP、BIP，该引物组可以用于检测DYPV，其特异性良好、灵敏度高、稳定性良好，使反应时间减少，应用该LAMP引物组建立的环介导等温扩增技术来检测DYPV，在特异性、灵敏度和重复性方面都可以得到良好的效果。本发明方法最低检测限可达到1.98×100copies/μL，不与穿山甲其它相关病毒反应，反应时间快，全程只需要40分钟就能完成检测，反应后可通过在紫外灯下观察反应产物颜色直接读取结果，不需依赖大型实验设备。这些优势使得本发明开发的基于LAMP的检测方法方便用于实验室和临床医学中对DYPV的快速检测和诊断。
附图说明
图1为利用LAMP引物组扩增检测DYPV的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图2为LAMP引物组扩增检测DYPV的最佳反应时间的荧光染色显色观察结果；其中，反应管1-6分别为在65°C下进行60、50、40、30、20和10 min的反应结果；反应管7，阴性对照。
图3为LAMP引物组扩增检测DYPV的最佳反应时间的琼脂糖凝胶电泳结果；其中，泳道1-6分别为在65°C下进行60、50、40、30、20和10 min的反应结果；泳道7，阴性对照；M，DNAmarker。
图4为检测DYPV的LAMP引物组的灵敏度验证图；其中，泳道M：DNA marker；1-7泳道：DYPV RNA浓度从1.98 × 105copies/μL到1.98×10-1copies/μL；泳道8：阴性对照。
图5为检测DYPV的LAMP引物组的特异性验证图；其中，M泳道：DNA marker；泳道1-7依次对应LAMP反应分别来自模板东阳病毒（Dong yang pangolin virus，DYPV）基因组，丽水病毒（Lishuipangolin virus，LSPV）基因组、穿山甲呼吸道合胞病毒A(Respiratorysyncytial virus A，RSV-A)基因组、穿山甲呼吸道合胞病毒B（Respiratory syncytialvirus B,RSV-B）基因组、副流感病毒5型（Parainfluenza virus 5，PIV5）、巴泰病毒（Bataivirus, BATV）基因组、盖塔病毒（Getah virus, GETV）基因组；泳道8：阴性对照。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
本实施例提供了一种检测DYPV的LAMP引物组以及性能分析
1.1 引物设计
LAMP引物组设计采用PrimerExplorerV5软件进行设计，其网站为http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html，将从NCBI数据库上下载好的DYPV的序列导入上述软件，经过筛选得到针对DYPV的 5’-UTR保守区域的合适的引物组，进行引物合成，合成后的外引物F3、B3的浓度为10 μM，内引物FIP、BIP的浓度为40 μM。其使用浓度分别为：外引物F3、B3分别为1 μM；内引物FIP、BIP分别为1 μM。取不同体积的引物进行混匀后进行DYPV的检测。上述得到的LAMP引物组的序列具体如下：
外引物F3：GCCGTAGCAGTGAGTACAC（SEQ ID NO.1）；
外引物B3：GTGCTATGTTCCACGCCATT（SEQ ID NO.2）；
内引物FIP：CTGGGCATGCCCCCAACTACAGCCAACAAGGTTCCTACTG（SEQ ID NO.3）；
内引物BIP：CCGGGGGTTGGTTGCATGAATAGAGCCTTTCCCCATCGG（SEQ ID NO.4）。
1.2 RNA模板的制备
1.2.1 质粒RNA模板的制备：
pUC57-DYPV-5’UTR重组质粒（将DYPV的 5’-UTR保守区域基因片段连接到pUC57得到的）由库美生物技术有限公司合成构建，质粒含有T7启动子区域。DYPY 5’UTR的RNA转录本依照T7体外转录试剂盒制备，具体各试剂组分和用量见表1。37℃孵育2 h，孵育完全后加入2 μL的RNase free DNase I，37℃消化30 min，以除去残留DNA。
表1 体外转录反应体系
1.2.2 待检样品RNA模板的制备：
利用FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit（诺唯赞），提取样品基因组RNA，具体方法如下：
1. 向RNase-free离心管中加入200 μL样本(如样本量不足，使用PBS或0.9% NaCl补足)，加入500 μL Buffer VL，涡旋混匀15-30 s，将混合液瞬时离心收集至管底。
2. 将FastPure RNA Columns置于2 mL收集管中，转移上述混合液至FastPureRNA Columns中，12,000 rpm (13,400×g)离心1 min，弃滤液。
3. 向FastPure RNA Columns中加入600 μL Buffer RW，12,000 rpm (13,400×g)离心30 s，弃滤液。重复步骤3。空柱12,000 rpm (13,400×g)离心2 min。
4. 小心将FastPure RNA Columns转移至新的RNase-free 1.5 mL收集管 (试剂盒提供)中，向膜中央悬空加入30 - 50 μL的RNase-free ddH2O，室温放置1 min，12,000rpm (13,400×g)离心1 min。
5.弃去FastPure RNA Columns，RNA可直接用于后续检测或置于-30 ~ -15℃短期保存或置于-85 ~ -65℃长期保存。
1.3 cDNA模板的制备
利用1.2.2制备的RNA模板，逆转录反应为cDNA模板，反应体系见表2。反应程序为：30℃反应10 min，42℃反应40 min后95℃灭活5 min，cDNA产物-20℃储存备用。
表2 逆转录反应体系
1.4 LAMP反应扩增
LAMP反应体系见表3。反应程序：上机：恒温扩增PCR仪反应温度设置为65℃，60个循环进行反应，时间为60 min，再在80℃下反应5 min。
表3 LAMP反应体系
1.5 性能分析
LAMP引物组的灵敏度实验：
本试验初步对DYPV设计的引物组进行检出能力（灵敏度）分析。将pUC57-DYPV-5’UTR重组质粒按照1.98×105copies/μL、1.98×104copies/μL、1.98×103copies/μL、1.98×102copies/μL、1.98×101copies/μL、1.98×100copies/μL、1.98×10-1copies/μL七个梯度进行稀释，利用筛选出的上述引物组（外引物F3、B3和内引物FIP、BIP） 进行检出能力的探究，按上述1.2和1.3方法制备模板，再利用1.4方法进行扩增，重复三次。
结果如图4所示，由图可以看出，将pUC57-DYPV-5’UTR重组质粒进行10倍梯度稀释后，建立的DYPV LAMP检测体系灵敏度可达到1.98×100copies/μ L。
LAMP引物组的DYPV特异性实验：
特异性试验是评价LAMP引物组能否特异检出DYPV。分析该引物组是否对除DYPV之外的其他病毒有交叉反应。
该实验利用DYPV、LSPV基因组、RSV-A基因组、RSV-B基因组、PIV 5基因组、BATV基因组、GETV基因组为对象。
1.6、结果与分析
1.6.1 DYPV引物筛选及反应体系的建立
应用1.1中设计筛选的DYPV LAMP引物组，利用构建的pUC57-DYPV-5’UTR重组质粒采用上述1.2.1和1.3反应体系制备cDNA模板，再利用1.4的反应体系在65℃条件下反应60min，再80℃下反应5 min利用DYPV的LAMP引物组进行恒温扩增反应，扩增后的产物经凝胶电泳检测，结果如图1所示，电泳显示梯形条带。
1.6.2 DYPV反应时间优化
LAMP反应混合物包含10 μM F3和B3引物各1.0 μL、40 μM BIP和FIP引物各1.0 μL、2.5 μL 10X Isothermal Amplification Buffer II、1.0 μL 8U/μL Bst 3.0 DNAPolymerase、2.5 μL 10 mM dNTP Mix(Takara)、1.5 μL 100 mM MgSO4(Thermo FisherScientific)、2.5 μL 10 mM Betaine、1.0 μL cDNA模板，添加无核酸酶超纯水至25 μL。在65℃下进行60、50、40、30、20和10 min，以确定最佳反应时间。
方案一：通过向LAMP反应混合物中加入1.0 μL SYBR Green I (Invitgen)直接用肉眼观察产物。在LAMP扩增产物存在的情况下，溶液变成绿色；但在没有样本扩增产物的情况下，溶液保持橙色（图2）。
方案二：LAMP产物(10 μL)经2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色紫外可见（图3）。如为阳性时：琼脂糖凝胶电泳在紫外线光照下出现梯形条带（即有LAMP扩增产物）。如为阴性时：琼脂糖凝胶电泳在紫外线光照下无梯形条带出现（无LAMP扩增产物）。
1.6.3 DYPV灵敏度实验
根据1.5中的LAMP灵敏度实验方案，进行LAMP扩增，结果如图4所示：
从图4可以看出，pUC57-DYPV-5’UTR重组质粒按照1.98×105copies/μL、1.98×104copies/μL、1.98×103copies/μL、1.98×102copies/μL、1.98×101copies/μL、1.98×100copies/μL、1.98×10-1copies/μL七个梯度进行稀释。以上述的LAMP引物组作为引物进行LAMP扩增，出峰时间和浓度梯度呈明显梯度变化；检测灵敏度在1.98×100copies/μL时，仍出现良好的扩增信号，因此确定该引物组检测DYPV的检测限为1.98×100copies/μL。
1.6.4 DYPV特异性实验
从图5中得出结果，该引物组能特异性检出DYPV，对LSPV、RSV-A、RSV-B、PIV5、BATV、GETV表现为阴性样本，没有造成交叉反应，无扩增曲线产生，表明LAMP引物组特异性良好。
以上结果表明：
(1)本实施例针对DYPV的 5’-UTR保守区域采用Primer ExplorerV5软件和DNAStar软件设计LAMP引物，用恒温扩增PCR仪在65℃、60 min然后80℃、5 min，结果出现良好的扩增信号，成功建立了DYPV的LAMP技术检测方法；
(2)DYPV LAMP检测的最佳反应时间方面，在65℃下的LAMP反应产生了比在其他温度下看到的更强的带强度。因此，LAMP检测DYPV的最佳反应条件为65℃反应60 min。
(3)进行了所述的LAMP引物组的灵敏度实验，结果显示该引物检测限1.98×100copies/μL仍出现良好的扩增信号，因此确定该引物在检测DYPV的检测限为1.98×100copies/μL。
(4)本实施例中的LAMP引物组的特异性强，对DYPV的近源病毒和其他穿山甲相关病毒无交叉反应。
综上所述，应用本实施例建立的环介导等温扩增技术检测DYPV，具有灵敏度高，特异性强的特点，能快速准确对DYPV的核酸进行检测。
实施例2
本实施例提供了一种检测DYPV的试剂盒，包括反应液、阳性对照品、阴性对照品；
其中，反应液包括：Bst 3.0 DNA Polymerase、10X Isothermal AmplificationBuffer II、dNTP mix、Betaine、MgSO4、LAMP引物组。
LAMP引物组：
外引物F3的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；外引物B3的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；内引物FIP的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；内引物BIP的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。
外引物F3、B3的浓度为10 μM，内引物FIP、BIP的浓度为40 μM。
阳性对照品为pUC57-DYPV-5’UTR重组质粒；阴性对照品为DEPC处理的ddH2O。
本实施例还提供了一种利用上述的LAMP引物组及试剂盒的检测DYPV的方法，所述方法包括下列步骤：
A：提取待检样品中的核酸基因组制备环介导恒温扩增反应体系的模板；
B：将反应试剂加入进行环介导恒温扩增；
配置LAMP反应体系，每25 μL体积的LAMP反应体系：10 μM F3和B3引物各1.0 μL、40 μM BIP和FIP引物各1.0 μL、2.5 μL 10X Isothermal Amplification Buffer II、1.0μL 8U/μL Bst 3.0 DNA Polymerase、2.5 μL 10 mM dNTP Mix(Takara)、1.5 μL 100 mMMgSO4(Thermo Fisher Scientific)、2.5 μL 10 mM Betaine、1.0 μLcDNA模板，添加无核酸酶超纯水至25 μL。
LAMP反应的条件为在65℃下恒温反应60 min再在80℃下恒温反应5 min。
Claims (10)
1. 基于LAMP方法检测东阳穿山甲病毒（Dong yang pangolin virus）的引物组，其特征在于，包括一对外引物F3和B3以及一对内引物FIP和BIP；所述的外引物F3，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的外引物B3，其核酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的内引物FIP，其核酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的内引物BIP，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.一种基于LAMP方法检测东阳穿山甲病毒的试剂盒，其特征在于，包括环介导等温扩增试剂和权利要求1所述的基于LAMP方法检测东阳穿山甲病毒的引物组。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的环介导等温扩增试剂包括Bst3.0 DNA Polymerase、10× Isothermal Amplification Buffer II、dNTP mix、Betaine和MgSO4。
4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为含有东阳穿山甲病毒的 5’-UTR基因的重组质粒，所述的阴性对照品为DEPC处理的ddH2O。
5.权利要求1所述的基于LAMP方法检测东阳穿山甲病毒的引物组在制备用于检测东阳穿山甲病毒的试剂中的用途，所述的试剂用于检测来自于穿山甲的样本。
6.一种非疾病诊断目的的基于LAMP方法检测东阳穿山甲病毒的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的基于LAMP方法检测东阳穿山甲病毒的引物组检测东阳穿山甲病毒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 提取待检样品中的RNA并反转录为cDNA；
S2. 利用权利要求1所述的基于LAMP方法检测东阳穿山甲病毒的引物组、以步骤S1获得的cDNA为模板进行环介导等温扩增反应；
S3. 扩增反应程序完成后，通过判断扩增反应体系中是否扩增得到扩增产物来判断待检样品中是否含有东阳穿山甲病毒。
8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2中，所述的环介导等温扩增反应的体系为25 μL：10 μM F3和B3引物各1.0 μL、40 μM BIP和FIP引物各1.0 μL、2.5 μL10X Isothermal Amplification Buffer II、1.0 μL 8U/μL Bst 3.0 DNA Polymerase、2.5 μL 10 mM dNTP Mix、1.5 μL 100 mM MgSO4、2.5 μL 10 mM Betaine、1.0 μL cDNA模板，添加无核酸酶超纯水至25 μL；所述的环介导等温扩增反应的程序为：65℃下恒温反应60 min，然后在80℃下恒温处理5 min。
9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤S3中，判断的方法为SYBRGreen I荧光染色显色法：向扩增反应体系溶液中加入SYBR Green I，然后直接用肉眼观察；如果溶液变成绿色，则待检样品中含有东阳穿山甲病毒；如果溶液保持橙色，则待检样品中不含有东阳穿山甲病毒。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤S3中，判断的方法为琼脂糖凝胶电泳法：将扩增反应体系溶液进行琼脂糖凝胶电泳，如果出现梯形电泳条带，则待检样品中含有东阳穿山甲病毒；如果无梯形电泳条带出现，则待检样品中不含有东阳穿山甲病毒。
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