CN110628955B - 一种用于检测埃博拉病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测埃博拉病毒的crRNA靶点及CRISPR‑Cas13a系统。所述CRISPR‑Cas13a系统包括Cas13a蛋白和crRNA，或二者形成的复合体；所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向埃博拉病毒靶点序列的向导序列；所述埃博拉病毒靶点序列位于埃博拉病毒基因组第1001‑1028位。通过实验证明：本发明的crRNA可通过激活Cas13a实现对埃博拉病毒核酸的高灵敏、高特异检测，灵敏度达到单拷贝(1copy/test)。

Description

一种用于检测埃博拉病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统

技术领域

本发明涉及一种用于检测埃博拉病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统，属于分子诊断技术领域。

背景技术

埃博拉出血热是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起、导致人类和非人类灵长类动物发生急性感染的烈性传染病，具有致死率高、临床救治能力薄弱、无批准上市的特效药物及无疫苗预防的特点，主要流行于中非、西非地区，其死亡率高达50％～90％。目前埃博拉疫情已经构成了国际关注的突发公共卫生事件，被认为是世界上最凶猛的疾病之一，也是全球公共卫生面临的一大难题。埃博拉病毒的检测技术包括病毒的分离培养、IgM和IgG抗体的检测、荧光定量PCR、恒温核酸检测技术、免疫组化技术等。然而现有检测技术均存在一定的不足，胶体金法简单便携，但灵敏度不足；包括LAMP、RPA在内的恒温扩增法灵敏度很高，但在操作过程中易污染；荧光定量PCR法稳定、可靠、具有一定的灵敏度，但样本处理复杂，且对仪器要求高。

2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)，特异性达到单碱基的核酸检测技术——基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK(Specific HighSensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)，利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白(LwCas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于检测埃博拉病毒的CRISPR-Cas13a系统。

本发明提供的用于检测埃博拉病毒的CRISPR-Cas13a系统包括Cas13a蛋白和crRNA，或二者形成的复合体；

所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向埃博拉病毒靶点序列的向导序列；

所述埃博拉病毒的靶点序列位于埃博拉病毒基因组(GenBank ID：AF086833.2)第1001-1028位。

上述CRISPR-Cas13a系统中，所述埃博拉病毒靶点序列为序列1。

上述CRISPR-Cas13a系统中，所述crRNA序列为序列2。其中，序列2第1-38位为用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列；序列2第39-66位为靶向埃博拉病毒靶点序列的向导序列。

上述CRISPR-Cas13a系统中，所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种用于检测埃博拉病毒的试剂盒。

本发明提供的用于检测埃博拉病毒的试剂盒包括上述用于检测埃博拉病毒的CRISPR-Cas13a系统。

进一步的，所述试剂盒还包括用于特异性扩增埃博拉病毒靶点序列的引物对；所述引物对由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。

更进一步的，所述试剂盒还包括用于特异性扩增埃博拉病毒靶点序列的其他试剂和用于检测扩增产物的其他试剂。所述用于特异性扩增埃博拉病毒靶点序列的其他试剂包括缓冲液和/或ddH₂O；所述用于检测扩增产物的其他试剂包括如下试剂中的全部或部分：NTP(如NTP Mix)、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、报告RNA(RNAse Alert v2，报告RNA是具有信号报告功能的RNA分子)、RNase free water。

所述试剂盒还可包括记载有如下判定标准甲或判定标准乙的载体：

所述判定标准甲：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照(ddH₂O)荧光强度值高3倍以上(包括待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍的情况)，则待测样本含有或候选含有埃博拉病毒，否则待测样本不含有或候选不含有埃博拉病毒。

所述判定标准乙：若待测样本检测体系的荧光强度值大于或等于600a.u.(阴性对照荧光强度能达到的最高值的3倍)，则待测样本含有或候选含有埃博拉病毒，否则待测样本不含有或候选不含有埃博拉病毒。

本发明的第三个目的是提供如下任一物质：

A1)上述crRNA；

A2)上述Cas13a蛋白和crRNA，或者二者形成的复合体；

A3)上述引物对。

本发明的第三个目的是提供如下任一应用：

B1)上述系统或上述试剂盒或上述物质在检测或辅助检测埃博拉病毒中的应用；

B2)上述系统或上述试剂盒或上述物质在制备检测或辅助检测埃博拉病毒的产品中的应用；

B3)上述系统或上述试剂盒或上述物质在检测或辅助检测待测样本中是否含有埃博拉病毒中的应用；

B4)上述系统或上述试剂盒或上述物质在制备检测或辅助检测待测样本中是否含有埃博拉病毒的产品中的应用；

B5)上述系统或上述试剂盒或上述物质在筛选或辅助筛选埃博拉病毒防治药物中的应用；

B6)上述系统或上述试剂盒或上述物质在制备筛选或辅助筛选埃博拉病毒防治药物的产品中的应用；

B7)上述物质在制备上述试剂盒中的应用。

本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测埃博拉病毒的方法。

本发明提供的检测或辅助检测埃博拉病毒的方法包括如下步骤：

C1)以待测样本的核酸为模板，采用由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

C2)配制含有如下组分的CRISPR-Cas13a检测体系：所述PCR产物、上述Cas13a蛋白、上述crRNA、报告RNA、NTP、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂；同时以水(ddH₂O)替代所述PCR产物作为阴性对照；

C3)检测所述CRISPR-Cas13a检测体系的荧光强度，根据荧光强度的大小判定所述待测样本中是否含有埃博拉病毒：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍以上(包括待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍的情况)，则待测样本含有或候选含有埃博拉病毒，否则待测样本不含有或候选不含有埃博拉病毒。或在实际应用中的任何时候，也可按照如下方法进行判定：若待测样本检测体系的荧光强度值大于或等于600a.u.(阴性对照荧光强度能达到的最高值的3倍)，则待测样本含有或候选含有埃博拉病毒，否则待测样本不含有或候选不含有埃博拉病毒。

进一步的，步骤C1)中，所述PCR扩增的反应条件为：39℃反应20-40分钟；

步骤C3)中，所述反应的条件为：37℃，每2min读取一次荧光强度值，读取40次。

更进一步的，所述待测样本可为血液样本、器官(如肝、脾、肾等)组织样本、细胞等。

本发明所提供的检测或辅助检测埃博拉病毒的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在细胞水平筛选埃博拉病毒防治药物时检测用药前后细胞内是否含有埃博拉病毒。

上述任一所述系统或试剂盒或物质或应用或方法中，所述埃博拉病毒可为各种亚型的埃博拉病毒，如扎伊尔型(EBOV-Z)、苏丹型(EBOV-S)、科特迪瓦型(EBOV-C)及雷斯顿型(EBOV-R)。在本发明的具体实施例中，所述埃博拉病毒为扎伊尔型埃博拉病毒。

本发明基于CRISPR-Cas13a核酸检测技术，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于埃博拉病毒检测的靶点序列及能靶向该靶点序列的特异性crRNA，该crRNA可通过激活Cas13a实现对埃博拉病毒核酸的高灵敏、高特异检测，灵敏度达到单拷贝(1copy/test)。

附图说明

图1为候选5条crRNA用于检测EBOV的时间-荧光曲线。

图2为含有crRNA-3的CRISPR-Cas13a检测EBOV时间-荧光曲线。

图3为含有crRNA-3的CRISPR-Cas13a检测EBOV结果(20min)。

图4为含有crRNA-1的CRISPR-Cas13a检测EBOV时间-荧光曲线。

图5为含有crRNA-1的CRISPR-Cas13a检测EBOV结果(2min)。

图6为针对EBOV的CRISPR-Cas13a在检测其他病原时未出现交叉反应。

图7为针对EBOV的CRISPR-Cas13a在检测其他病原时未出现交叉反应(检测开始后80min)。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中涉及的试剂及其来源如下：SOC液体培养基、NTP mix(Solarbio)，EDTA、1M Tris pH 8.0，报告RNA试剂盒(RNAse Alert v2)，琼脂糖凝胶电泳DNA纯化回收试剂盒(天根生化)，RNA合成试剂盒(T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit)，RNA酶抑制剂(Murine RNase inhibitor)，T7 RNA聚合酶(NEB)，RNA纯化磁珠(Agencourt RNACleanXP，Beckman Coulter)，ExTaq Mix(TaKaRa)，二硫苏糖醇(DTT，北京欣经科生物技术有限公司)，氨苄西林钠(华北制药股份有限公司)，酵母提取物、胰蛋白胨(OXOID)，Tris平衡酚(灏样生物，TBD0001HY)，RAA检测试剂(江苏奇天)。

实施例1、基于CRISPR-Cas13a系统的埃博拉病毒核酸检测试剂盒及检测方法

(一)基于CRISPR-Cas13a系统的埃博拉病毒核酸检测试剂盒

一、LwCas13a蛋白

LwCas13a蛋白的表达、纯化及活性鉴定参见发明名称为“一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用”，公布号为CN108715849A的专利文件中的方法。具体步骤如下：

1、LwCas13a蛋白诱导表达、纯化及鉴定

LwCas13a表达质粒Addgene-PC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a自Addgene平台获取，将LwCas13a表达质粒转入Rosetta(DE3)感受态细胞中，TB液体培养基37℃、200rpm培养14h以上，1:100接入新的Amp⁺抗性TB培养基中，37℃、300rpm培养至OD600＝0.6左右，加入IPTG使终浓度为500uM，18℃、200rpm培养16h。离心收集菌体经超声破碎后收集蛋白上清，并利用LwCas13a蛋白所带的His标签通过Ni柱(HisTrap HP column，GE HealthcareLife Science)进行初步纯化，利用SUMO将所带标签部分进行酶切，再利用LwCas13a蛋白的等电点特性通过阳离子交换柱(UniGel-50SP，Nano-Micro Tech)进行第二次纯化，实验过程中利用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定每一步得到的蛋白，进行蛋白大小分析，同时利用His标签抗体进行蛋白的初步鉴定，以确定诱导的蛋白为目的蛋白。

2、LwCas13a蛋白浓度及活性鉴定

使用蛋白活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测LwCas13a蛋白浓度，利用报告RNA试剂盒(invitrgen)，检测490nm激发、520nm波长下的发射光的荧光值，判断体系中的Cas13a蛋白是否被激活。即在靶点RNA、与靶点对应的crRNA的存在下，Cas13a蛋白是否能被激活并剪切体系中的报告RNA，使其发出荧光，同时设置非特异性靶点进行特异性检测，以及人细胞总RNA作为背景RNA，检测体系是否会受到背景RNA的干扰。检测结果发现，本发明纯化得到纯度较高的LwCas13a蛋白，并且无RNase的污染，该蛋白与crRNA结合形成的复合体，可被特异的靶序列激活，并剪切体系中的报告RNA，从而发出荧光信号，该蛋白可用于后续的检测实验。同时，在蛋白终浓度为45nM时即可检测到明显的荧光信号变化。

二、crRNA的制备

1、引物序列的合成

合成表1中的各条序列。

表1、引物序列

2、PCR扩增

将上述步骤1合成的序列用ddH₂O稀释成10μM，配制PCR反应体系。配制PCR反应体系如表2所示。

表2、PCR扩增体系

PCR反应条件：95℃5min热变性；95℃30s，55℃30s，72℃15s，共38个循环；72℃自动延伸10min；4℃保存PCR产物。

3、PCR产物

使用Tris平衡酚对步骤2获得的PCR产物进行纯化，具体步骤如下：Tris平衡酚(灏样生物)取500μL，加入等体积的三氯甲烷，振荡混匀后短暂离心，弃上清；取150μL酚氯仿混合液加入PCR产物中，混匀后12,000rpm离心1min；取上清液到一个新的1.5mL离心管，加入无水乙醇使上清与乙醇比例为3:7，12,000rpm离心10min，弃上清；加入200μL 75％的乙醇，12,000rpm离心10min，弃上清(该步骤共进行三次)。得到的沉淀室温晾干(约10min)，加入50μL无RNA酶的水，Nanodrop检测浓度，-20℃保存。

4、转录

取1μg步骤3获得的纯化PCR产物，使用T7转录试剂盒(NEB)转录crRNA。crRNA转录体系如表3所示。

表3、crRNA转录体系

名称	体积
		NTP Mix	10μL 6.7mM each NTP final
PCR产物(步骤3)	1μg
		T7 RNA聚合酶	2μL
无Nuclease水	XμL
		总体积	20μL

上述crRNA转录体系混匀后，37℃转录过夜，使用DNaseⅠ去除多余的DNA：上一步得到的转录产物加入20μL无RNase的水，加入2μL DNaseⅠ，混匀，37℃孵育15min。

将转录获得的crRNA序列命名为EBOV-crRNA-1，EBOV-crRNA-1序列具体如下：GGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACauuguaucaguccuugcucugcauguac(序列2)，其中，序列2第1-38位为用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列；序列2第39-66位为靶向EBOV靶点序列的向导序列。

EBOV-crRNA-1靶点序列如下：attgtatcagtccttgctctgcatgtac(序列1)，位于EBOV基因组(GenBank ID：AF086833.2)第1001-1028位。制备出的EBOV-crRNA-1，用于后续CRISPR-Cas13a检测。

4、crRNA纯化

按照Agencourt RNA Clean XP说明书(Beckman Coulter)纯化步骤3转录获得的crRNA，具体步骤如下：磁珠振荡混匀，向转录产物中加入1.8倍体积的磁珠，吹打10次或涡旋30s以混匀磁珠和转录体系，室温静置5min。将反应体系放到磁力架，静置5-10min以分离磁珠。轻轻吸出体系中的液体，避免磁珠被吸出，向磁珠中加入200μL 70％的乙醇(无RNase水配制)，室温孵育30s，吸出乙醇；重复此过程清洗磁珠，共3次。室温晾干体系，去除体系中的乙醇，约10min。加入50μL RNase-free水，涡旋30s或用移液器吹打10次，吸出上清液，放入无RNase的1.5mL离心管中，Nanodrop测定纯化得到的crRNA浓度，-80℃分装备用。

三、质粒标准品的制备

1、质粒序列

Plasmid-EBOV是将如下来自埃博拉病毒基因组的序列：TTTGCAAGTCTATTCCTTCCGAAATTGGTAGTAGGAGAAAAGGCTTGCCTTGAGAAGGTTCAAAGGCAAATTCAAGTACATGCAGAGCAAGGACTGATACAATATCCAACAGCTTGGCAATCAGTAGGACACATGATGGTGATTTTCCGTTTGATGCGAACAAATTTTCTGATCAAATTTCTCCT(序列3)插入至pUC57载体中得到的质粒。其中，序列3第76-103位为EBOV-crRNA-1靶点序列。

2、质粒小提(全式金)

取甘油菌(1：500)加入Amp⁺LB(取10μL甘油菌+5ml LB)中，37℃、200rpm过夜接菌，取过夜培养的菌液，10000g离心1min，去上清(尽量吸尽)。如菌液量过大，可分多次离心收集。加入无色溶液RB(含RNase A)250μL，震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。加入蓝色溶液LB 250μL，温和的上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过5min)。加入黄色溶液NB 350μL，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min。12000g离心5min，小心吸取上清加入离心柱中。12000g离心1min，弃流出液。如上清体积大于800μL，可以分成多次加入柱中，并同上离心，弃流出液。加入650μL溶液WB，12000g离心1min，弃流出液。12000g离心1-2min，彻底去除残留的WB。将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μL EB或去离子水(PH>7.0)室温静置1min。10000g离心1min，洗脱DNA，测浓度，于-20℃保存。

3、质粒浓度测定

用Thermo的超微量分光光度计测定质粒浓度为：93.5ng/μL。

质粒长度为2895bp。

公式：copies/μL＝6.02×10²³×(ng/μL)×10^-9/DNA Length×660。

Copies/μL＝2.5×10¹⁰。

4、稀释

取10μL质粒到240μL水中，得到浓度为1×10⁹copies/μL质粒标准品。

四、RAA扩增引物的设计及RAA扩增产物的获得

1、RAA扩增引物的设计

根据参考文献(PMID:27246147)中的RPA引物设计旨在用于CRISPR检测的EBOV特异性RAA引物，在所述引物的5’端具有一段T7转录序列，使得RAA扩增得到的双链DNA(dsDNA)可以被T7 RNA聚合酶识别并且进行转录。引物序列如表4所示，由北京天一辉远公司合成。

表4、Ebola-RAA扩增引物

名称	序列
		Ebola-F	AATTCTAATACGACTCACTATAGGGTAGTAGGAGAAAAGGCTTGCCTTGAGAAGG(序列4)
Ebola-R	TGTTCGCATCAAACGGAAAATCACCATCATG(序列5)

2、RAA扩增产物的获得

以质粒标准品作为模板，采用步骤1设计的引物进行RAA扩增，得到RAA扩增产物。RAA扩增体系如表5所示。

表5、RAA扩增体系

名称	体积
		Plasmid-EBOV	1μL
Ebola-F(10μM)	2μL
		Ebola-R(10μM)	2μL
Buffer(随RAA扩增试剂盒提供)	25μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	17.5μL
总体积	47.5μL

将混合好的47.5μL溶液加入到装有冻干粉的基础反应单元中，使冻干粉充分重溶均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μL乙酸镁溶液，合上管盖瞬离收集并混合均匀。将上述反应管放置在39℃条件下反应20-40分钟。

五、最优crRNA筛选

为筛选到检测灵敏度更高、检测时间更短的crRNA，在EBOV靶序列(序列3)中共设计5条crRNA：EBOV-crRNA-1、EBOV-crRNA-2、EBOV-crRNA-3、EBOV-crRNA-4、EBOV-crRNA-5。其中EBOV-crRNA-1靶点序列如下：attgtatcagtccttgctctgcatgtac(序列1)，位于EBOV基因组(GenBank ID：AF086833.2)第1001-1028位；EBOV-crRNA-2靶点序列如下：acatgcagagcaaggactgatacaatat，位于EBOV基因组(GenBank ID：AF086833.2)第1003-1030位；EBOV-crRNA-3靶点序列如下：tgcagagcaaggactgatacaatatcca，位于EBOV基因组(GenBank ID：AF086833.2)第1006-1033位；EBOV-crRNA-4靶点序列如下：ttcaagtacatgcagagcaaggactgat，位于EBOV基因组(GenBank ID：AF086833.2)第996-1023位；EBOV-crRNA-5靶点序列如下：aagtacatgcagagcaaggactgataca，位于EBOV基因组(GenBank ID：AF086833.2)第999-1026位。

1、引物序列的合成

合成表2中的各条序列。

表6、引物序列

2、将实施例1步骤(一)的三获得的质粒标准品进行梯度稀释，得到含有不同浓度EBOV基因片段的质粒溶液：10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL。

3、按照实施例1步骤(一)的四中的方法进行RAA扩增，得到RAA扩增产物。

4、经RAA扩增后，取5μL扩增产物按照实施例1步骤(二)中的方法利用不同crRNA检测埃博拉病毒核酸，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。

检测结果显示，在用同一浓度的EBOV作模板时，EBOV-crRNA-3检测的荧光值较其他4条crRNA检测的荧光值要高(图1)。故选取EBOV-crRNA-3和EBOV-crRNA-1分别对不同浓度EBOV模板进行检测，EBOV-crRNA-3检测灵敏度可达到10⁰copies/test(图2)，然而EBOV-crRNA-3的检测速度较慢，在反应进行20min后，仅能有效检出10³copies/test浓度的EBOV(图3)。相比EBOV-crRNA-3，含有EBOV-crRNA-1的CRISPR-Cas13a系统灵敏度同样可达到10⁰copies/test(图4)，同时检测速度快，在反应开始后2min即可有效检出10⁰copies/test浓度的EBOV(图5)。由于EBOV-crRNA-1灵敏度和检测效率高，因此，将EBOV-crRNA-1作为EBOV检测的首选crRNA。

(二)基于CRISPR-Cas13a系统检测埃博拉病毒核酸的方法

一、CRISPR-Cas13a检测体系的配制

取5μL步骤(一)的四中获得的RAA扩增产物作为模板，按表7配制CRISPR-Cas13a检测体系。

将表7中的RAA产物替换为ddH₂O，且保持其他试剂组分不变，即为阴性对照。

表7、CRISPR-Cas13a检测体系

二、荧光强度检测

将含有步骤一配制的反应体系的PCR管放入荧光定量PCR仪中，设置通道激发光波长490nm，发射光波长520nm，37℃，每2min读取一次数值，读取40次共计80分钟，检测体系中荧光强度变化。

结果判定：在同一检测时间内，实验组荧光强度值比阴性对照(ddH₂O)荧光强度值高3倍以上即判定为阳性结果，或任何时候荧光强度大于或等于600a.u.(阴性对照荧光强度能达到的最高值的3倍)即可判定为阳性结果。

实施例2、本发明方法的灵敏度检测

以梯度稀释后的质粒标准品作为模板，按照实施例1中的方法检测不同浓度含有EBOV基因片段的质粒，以检测本发明方法的灵敏度。具体步骤如下：

1、将实施例1步骤(一)的三获得的质粒标准品进行梯度稀释，得到含有不同浓度EBOV基因片段的质粒溶液：10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL、10⁰copies/μL。

2、按照实施例1步骤(一)的四中的方法进行RAA扩增，得到RAA扩增产物。

3、经RAA扩增后，取5μL扩增产物按照实施例1步骤(二)中的方法基于CRISPR-Cas13a系统检测埃博拉病毒核酸，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。

CRISPR-Cas13a检测结果显示，10⁰-10⁶copies/μL的质粒扩增产物的荧光信号在反应开始后开始升高，而阴性对照组(ddH₂O)中的荧光强度不随时间推移而升高，含有埃博拉病毒核酸的实验组荧光值要显著高于阴性对照(图4)。从检测开始的第2分钟，10⁰copies/μL到10⁶copies/μL模板对应荧光信号分别为93.00±2.082a.u.、94.33±1.856a.u.、89.00±1.155a.u.、88.33±0.8819a.u.、81.00±2.646a.u.、73.00±0.5774a.u.、64.33±1.764a.u.，阴性对照荧光信号为11.00±5.508a.u.(图5)。与阴性对照相比，荧光强度均具有统计学差异(one way ANOVA检验，P<0.001)，结果表明本发明涉及的CRISPR-Cas13a检测系统可在最短2分钟内检出EBOV核酸，灵敏度达到单拷贝(1copy/test)。

实施例3、本发明方法的特异性检测

以森林脑炎病毒(TBEV)、2型登革病毒(DENV2)、4型登革病毒(DENV4)、日本脑炎病毒(JEV)、黄热病毒(YFV)、HBV病毒(HBV)和贝纳氏柯克斯氏体(Cb)病原核酸为模板，按照实施例1中的方法检测不同病毒核酸，以验证本发明方法的特异性。具体步骤如下：

1、分别以埃博拉病毒(EBOV)、森林脑炎病毒(TBEV)、登革病毒2型(DENV2)、登革病毒4型(DENV4)、日本脑炎病毒(JEV)、黄热病毒(YFV)、HBV病毒(HBV)和贝纳氏柯克斯氏体(Cb)核酸作为检测模板，按照实施例1步骤(一)的四中的方法进行RAA扩增，得到RAA扩增产物。

2、经RAA扩增后，取5μL扩增产物按照实施例1步骤(二)中的方法基于CRISPR-Cas13a系统检测各病毒核酸，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。

CRISPR-Cas13a检测结果显示，含有EBOV实验组的荧光信号在反应开始后开始升高，而阴性对照组(ddH₂O)以及含有其他病毒核酸的实验组中的荧光强度不随时间推移而升高，含有EBOV基因的实验组荧光强度要显著高于阴性对照以及其他病毒组(图6)。检测开始后第80分钟，含有EBOV基因的实验组荧光强度为阴性对照以及其他病毒组150倍(图7)。说明本发明的基于CRISPR-Cas13a系统检测埃博拉病毒核酸的方法具有很高的特异性，检测过程中不存在交叉反应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>一种用于检测埃博拉病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

attgtatcag tccttgctct gcatgtac 28

<210>2

<211>66

<212>RNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

gggauuuaga cuaccccaaa aacgaagggg acuaaaacau uguaucaguc cuugcucugc 60

auguac 66

<210>3

<211>185

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>3

tttgcaagtc tattccttcc gaaattggta gtaggagaaa aggcttgcct tgagaaggtt 60

caaaggcaaa ttcaagtaca tgcagagcaa ggactgatac aatatccaac agcttggcaa 120

tcagtaggac acatgatggt gattttccgt ttgatgcgaa caaattttct gatcaaattt 180

ctcct 185

<210>4

<211>55

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

aattctaata cgactcacta tagggtagta ggagaaaagg cttgccttga gaagg 55

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>5

tgttcgcatc aaacggaaaa tcaccatcat g 31

Claims (7)

1.一种用于检测埃博拉病毒的CRISPR-Cas13a系统，包括Cas13a蛋白和crRNA，或二者形成的复合体；

所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向埃博拉病毒靶点序列的向导序列；

所述埃博拉病毒靶点序列位于埃博拉病毒基因组第1001-1028位；

所述crRNA序列为序列2。

2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas13a系统，其特征在于：所述埃博拉病毒靶点序列为序列1。

3.根据权利要求1或2所述的CRISPR-Cas13a系统，其特征在于：所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。

4.一种用于检测埃博拉病毒的试剂盒，其包括权利要求1-3任一所述的用于检测埃博拉病毒的CRISPR-Cas13a系统。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于特异性扩增埃博拉病毒靶点序列的引物对；所述引物对由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。

6.如下任一物质：

A1)权利要求1-3中任一所述的crRNA；

A2)权利要求1-3中任一所述的Cas13a蛋白和crRNA，或者二者形成的复合体。

7.如下任一应用：

B1)权利要求1-3任一所述的系统或权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的物质在制备检测或辅助检测埃博拉病毒的产品中的应用；

B2)权利要求1-3任一所述的系统或权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的物质在制备检测或辅助检测待测样本中是否含有埃博拉病毒的产品中的应用；

B3)权利要求1-3任一所述的系统或权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的物质在筛选或辅助筛选埃博拉病毒防治药物中的应用；

B4)权利要求1-3任一所述的系统或权利要求4或5所述的试剂盒或权利要求6所述的物质在制备筛选或辅助筛选埃博拉病毒防治药物的产品中的应用；

B5)权利要求6所述的物质在制备权利要求4或5所述试剂盒中的应用。

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