CN114350854B - 一种基于RAA-CRISPR检测SARS-CoV-2 69-70del位点的方法 - Google Patents
一种基于RAA-CRISPR检测SARS-CoV-2 69-70del位点的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测SARS‑CoV‑2 69‑70del位点的CRISPR‑Cas13a系统。该系统包括RT‑RAA扩增引物、Cas13a蛋白和crRNA；RT‑RAA引物对由SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:8所示的单链DNA分子组成；SARS‑CoV‑2 69‑70del位点的靶点序列位于SARS‑CoV‑2基因组第21753‑21786位，并缺失tacatg 6个碱基；SARS‑CoV‑2 69‑70del位点的crRNA序列如SEQ ID NO:3所示。实验证明，本发明可实现对SARS‑CoV‑2 69‑70del位点核酸的高灵敏、高特异检测，灵敏度达到单拷贝。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种基于RAA-CRISPR检测SARS-CoV-269-70del位点的方法。
背景技术
COVID-19是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)所引起的疾病。随着时间的推移，SARS-CoV-2出现了多种新的值得关注的变异株(VOCs)。B.1.1.7谱系(VOC202012/01，501Y.V1)首先出现在英格兰南部，这个谱系的特征在于17个突变，包括14个氨基酸替换和3个位于ORF 1a/b，ORF8，Spike(S)和N基因区域2的框架内缺失。而位于S基因区中的69-70del已被证明具有潜在的生物学意义。69-70del是SARS-CoV-2刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)n端结构域(ntd)中的第69位的组氨酸(h69)和第70位的缬氨酸(v70)缺失突变，69-70del可引起S蛋白S1亚基构象改变。目前已有研究表明，69-70del主要与造成免疫逃逸的突变位点同时出现，增强病毒的细胞感染力。此外，基于目前的监测数据69-70del还常与位于S蛋白的N501Y、N439K以及Y453F突变同时出现。已有研究证明，利用假病毒模拟B.1.1.7变异株S蛋白的氨基酸突变，69-70del的B.1.1.7病毒变异株对细胞的感染力显著增强。研究显示，69-70del增强病毒感染力的机制可能是通过增加病毒粒子表面S蛋白密度来实现的。目前，对SARS-CoV-2变异株的检测方法主要有两种：一种是基因测序技术，包括Sanger测序和二代测序；另一种是基于逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)的核酸检测技术。尽管这两种技术在鉴别新发变异中发挥着至关重要的作用，但均依赖专业的仪器设备、实验室设施和检测人员，在基层医疗卫生机构、偏远地区以及南非、印度等发展中国家及地区难以实现快速现场检测。为提升基层一线和欠发达地区的变异株检测能力，推动检测技术的前移下移，迫切需要开发一种快速、便捷、灵敏、特异的新冠病毒变异位点检测方法。
2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)、特异性达到单碱基的核酸检测技术—基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK(Specific HighSensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)，利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白(LwCas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。研究表明，Cas13a可用于生物样本(血液或尿液)中寨卡以及登革热病毒的鉴定，并进一步区分非洲毒株和美洲毒株的基因序列，还可用于鉴定细菌的特定类型。而其在鉴定病毒或细菌核酸之后，通过设计特异的crRNA可以直接用于病原体的分型，其超高的灵敏度避免了大量复杂的上游实验工作，即可直接扩增生物样本进行检测，缩短了样品的前处理过程。由此可见，该技术在基础研究、诊断和治疗领域的巨大应用前景。
发明内容
本发明基于RT-RAA的检测技术具有操作简单、系统稳定且已广泛应用于临床分子诊断领域的技术优势，将RT-RAA技术与基于Cas13a蛋白的CRISPR结合，通过设计、构建、筛选，最终提供一段能靶向SARS-CoV-2 69-70del位点，并激活CRISPR-Cas13a系统的crRNA，利用该靶点构建的RT-RAA-CRISPR系统能够特异性地检测SARS-CoV-269-70del位点。
为实现上述目的，本发明以CRISPR-Cas13a系统的原理及靶序列的选择原则为基础，根据SARS-CoV-2 69-70del位点和相应野生型SARS-CoV-2 69-70位点分别设计的4条crRNA，优选出对CRISPR-Cas13a系统激活效果最好的crRNA进行SARS-CoV-269-70del位点的检测。
本发明的第一个目的是提供一种用于检测SARS-CoV-2 69-70del位点的系统。
本发明提供的用于检测SARS-CoV-2 69-70del位点的系统可包括a1)或a2)：
a1)RT-RAA引物对、Cas13a蛋白和crRNA；
a2)所述RT-RAA引物对和复合体；所述复合体由Cas13a蛋白和所述crRNA形成；
所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向SARS-CoV-2 69-70del位点靶点序列的向导序列；
所述SARS-CoV-2 69-70位点野生型的靶点序列位于SARS-CoV-2基因组(GenBankID：NC_0455512.2)第21753-21780位；所述SARS-CoV-2 69-70del位点的靶点序列位于SARS-CoV-2基因组(GenBank ID：NC_0455512.2)第21753-21786位，并缺失tacatg 6个碱基；
所述RT-RAA引物对由SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:8所示的单链DNA分子组成，用于特异性扩增SARS-CoV-2 69-70del位点的靶点序列。
上述CRISPR-Cas13a系统中，所述SARS-CoV-2 69-70del位点的靶点序列如SEQ IDNO:1所示。所述SARS-CoV-2 69-70位点野生型的靶点序列如SEQ ID NO:2所示。
上述CRISPR-Cas13a系统中，所述SARS-CoV-2 69-70del位点的crRNA序列如SEQID NO:3所示。所述SARS-CoV-2 69-70位点野生型的crRNA序列如SEQ ID NO:4所示。其中，SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的第1-38位均为用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列；第39-66位均为靶向SARS-CoV-2 69-70del靶点序列的向导序列。
上述CRISPR-Cas13a系统中，所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。
本发明的第二个目的是提供一种用于检测SARS-CoV-2 69-70del位点的试剂盒。
本发明提供的用于检测SARS-CoV-2 69-70del位点的试剂盒包括上述用于检测SARS-CoV-2 69-70del位点的系统。
进一步的，所述试剂盒还包括用于特异性扩增SARS-CoV-2 69-70del位点靶点序列的其他试剂和用于检测扩增产物的其他试剂。所述用于特异性扩增SARS-CoV-269-70del位点靶点序列的其他试剂包括缓冲液和/或ddH2O；所述用于检测扩增产物的其他试剂包括如下试剂中的全部或部分：NTP(如NTP Mix)、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、报告RNA(RNAseAlert v2，报告RNA是具有信号报告功能的RNA分子)、RNase-free water。
所述试剂盒还可包括记载有如下判定标准甲或判定标准乙的载体：
所述判定标准甲：对于SARS-CoV-2 69-70del位点检测，若在同一检测时间内，待测样本的突变检测体系的荧光强度值比野生检测体系以及阴性对照(ddH2O)荧光强度值高3倍以上(包括待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍的情况)，则待测样本含有或候选含有SARS-CoV-2 69-70del位点序列，否则待测样本不含有或候选不含有SARS-CoV-2 69-70del位点序列；对于SARS-CoV-2 69-70野生位点的检测，若在同一检测时间内，待测样本的野生检测体系的荧光强度值比突变检测体系以及阴性对照(ddH2O)荧光强度值高3倍以上(包括待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍的情况)，则待测样本含有或候选含有野生型SARS-CoV-2 69-70位点序列，否则待测样本不含有或候选不含有野生型SARS-CoV-2 69-70位点序列。
所述判定标准乙：若待测样本突变检测体系的荧光强度值大于或等于0.5a.u.，则待测样本含有或候选含有SARS-CoV-2 69-70del位点序列，否则待测样本不含有或候选不含有SARS-CoV-2 69-70del位点序列；若待测样本野生检测体系的荧光强度值大于或等于0.5a.u.，则待测样本含有或候选含有野生型SARS-CoV-2 69-70位点序列，否则待测样本不含有或候选不含有野生型SARS-CoV-2 69-70位点序列。
本发明的第三个目的是保护RT-RAA引物对，其由SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:8所示的单链DNA分子组成；所述RT-RAA引物对用于特异性扩增SARS-CoV-269-70del位点的靶点序列。
本发明的第四个目的是提供如下任一应用：
B1)上述任一所述的系统、所述试剂盒或所述RT-RAA引物对在检测或辅助检测SARS-CoV-2 69-70del位点中的应用；
B2)上述任一所述的系统、所述试剂盒或所述RT-RAA引物对在制备检测或辅助检测SARS-CoV-2 69-70del位点的产品中的应用；
B3)上述任一所述的系统、所述试剂盒或所述RT-RAA引物对在检测或辅助检测待测样本中是否含有SARS-CoV-2 69-70del位点中的应用；
B4)上述任一所述的系统、所述试剂盒或所述RT-RAA引物对在制备检测或辅助检测待测样本中是否含有SARS-CoV-2 69-70del位点的产品中的应用；
B5)上述任一所述的系统、所述试剂盒或所述RT-RAA引物对在筛选或辅助筛选SARS-CoV-2 69-70del位点防治药物中的应用；
B6)上述任一所述的系统、所述试剂盒或所述RT-RAA引物对在制备筛选或辅助筛选SARS-CoV-2 69-70del位点防治药物的产品中的应用；
B7)所述RT-RAA引物对在制备权利要求5所述试剂盒中的应用。
本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测SARS-CoV-2 69-70del位点的方法。
本发明提供的检测或辅助检测SARS-CoV-2 69-70del位点的方法包括如下步骤：
C1)以待测样本的核酸为模板，采用由SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ IDNO:8所示的单链DNA分子组成的引物对进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物；
C2)制备检测体系，之后进行荧光检测；所述检测体系包括所述RT-RAA扩增产物、上述任一所述的Cas13a蛋白、上述任一所述的crRNA、报告RNA、NTP、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂；同时以水替代所述RT-RAA扩增产物作为阴性对照；
C3)检测所述检测体系的荧光强度，根据荧光强度的大小判定所述待测样本中是否含有SARS-CoV-2 69-70del位点：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍以上，则待测样本含有或候选含有SARS-CoV-269-70del位点，否则待测样本不含有或候选不含有SARS-CoV-2 69-70del位点。或在实际应用中，也可按照如下方法进行判定：若待测样本检测体系的荧光强度值大于或等于0.5a.u.(阴性对照荧光强度能达到的最高值的3倍)，则待测样本含有或候选含有SARS-CoV-2 69-70del位点，否则待测样本不含有或候选不含有SARS-CoV-269-70del位点。
进一步的，所述步骤C1)中，RT-RAA扩增的反应条件为：40-44℃(如40-42℃、42-44℃、40℃、42℃或44℃)20-40min(如20-30min、30-40min、20min、30min或40min)。
进一步的，所述步骤C3)中，所述反应的条件为：35-39℃，每1-3min读取一次荧光强度值，读取20次以上。
进一步的，步骤C3)中，所述反应的条件为：37℃，每2min读取一次荧光强度值，读取20-40次。
上述任一所述待测样本可为血液样本、尿液、器官(如肝、脾、肾等)组织样本、细胞等。
本发明所提供的检测或辅助检测SARS-CoV-2 69-70del位点的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在细胞水平筛选SARS-CoV-2 69-70del位点防治药物时检测用药前后细胞内是否含有SARS-CoV-2 69-70del位点。
上述任一所述系统或试剂盒或RT-RAA引物对或应用或方法中，所述SARS-CoV-269-70del位点可为各种SARS-CoV-2变异株的69-70del位点，如Alpha、Bate和Omicron等变异株的69-70del位点。在本发明的具体实施例中，所述SARS-CoV-269-70del位点为SARS-CoV-2标准野生株(GenBank ID：NC_0455512.2)所构建的HV69-70del位点基因。
本发明基于CRISPR-Cas13a核酸检测技术，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于SARS-CoV-2 69-70del位点检测的RT-RAA扩增引物对、待检测靶点序列及能靶向该靶点序列的特异性crRNA，该crRNA可通过激活Cas13a实现对SARS-CoV-269-70del位点核酸的高灵敏、高特异检测，灵敏度达到单拷贝(1copy/test)。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳筛选候选12对RT-RAA引物结果图。
图2为CRISPR荧光法筛选候选3对RT-RAA引物结果图(荧光图)。
图3为4条SARS-CoV-2 69-70del位点crRNA的筛选结果(30min)。
图4为4条SARS-CoV-2 69-70野生型crRNA的筛选结果(30min)。
图5为含有SARS-CoV-2Mut6970-crRNA-1的CRISPR-Cas13a检测灵敏度结果(荧光图)。
图6为含有SARS-CoV-2Mut6970-crRNA-1的CRISPR-Cas13a检测灵敏度结果(30min)。
图7为含有SARS-CoV-2Wt6970-crRNA-2的CRISPR-Cas13a检测灵敏度结果(荧光图)。
图8为含有SARS-CoV-2Wt6970-crRNA-2的CRISPR-Cas13a检测灵敏度结果(30min)。
图9为针对SARS-CoV-2 69-70del位点的CRISPR-Cas13a在检测其他ARS-CoV-2变异位点及其他病原时未出现交叉反应。
图10为针对SARS-CoV-2 69-70del野生位点的CRISPR-Cas13a在检测其他ARS-CoV-2变异位点及其他病原时未出现交叉反应。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中涉及的试剂及其来源如下：NTP mix(Solarbio)，EDTA、1M TrispH8.0，报告RNA试剂盒(RNAse Alert v2)，琼脂糖凝胶电泳DNA纯化回收试剂盒(天根生化)，RNA合成试剂盒(T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit)，RNA酶抑制剂(MurineRNase inhibitor)，T7 RNA聚合酶(NEB)，RNA纯化磁珠(Agencourt RNAClean XP，BeckmanCoulter)，ExTaq Mix(TaKaRa)，二硫苏糖醇(DTT，北京欣经科生物技术有限公司)，氨苄西林钠(华北制药股份有限公司)，酵母提取物、胰蛋白胨(OXOID)，Tris平衡酚(灏样生物，TBD0001HY)。
下述实施例中涉及的LwCas13a蛋白，其表达、纯化及活性鉴定参见发明名称为“一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用”，公开号为CN108715849A的专利文件中的方法。具体步骤如下：
(1)LwCas13a蛋白诱导表达、纯化及鉴定
LwCas13a表达质粒Addgene-PC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a自Addgene平台获取，将LwCas13a表达质粒转入Rosetta(DE3)感受态细胞中，TB液体培养基37℃、200rpm培养14h以上，1:100接入新的Amp+抗性TB培养基中，37℃、300rpm培养至OD600＝0.6左右，加入IPTG使终浓度为500uM，18℃、200rpm培养16h。离心收集菌体经超声破碎后收集蛋白上清，并利用LwCas13a蛋白所带的His标签通过Ni柱(HisTrap HP column，GE HealthcareLife Science)进行初步纯化，利用SUMO将所带标签部分进行酶切，再利用LwCas13a蛋白的等电点特性通过阳离子交换柱(UniGel-50SP，Nano-Micro Tech)进行第二次纯化，实验过程中利用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定每一步得到的蛋白，进行蛋白大小分析，同时利用His标签抗体进行蛋白的初步鉴定，以确定诱导的蛋白为目的蛋白。
(2)LwCas13a蛋白浓度及活性鉴定
使用蛋白活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测LwCas13a蛋白浓度，利用报告RNA试剂盒(invitrgen)，检测490nm激发、520nm波长下的发射光的荧光值，判断体系中的Cas13a蛋白是否被激活。即在靶点RNA、与靶点对应的crRNA的存在下，Cas13a蛋白是否能被激活并剪切体系中的报告RNA，使其发出荧光，同时设置非特异性靶点进行特异性检测，以及人细胞总RNA作为背景RNA，检测体系是否会受到背景RNA的干扰。检测结果发现，本发明纯化得到纯度较高的LwCas13a蛋白，并且无RNase的污染，该蛋白与crRNA结合形成的复合体，可被特异的靶序列激活，并剪切体系中的报告RNA，从而发出荧光信号，该蛋白可用于后续的检测实验。同时，在蛋白终浓度为45nM时即可检测到明显的荧光信号变化。
实施例1、用于本发明的crRNA和PCR引物的设计和制备
1、用于本发明的crRNA设计和制备
(1)引物序列的合成
本发明分别在SARS-CoV-2 69-70del位点与野生位点设计crRNA。crRNA的5’端带有39nt的重复序列，该段序列可与LwCas13a蛋白结合，5’-GGGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAAC-3’，设计作为模板的单链DNA序列为重复序列+靶序列,T7序列(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)+部分重复序列(5’-GATTTAGACTACCCCAA-3’)为上游引物，取靶序列下游20bp左右的反向互补序列作为下游引物(表1)。合成表1中的各条序列。
表1.用于制备突变检测用的crRNA的模板序列及PCR扩增引物序列
(2)PCR扩增
由北京天一辉远公司分别合成表1所示的序列。根据文献中的研究方法，经DNA的合成、退火、转录、纯化步骤，合成相应的crRNA(J.T.Huang,et al.Clinical chemistry61,290-296(2015).)。
将上述序列用ddH2O稀释成10μM。配制PCR反应体系如下：上游引物为T7-crRNA-F，模板分别为Wt6970/Mut6970-crRNA1，2，3，4，对应下游引物分别为Wt6970/Mut6970-crRNA1，2，3，4-R。
表2.用于制备crRNA的模板序列的PCR扩增体系
| 名称 | 体积 |
| 模板(XX-crRNA) | 2μL |
| 上游引物：T7-crRNA-F | 2μL |
| 下游引物：XX-crRNA-R(与crRNA对应) | 2μL |
| 2×Ex Taq Mix | 25μL |
| ddH2O | 19μL |
| 总体积 | 50μL |
XX-crRNA分别代表模板Mut6970-crRNA1、Mut6970-crRNA2、Mut6970-crRNA3、Mut6970-crRNA4、Wt6970-crRNA1、Wt6970-crRNA2、Wt6970-crRNA3、Wt6970-crRNA4。
将PCR反应体系进行PCR扩增，得到PCR产物。
PCR反应条件：95℃5min热变性；95℃30s，55℃30s，72℃15s，共38个循环；72℃自动延伸10min；4℃保存PCR产物。
(3)PCR产物纯化
使用Tris平衡酚对步骤2获得的PCR产物进行纯化，具体步骤如下：Tris平衡酚(灏样生物)取500μL，加入等体积的三氯甲烷，振荡混匀后短暂离心，弃上清；取150μL酚氯仿混合液加入PCR产物中，混匀后12,000rpm离心1min；取上清液到一个新的1.5mL离心管，加入无水乙醇使上清与乙醇比例为3:7，12,000rpm离心10min，弃上清；加入200μL 75％的乙醇，12,000rpm离心10min，弃上清(该步骤共进行三次)。得到的沉淀室温晾干(约10min)，加入50μL无RNA酶的水，Nanodrop检测浓度，-20℃保存。
(4)转录
取1μg步骤3获得的纯化PCR产物，使用T7转录试剂盒(NEB)转录crRNA。
(4-1)首先制备crRNA转录体系。crRNA转录体系如表3所示。
表3.crRNA转录体系
| 名称 | 体积 |
| NTP Mix | 10μL 6.7mM each NTP final |
| 纯化PCR产物 | X*μL(含1μg) |
| T7 RNA聚合酶 | 2μL |
| 无Nuclease水 | XμL |
| 总体积 | 20μL |
注：*X为纯化PCR产物(DNA模板)体积。
(4-2)上述crRNA转录体系混匀后，37℃转录过夜，得到转录产物，即crRNA。
(5)crRNA纯化
按照Agencourt RNA Clean XP说明书(Beckman Coulter)纯化步骤(4)转录获得的crRNA，具体步骤如下：磁珠振荡混匀，向转录产物中加入1.8倍体积的磁珠，吹打10次或涡旋30s以混匀磁珠和转录体系，室温静置5min。将反应体系放到磁力架，静置5-10min以分离磁珠。轻轻吸出体系中的液体，避免磁珠被吸出，向磁珠中加入200μL 70％的乙醇(无RNase水配制)，室温孵育30s，吸出乙醇；重复此过程清洗磁珠，共3次。室温晾干体系，去除体系中的乙醇，约10min。加入50μLRNase-free水，涡旋30s或用移液器吹打10次，吸出上清液，放入无RNase的1.5mL离心管中，Nanodrop测定纯化得到的crRNA浓度，-80℃分装备用。
共制备出8种crRNA：Mut6970-crRNA1、Mut6970-crRNA2、Mut6970-crRNA3、Mut6970-crRNA4、Wt6970-crRNA1、Wt6970-crRNA2、Wt6970-crRNA3、Wt6970-crRNA4，用于下面的CRISPR-Cas13a检测SARS-CoV-2 69-70del。将SARS-CoV-2 69-70del位点与野生位点检测的靶点序列转录得到相应的ssRNA，用所述crRNA进行检测，比较不同crRNA的信号强弱，选择荧光信号最强的crRNA作为后续的检测crRNA。
2、RT-RAA扩增引物的设计
设计并合成RT-RAA扩增SARS-CoV-2 69-70del检测靶点序列的引物，在所述引物的5’端具有一段T7转录序列，使得RT-RAA扩增得到的双链DNA(dsDNA)可以被T7 RNA聚合酶识别并且进行转录(见表4)。DNA序列由北京天一辉远公司合成。
表4.用于检测SARS-CoV-2 69-70del位点的RT-RAA扩增引物
| 名称 | 核苷酸序列(5’-3’) |
| 6970-RAA-F1 | aattctaatacgactcactataggggatcctcagttttacattcaactcaggact(SEQ ID NO:7) |
| 6970-RAA-F2 | aattctaatacgactcactatagggcctcagttttacattcaactcaggacttgt |
| 6970-RAA-F3 | aattctaatacgactcactatagggttacattcaactcaggacttgttcttacct |
| 6970-RAA-F4 | aattctaatacgactcactatagggaggacttgttcttacctttcttttccaatg |
| 6970-RAA-R1 | catcattaaatggtaggacagggttatcaa(SEQ ID NO:8) |
| 6970-RAA-R2 | aacaccatcattaaatggtaggacagggtt |
| 6970-RAA-R3 | acaccatcattaaatggtaggacagggtta |
| 6970-RAA-R4 | accatcattaaatggtaggacagggttatc |
3、模板标准品的制备
(1)质粒序列
Plasmid-69-70del是将如下来自SARS-CoV-2 69-70del位点基因组的序列：TTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGT(SEQ ID NO:5)插入至pSMART-LC载体(北京天一辉远公司)中得到的质粒。Plasmid-69-70del由北京天一辉远公司提供。
Plasmid-69-70Wt是将如下来自SARS-CoV-2 69-70野生位点基因组的序列：TGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAAT(SEQ ID NO:6)插入至pSMART-LC载体中得到的质粒。Plasmid-69-70Wt由北京天一辉远公司提供)。
(2)质粒小提(全式金)
取甘油菌(1：500)加入Kan+LB(取10μL甘油菌+5ml LB)中，37℃、200rpm过夜接菌，取过夜培养的菌液，10000g离心1min，去上清(尽量吸尽)。如菌液量过大，可分多次离心收集。加入无色溶液RB(含RNase A)250μL，震荡悬浮细菌沉淀，不应留有小的菌块。加入蓝色溶液LB 250μL，温和的上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成蓝色透亮的溶液，颜色由半透亮变为透亮蓝色，指示完全裂解(不宜超过5min)。加入黄色溶液NB 350μL，轻轻混合5-6次(颜色由蓝色完全变成黄色，指示混合均匀，中和完全)，直至形成紧实的黄色凝集块，室温静置2min。12000g离心5min，小心吸取上清加入离心柱中。12000g离心1min，弃流出液。如上清体积大于800μL，可以分成多次加入柱中，并同上离心，弃流出液。加入650μL溶液WB，12000g离心1min，弃流出液。12000g离心1-2min，彻底去除残留的WB。将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μL EB或去离子水(PH>7.0)室温静置1min。10000g离心1min，洗脱DNA，测浓度，于-20℃保存。
(3)ssRNA模板制备
将获得的质粒作为模板，制备RNA模板，按实施例1中步骤1中的(2)-(5)进行模板PCR扩增、PCR产物纯化、转录、模板RNA纯化。
将纯化后的RNA计算浓度，计算公式如下：copies/μL＝6.02×1023×(浓度ng/μL)×10-9/RNA长度×340。
取10μL转录得到的RNA到相应体积无酶水中，得到浓度为1×1013copies/μL RNA模板标准品。
Plasmid-69-70del获得的模板为突变RNA模板。
Plasmid-69-70Wt获得的模板为野生型RNA模板。
实施例2、RT-RAA-CRISPR检测SARS-CoV-2 69-70del位点方法的建立
本研究利用RT-RAA技术对目标核酸进行扩增，将SARS-CoV-2 69-70del检测的靶点序列转录得到相应的ssRNA，用上文的的crRNA：Mut6970-crRNA1、Mut6970-crRNA2、Mut6970-crRNA3、Mut6970-crRNA4、Wt6970-crRNA1、Wt6970-crRNA2、Wt6970-crRNA3、Wt6970-crRNA4进行检测，比较不同crRNA的信号强弱，选择荧光信号较强且灵敏度高的crRNA作为后续的检测crRNA。具体步骤和原理如下：第一步利用特异性的引物扩增靶点序列(经变性、退火、延伸过程)，在所述引物的5’端具有一段T7转录序列，使得PCR扩增得到的双链DNA(dsDNA)可以被T7 RNA聚合酶识别并且进行转录。第二步，取出部分扩增产物加入T7 RNA聚合酶、LwCas13a蛋白、可以识别靶序列的crRNA和报告RNA进行靶序列的检测(37℃进行)。荧光定量PCR仪，FAM通道检测：37℃15s，37℃，1min45s(收集荧光)，共30个循环。
具体步骤如下：
1、检测SARS-CoV-2 69-70del位点模板的RT-RAA扩增
分别将突变RNA模板和野生型RNA模板进行梯度稀释后，每个模板取2μL，利用实施例1中的步骤2合成的进行引物进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物。RT-RAA扩增体系如表5所示。
表5.RT-RAA扩增体系
| 名称 | 体积 |
| 模板 | 20μL |
| RT-RAA-F(10μM) | 2μL |
| RT-RAA-R(10μM) | 2μL |
| A Buffer(RT-RAA扩增试剂盒中的组件) | 23.5μL |
| 总体积 | 47.5μL |
将混合好的47.5μL溶液加入到装有冻干粉的基础反应单元中，使冻干粉充分重溶均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μL乙酸镁溶液(B Buffer)，合上管盖瞬离收集并混合均匀。将上述反应管放置在42℃条件下反应30分钟。配置1.5％琼脂糖凝胶，电压U＝150V，电流I＝150mA，时间T＝30min，电泳检测，观察电泳条带。
结果如图1所示：相比于其他交叉组合的引物对来说，6970-RAA-F1&R1/F1&R3/F4&R4具有较高的扩增效率，其具有明显的条带。
之后对其进行CRISPR荧光筛选，结果如图2所示，6970-RAA-F1&R1引物所对应的荧光值更高，起峰更早，故之后的实验利用F1&R1作为后续RT-RAA检测引物。
2、LwCas13a检测SARS-CoV-2 69-70del位点模板RNA的RT-RAA扩增产物
为了准确控制反应温度，防止酶标版由于密封性导致的污染，使用荧光定量PCR仪进行后续检测。将上一步扩增得到的RT-RAA产物取5μL进行检测，体系如下表。
表6.RT-RAA-CRISPR检测体系
将体系放入荧光定量PCR仪，FAM通道检测荧光信号变化，设置通道激发光波长490nm，发射光波长520nm，37℃反应15s，37℃反应1min 45s(收集荧光)，共20-40个循环，读取40次共计80分钟，检测体系中荧光强度变化。
结果判定：在同一检测时间内，实验组荧光强度值比阴性对照(ddH2O)荧光强度值高3倍以上即判定为阳性结果，或任何时候荧光强度大于或等于0.5a.u.即可判定为阳性结果。
实施例3、SARS-CoV-2 69-70del与野生crRNA的特异性与灵敏度检测
1、SARS-CoV-2 69-70del最优crRNA筛选
为筛选到检测灵敏度更高、检测时间更短的crRNA，利用前文所述构建的野生型、69-70del突变型ssRNA和设计的引物6970-RAA-F1和6970-RAA-R1，进行RT-RAA扩增。并用4种Mut6970-crRNA分别检测2个序列的ssRNA。
(1)crRNA引物序列的合成
合成实施例1表1中的各条序列，并按实施例1中步骤1方法合成并制备crRNA。
(2)将实施例1中步骤3的获得的突变RNA模板和野生型RNA模板分别进行梯度稀释，得到含有不同浓度69-70del基因片段与不同浓度69-70野生基因片段的RNA溶液：105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL、10-1copies/μL。
(3)按照实施例2步骤1中的方法进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物。
(4)完成步骤(3)后，取5μL RT-RAA扩增产物按照实施例2步骤2中的方法利用不同crRNA检测SARS-CoV-2 69-70del位点与野生型核酸，同时设置ddH2O为模板的扩增产物作为阴性对照。
检测结果显示，在用同一浓度的69-70del RNA与野生型RNA作为检测模板时Mut6970-crRNA1在30min检测的荧光值较其他3条crRNA检测的荧光值要高(图3)，因此，将Mut6970-crRNA1作为SARS-CoV-2 69-70del位点检测的首选crRNA。
2、SARS-CoV-2 69-70野生型最优crRNA筛选
为筛选到检测灵敏度更高、检测时间更短的crRNA，利用前文所述构建的野生型、69-70del突变型ssRNA和设计的引物6970-RAA-F1和6970-RAA-R1，进行RT-RAA扩增。并用4种Wt6970-crRNA分别检测2个序列的ssRNA。
(1)crRNA引物序列的合成
合成实施例1表1中的各条序列，并按实施例1中步骤1方法合成并制备crRNA。
(2)将实施例1中步骤3的获得的突变RNA模板和野生型RNA模板分别进行梯度稀释，得到含有不同浓度69-70del基因片段与不同浓度69-70野生基因片段的RNA溶液：105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL、10-1copies/μL。
(3)按照实施例2中步骤1的方法进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物。
(4)完成步骤(3)后，取5μL RT-RAA扩增产物按照实施例2中步骤2的方法利用不同crRNA检测SARS-CoV-2 69-70del位点与野生型核酸，同时设置ddH2O为模板的扩增产物作为阴性对照。
检测结果显示，在用同一浓度的69-70del RNA与野生型RNA作为检测模板时Wt6970-crRNA2在30min检测的荧光值较其他3条crRNA检测的荧光值要高(图4)，因此，将Wt6970-crRNA2作为SARS-CoV-2 69-70野生型位点检测的首选crRNA。
实施例4、本发明方法的灵敏度检测
将实施例1中步骤3的获得的突变RNA模板和野生型RNA模板分别进行梯度稀释，得到含有不同浓度69-70del基因片段与不同浓度69-70野生基因片段的RNA溶液，并分别用Mut6970-crRNA1与Wt6970-crRNA2进行检测，以检测本发明方法的灵敏度。
具体步骤如下：
1、将实施例1中步骤3获得的突变RNA模板和野生型RNA模板分别进行梯度稀释，得到含有不同浓度SARS-CoV-2 69-70del位点基因片段与不同浓度69-70野生基因片段的ssRNA标准品溶液，浓度依次为105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL、100copies/μL、10-1copies/μL。
2、按照实施例2中步骤1的方法进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物。
3、完成步骤2后，取5μL RT-RAA扩增产物按照实施例2中步骤2的方法基于RT-RAA-CRISPR/Cas13a系统检测SARS-CoV-2 69-70del位点与野生型位点核酸，同时设置ddH2O为模板的扩增产物作为阴性对照。
RT-RAA-CRISPR检测结果显示，利用Mut6970-crRNA1检测SARS-CoV-2 69-70野生型模板时具有良好的特异性，均未检测到荧光信号，而利用Mut6970-crRNA1检测69-70del模板时，虽然荧光信号在104-100copies/μL浓度下不断降低，但其均与野生型模板检测具有显著性差异，因此利用Mut6970-crRNA1可以特异性的检测SARS-CoV-2 69-70del位点，灵敏度达到单拷贝(1copy/μL)(图6和图7)。另外图8和图9的RT-RAA-CRISPR检测结果显示，利用Wt6970-crRNA2检测SARS-CoV-269-70del模板时具有良好的特异性，均未检测到荧光信号，而利用Wt6970-crRNA2检测SARS-CoV-2 69-70野生型模板时，其在104-100copies/μL浓度下均与69-70del模板检测具有显著性差异，因此利用Wt6970-crRNA2可以特异性的检测SARS-CoV-269-70野生型位点，灵敏度也达到1copy/μL。
实施例5、本发明方法的特异性检测
1、SARS-CoV-2 69-70del位点的CRISPR-Cas13a在检测其他SARS-CoV-2变异位点及其他病原体核酸时的特异性
分别以SARS-CoV-2 69-70位点野生株(即野生株S基因区样本)、SARS-CoV-269-70del位点(含有SARS-CoV-2HY69-70del位点样本)、SARS-CoV-2突变样本1(包含144del、243del、3675del位点的样本)、SARS-CoV-2突变样本2(包含K417T、E484K、T478K、D614G、P681R位点的样本)、SARS-CoV-2突变样本3(包含K417N、E484Q、N501Y、P681H位点的样本)、H1N1甲型流感病毒(H1N1)、SARS病毒(SARS)、MERS病毒(MERS)、贝纳氏柯克斯氏体(Cb)、埃博拉病毒(EBOV)、HBV病毒(HBV)和H7N9流感病毒(H7N9)病原核酸作为检测模板，按照实施例2的方法检测，以验证本发明方法的特异性。具体步骤如下：
(1)分别以SARS-CoV-2 69-70位点野生株、SARS-CoV-2 69-70del位点、SARS-CoV-2突变样本1、SARS-CoV-2突变样本2、SARS-CoV-2突变样本3、H1N1甲型流感病毒(H1N1)、SARS病毒(SARS)、MERS病毒(MERS)、贝纳氏柯克斯氏体(Cb)、埃博拉病毒(EBOV)、HBV病毒(HBV)、H7N9流感病毒(H7N9)病原核酸作为检测模板，按照实施例2中步骤1的方法进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物。
(2)完成步骤(1)后，取5μLRT-RAA扩增产物按照实施例2中步骤2的方法基于CRISPR-Cas13a系统检测各病毒核酸，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。
结果显示，含有SARS-CoV-2 69-70del位点基因的实验组的荧光信号在反应开始后开始升高，而阴性对照组(ddH2O)以及其核酸的实验组中的荧光强度不随时间推移而升高，含有SARS-CoV-2 69-70del基因的实验组荧光强度要显著高于阴性对照以及其他其他SARS-CoV-2突变位点核酸的实验组(图9)。说明本发明的基于CRISPR-Cas13a系统检测SARS-CoV-2 69-70del位点的方法具有很高的特异性，检测过程中不存在交叉反应。
2、SARS-CoV-2 69-70del位点的CRISPR-Cas13a在检测其他SARS-CoV-2变异位点和其他病原体核酸时的特异性
分别以SARS-CoV-2 69-70位点野生株、SARS-CoV-2 69-70del位点、SARS-CoV-2突变样本1、SARS-CoV-2突变样本2、SARS-CoV-2突变样本3、H1N1甲型流感病毒(H1N1)、SARS病毒(SARS)、MERS病毒(MERS)、贝纳氏柯克斯氏体(Cb)、埃博拉病毒(EBOV)、HBV病毒(HBV)、H7N9流感病毒(H7N9)病原核酸作为检测模板，按照实施例2中的方法检测不同病毒核酸，以验证本发明方法的特异性。具体步骤如下：
(1)分别SARS-CoV-2 69-70位点野生株、SARS-CoV-2 69-70del位点、SARS-CoV-2突变样本1、SARS-CoV-2突变样本2、SARS-CoV-2突变样本3、H1N1甲型流感病毒(H1N1)、SARS病毒(SARS)、MERS病毒(MERS)、贝纳氏柯克斯氏体(Cb)、埃博拉病毒(EBOV)、HBV病毒(HBV)、H7N9流感病毒(H7N9)病原核酸作为检测模板，按照实施例2中步骤1的方法进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物。
(2)完成步骤(1)后，取5μL RT-RAA扩增产物按照实施例2中步骤2的方法基于CRISPR-Cas13a系统检测各病毒核酸，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。
CRISPR-Cas13a检测结果显示，含有SARS-CoV-2 69-70del野生位点实验组的荧光信号在反应开始后开始升高，而阴性对照组(ddH2O)以及其他实验组中的荧光强度不随时间推移而升高，含有SARS-CoV-2 69-70del野生位点的实验组荧光强度要显著高于阴性对照以及其他病毒组(图10)。说明本发明的基于CRISPR-Cas13a系统检测SARS-CoV-2 69-70del野生位点的方法具有很高的特异性，检测过程中不存在交叉反应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种基于RAA-CRISPR检测SARS-CoV-2 69-70del位点的方法
<160>8
<170> PatentIn version 3.5
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>1
ggttccatgc tatctctggg accaatgg 28
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial sequence
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ttccatgcta tacatgtctc tgggacca 28
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<211>66
<212>DNA
<213>Artificial sequence
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gggatttaga ctaccccaaa aacgaagggg actaaaaccc attggtccca gagatagcat 60
ggaacc 66
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<212>DNA
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gggatttaga ctaccccaaa aacgaagggg actaaaactg gtcccagaga catgtatagc 60
atggaa 66
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<212>DNA
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ttttattgcc actagtctct agtcagtgtg ttaatcttac aaccagaact caattacccc 60
ctgcatacac taattctttc acacgtggtg tttattaccc tgacaaagtt ttcagatcct 120
cagttttaca ttcaactcag gacttgttct tacctttctt ttccaatgtt acttggttcc 180
atgctatctc tgggaccaat ggtactaaga ggtttgataa ccctgtccta ccatttaatg 240
atggtgttta ttttgcttcc actgagaagt ctaacataat aagaggctgg atttttggta 300
ctactttaga ttcgaagacc cagtccctac ttattgttaa taacgctact aatgttgt 358
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agttttacat tcaactcagg acttgttctt acctttcttt tccaatgtta cttggttcca 120
tgctatacat gtctctggga ccaatggtac taagaggttt gataaccctg tcctaccatt 180
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tgttattaaa gtctgtgaat ttcaattttg taat 334
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aattctaata cgactcacta taggggatcc tcagttttac attcaactca ggact 55
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<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>8
catcattaaa tggtaggaca gggttatcaa 30
Claims (9)
1.一种用于检测SARS-CoV-2 69-70del位点的系统，包括a1）或a2）：
a1）RT-RAA引物对、Cas13a蛋白和crRNA；
a2）RT-RAA引物对和复合体；所述复合体由Cas13a蛋白和所述crRNA形成；
所述crRNA包括用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向SARS-CoV-2 69-70del位点靶点序列的向导序列；
所述SARS-CoV-2 69-70位点野生型的靶点序列位于SARS-CoV-2基因组第21753-21780位；所述SARS-CoV-2 69-70del位点的靶点序列位于SARS-CoV-2基因组第21753-21786位，并缺失tacatg 6个碱基；
所述RT-RAA引物对由SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:8所示的单链DNA分子组成，用于特异性扩增SARS-CoV-2 69-70del位点的靶点序列；
所述SARS-CoV-2 69-70del位点的crRNA序列如SEQ ID NO:3所示；所述SARS-CoV-269-70位点野生型的crRNA序列如SEQ ID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述SARS-CoV-2 69-70del位点的靶点序列如SEQ ID NO:1所示；所述SARS-CoV-2 69-70位点野生型的靶点序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述Cas13a蛋白为LwCas13a蛋白。
4.一种用于检测SARS-CoV-2 69-70del位点的试剂盒，其包括权利要求1-3任一所述的用于检测SARS-CoV-2 69-70del位点的系统。
5.RT-RAA引物对，由SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:8所示的单链DNA分子组成；所述RT-RAA引物对用于特异性扩增SARS-CoV-2 69-70del位点的靶点序列。
6.如下任一应用：
B1）权利要求1-3任一所述的系统、权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述RT-RAA引物对在检测或辅助检测SARS-CoV-2 69-70del位点中的应用；
B2）权利要求1-3任一所述的系统、权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述RT-RAA引物对在制备检测或辅助检测SARS-CoV-2 69-70del位点的产品中的应用；
B3）权利要求1-3任一所述的系统、权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述RT-RAA引物对在检测或辅助检测待测样本中是否含有SARS-CoV-2 69-70del位点中的应用；
B4）权利要求1-3任一所述的系统、权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述RT-RAA引物对在制备检测或辅助检测待测样本中是否含有SARS-CoV-2 69-70del位点的产品中的应用；
B5）权利要求1-3任一所述的系统、权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述RT-RAA引物对在筛选或辅助筛选SARS-CoV-2 69-70del位点防治药物中的应用；
B6）权利要求1-3任一所述的系统、权利要求4所述的试剂盒或权利要求5所述RT-RAA引物对在制备筛选或辅助筛选SARS-CoV-2 69-70del位点防治药物的产品中的应用；
B7）权利要求5所述RT-RAA引物对在制备权利要求4所述试剂盒中的应用；
所述应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
7.一种检测或辅助检测SARS-CoV-2 69-70del位点的方法，包括如下步骤：
C1）以待测样本的核酸为模板，采用由SEQ ID NO:7所示的单链DNA分子和SEQ ID NO:8所示的单链DNA分子组成的引物对进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物；
C2）制备检测体系，之后进行荧光检测；所述检测体系包括所述RT-RAA扩增产物、权利要求1-3任一中所述的Cas13a蛋白、权利要求1-3任一中所述的crRNA、报告RNA、NTP、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂；同时以水替代所述RT-RAA扩增产物作为阴性对照；
C3）检测所述检测体系的荧光强度，根据荧光强度的大小判定所述待测样本中是否含有SARS-CoV-2 69-70del位点：对于SARS-CoV-2 69-70del位点检测，若在同一检测时间内，待测样本的突变检测体系的荧光强度值比野生检测体系以及阴性对照荧光强度值高3倍以上，则待测样本含有或候选含有SARS-CoV-2 69-70del位点序列，否则待测样本不含有或候选不含有SARS-CoV-2 69-70del位点序列；对于SARS-CoV-2 69-70野生位点的检测，若在同一检测时间内，待测样本的野生检测体系的荧光强度值比突变检测体系以及阴性对照荧光强度值高3倍以上，则待测样本含有或候选含有野生型SARS-CoV-2 69-70位点序列，否则待测样本不含有或候选不含有野生型SARS-CoV-2 69-70位点序列；
所述方法为非疾病诊断和治疗目的的方法。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤C1）中，RT-RAA扩增的反应条件为：40-44℃，20-40min。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤C3）中，反应的条件为：35-39℃，每1-3min读取一次荧光强度值，读取20次以上。
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