CN112941237B

CN112941237B - 一种用于特异性检测甲型h7n9禽流感病毒的crispr核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN112941237B
Application number: CN202110318708.1A
Authority: CN
Inventors: 李�浩; 孙岩松; 王彦贺; 董雪; 聂优
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2021-03-25
Filing date: 2021-03-25
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2041-03-25
Also published as: CN112941237A

Abstract

本发明公开了一种用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR核酸检测试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR‑Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；所述用于检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR‑Cas13a系统包括如下a1)‑a3)；a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白；所述crRNA的靶点序列为序列1；a2)报告RNA；a3)用于扩增待测样本靶点序列的RT‑RAA扩增引物，且所述RT‑RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7RNA聚合酶识别的区域。本发明试剂盒可实现对甲型H7N9禽流感病毒核酸的高灵敏、高特异、便捷检测，灵敏度达到1copy/reaction，特异性达到单碱基。

Description

一种用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR核酸检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子诊断技术领域，涉及一种用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR核酸检测试剂盒。

背景技术

甲型H7N9禽流感病毒可感染禽类和人类，一般在禽类中不致病，而感染人后导致人类发病，且具有死亡率高、预后差、无批准上市的特效药物及无疫苗预防等特点。

甲型流感病毒根据两种表面糖蛋白上抗原——血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA) 的不同进行命名。不同种类甲型流感病毒的致病性具有较大差异，其中H7N9病毒是一种高致病性病原体，而在相应序列中仅存在少量碱基差异的H2N9、H4N9、H5N9、H11N9 等病毒却不具有对人类的致病性。目前针对甲型H7N9禽流感病毒的检测技术包括血清学检测、荧光定量PCR、恒温扩增核酸检测技术等，均无法实现对少量碱基差异的辨别。

2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)，特异性达到单碱基的核酸检测技术——基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK (SpecificHigh Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)，利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白(LwCas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏、高特异的检测。

发明内容

本发明一个目的是提供一种用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的 CRISPR-Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；

所述用于检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR-Cas13a系统包括如下a1)-a3)；

a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体；

所述crRNA的靶点序列为序列1；

a2)报告RNA，所述报告RNA的两个末端分别标记生物素和与所述侧向流试纸的样品垫标记的抗体结合的基团；

a3)用于扩增待测样本靶点序列的RT-RAA扩增引物，且所述RT-RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7 RNA聚合酶识别的区域。

上述试剂盒中，所述crRNA的核苷酸序列为序列2。

上述试剂盒中，所述RT-RAA扩增引物由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成。

上述试剂盒中，所述侧向流试纸按样品流动方向依次包括含有纳米金标记抗体的样品垫、含有T线和C线的NC膜和吸水滤纸；在本发明的实施例中，纳米金标记抗体为纳米金标记兔源抗FITC抗体；

所述T线由链霉亲和素形成；

所述C线由所述纳米金标记抗体的二抗形成；所述所述纳米金标记抗体的二抗为羊抗兔IgG。

或，所述报告RNA由20个U组成，且所述报告RNA的两端分别标记生物素和与所述纳米金标记抗体结合的FAM基团。

更进一步的，所述CRISPR-Cas13a系统还包括用于特异性扩增甲型H7N9禽流感病毒靶点序列的其他试剂，所述用于特异性扩增甲型H7N9禽流感病毒靶点序列的其他试剂包括如下试剂中的全部或部分：NTP(如NTP Mix)、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、 MgCl2溶液、HEPES缓冲液、RNase free water。

上述试剂盒中，所述试剂盒还包括记载如下检测方法的可读载体：

所述检测方法包括如下步骤:

b1、提取待测样本的核酸，所述RT-RAA扩增所需引物对待测样品核酸进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物；

上述RT-RAA扩增的反应条件为：37-42℃反应15-40分钟；

b2、将所述RT-RAA扩增产物、所述crRNA、所述LwCas13a蛋白在含有所述报告 RNA的体系中反应，得到反应产物；

上述反应的条件为：37℃，15-30分钟。

b3、将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中，静置观察；

静置时间为液体滴在试纸上2-5分钟；

若试纸没有T线显现且有C线显现，则待测样本含有或候选含有甲型H7N9禽流感病毒或其核酸；若试纸有T线显现且有C线显现，则待测样本不含有或候选不含有甲型H7N9禽流感病毒或其核酸。

上述试剂盒中的用于检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR-Cas13a系统也是本发明保护的范围。

上述试剂盒或上述CRISPR-Cas13a系统或上述系统中的单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体在如下c1-c10任一中的应用也是本发明保护的范围：

c1)检测或辅助检测甲型H7N9禽流感病毒；

c2)制备检测或辅助检测甲型H7N9禽流感病毒产品；

c3)检测或辅助检测甲型H7N9禽流感病毒核酸；

c4)制备检测或辅助检测甲型H7N9禽流感病毒核酸产品；

c5)检测或辅助检测待测样本中是否含有甲型H7N9禽流感病毒；

c6)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有甲型H7N9禽流感病毒产品；

c7)检测或辅助检测待测样本中是否含有甲型H7N9禽流感病毒核酸；

c8)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有甲型H7N9禽流感病毒核酸产品；

c9)筛选或辅助筛选甲型H7N9禽流感病毒防治药物；

c10)制备筛选或辅助筛选甲型H7N9禽流感病毒防治药物产品。

本发明另一个目的是提供一种检测或辅助检测甲型H7N9禽流感病毒核酸的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

若试纸没有T线显现且有C线显现，则待测样本含有或候选含有甲型H7N9禽流感病毒核酸；若试纸有T线显现且有C线显现，则待测样本不含有或候选不含有甲型H7N9 禽流感病毒核酸。

上述待测样本可为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液，也可为血液样本、器官(如肝、脾、肾等)组织样本、细胞等。

本发明所提供的检测或辅助检测甲型H7N9禽流感病毒的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在细胞水平筛选甲型H7N9禽流感病毒防治药物时检测用药前后细胞内是否含有甲型H7N9禽流感病毒。

本发明基于CRISPR-Cas13a核酸检测技术，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于甲型H7N9禽流感病毒检测的靶点序列及能靶向该靶点序列的特异性crRNA，并提供一种基于消线法的侧向流试纸，该试纸可通过CRISPR-Cas13a系统实现对甲型 H7N9禽流感病毒核酸的高灵敏、高特异、便捷检测，灵敏度达到1copy/reaction，特异性达到单碱基。

附图说明

图1为不同RT-RAA引物组合进行扩增所得产物电泳图。

图2为高效RT-RAA引物组合与不同crRNA结合试纸检测结果。

图3为两种高效检测体系灵敏度测试。

图4为两种高效检测体系交叉反应测试。

图5为多种N9型甲型流感病毒序列比对分析。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中涉及的试剂及其来源如下：pUC57(北京华越洋，VECT90014)，NTPmix (NEB，N0466S)，琼脂糖凝胶电泳DNA纯化回收试剂盒(天根生化，DP219-03)，T7 转录试剂盒(T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit，NEB，E2050S)，RNA酶抑制剂(MurineRNase inhibitor，NEB，M0314L)，T7 RNA聚合酶(NEB，M0251S)，RNA 纯化磁珠(AgencourtRNAClean XP，Beckman Coulter，A63987)，ExTaq Mix(TaKaRa， RR001Q)，Tris平衡酚(灏样生物，TBD0001HY)，RT-RAA扩增试剂盒(杭州众测，S003ZC)， HEPES缓冲液(索莱宝，YZ-B-HEPES250)，MgCl₂溶液(天根生化，RP107)，兔源FITC 抗体(上海生工，D110003)，氯金酸(sigma，254169)，柠檬酸三钠(sigma，73933)，碳酸钾(sigma，367877)，链霉亲和素(索莱宝，S9170-10mg)，Proclin300(sigma， 48914-U)，NaCl(sigma，S9888)，Na₂HPO₄·12H₂O(sigma，1.06573)，NaH₂PO₄·2H₂O (sigma，71505)，羊抗兔IgG(赛默飞，N24916)，硝酸纤维素膜(Sartorius，CN140)，玻璃纤维(上海良信，CB08)，聚酯纤维(上海良信，DL42)，吸水纸(上海良信，CH37K)。

下述实施例中的核苷酸序列如下：

序列1为crRNA-1的靶点序列；

序列2为crRNA-1序列；

序列3为甲型H7N9禽流感病毒NA节段基因序列；

序列4为甲型H7N9禽流感病毒NA节段基因部分保守序列；

序列5为F1-N引物序列；

序列6为R3引物序列；

序列7为LwCas13a蛋白氨基酸序列。

实施例1、基于CRISPR-Cas13a系统的甲型H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒及检测方法

一、基于CRISPR-Cas13a系统的甲型H7N9禽流感病毒核酸检测试剂盒

(一)质粒标准品的制备

甲型H7N9禽流感病毒NA节段基因序列为序列3(GenBank ID：KF021599.1)，其中序列3的第319-603位较为保守(序列4，见表1)，crRNA-1的靶点序列为序列3 第391-419位(序列4第73-101位)。

表1为多种N9型甲型流感病毒NA节段基因片段

H7N9质粒标准品由天一辉远生物科技有限公司根据序列4制备，使用载体名称为pUC57，克隆位点为EcoRV(Eco32I)。

H2N9质粒标准品、H4N9质粒标准品、H5N9质粒标准品和H11N9质粒标准品均由天一辉远生物科技有限公司根据表1所示的序列制备，使用载体名称为pUC57，克隆位点为EcoRV(Eco32I)。

(二)RT-RAA扩增所需引物及其扩增产物的制备

根据NCBI收录的1213株H7N9病毒NA节段基因序列，根据序列比对分析结果在相对保守的片段(序列4)选择设计相应的引物。

1、RT-RAA扩增引物的设计

用于CRISPR检测的甲型H7N9禽流感病毒特异性RT-RAA引物，在引物的5’端具有一段T7转录序列，使RT-RAA扩增得到的双链DNA(dsDNA)可以被T7 RNA聚合酶识别并且进行转录。

H7N9的RT-RAA扩增引物序列如表2所示，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

表2为H7N9的RT-RAA扩增引物

2、RT-RAA扩增产物的获得

以H7N9质粒标准品作为模板，采用表2中F1-N、R3为F和R引物，利用RT-RAA 扩增试剂盒进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物。

上述RT-RAA扩增体系如表3所示。

表3为RT-RAA扩增体系

名称	体积
		模板	2μL
F(10μM)	2μL
		R(10μM)	2μL
A Buffer(试剂盒内组分)	41.5μL
		总体积	47.5μL

具体扩增操作步骤如下：将混合好的表3所示的47.5μL溶液加入到装有冻干粉的基础反应单元中，使冻干粉充分重溶均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μL B Buffer 溶液(试剂盒内组分)，合上管盖，上下颠倒5-6次混匀，快速离心10秒钟。将上述反应管放置在42℃条件下反应30分钟，得到RT-RAA扩增产物。

(三)crRNA的制备

根据NCBI收录的1213株H7N9病毒NA节段基因序列，根据序列比对分析结果在相对保守的片段(序列4)选择设计相应的crRNA，crRNA制备所需引物 (crRNA-1/2/3-F，crRNA-1/2-R)和模板(crRNA-1-M)如下表4所示，

表4为制备crRNA所需模板与引物序列

crRNA的制备方法如下：

(1)PCR扩增

将表4所示的引物序列用ddH₂O稀释成10μM，根据表5配制PCR反应体系。PCR反应条件如下：95℃5min热变性；95℃30s，55℃30s，72℃15s，共38个循环；72℃自动延伸10min；4℃保存，得到PCR产物。

表5为制备crRNA的PCR反应体系

名称	体积
		crRNA-M	2μL
crRNA-F	2μL
		crRNA-R	2μL
ExTaq Mix	19μL
		总体积	25μL

(2)PCR产物的纯化

使用Tris平衡酚对步骤(1)获得的PCR产物进行纯化，具体步骤如下：Tris平衡酚取500μL，加入等体积的三氯甲烷，振荡混匀后短暂离心，弃上清；取150μL 酚氯仿混合液加入PCR产物中，混匀后12,000rpm离心1min；取上清液到一个新的 1.5mL离心管，加入无水乙醇使上清与乙醇比例为3:7，12,000rpm离心10min，弃上清；加入200μL 75％的乙醇，12,000rpm离心10min，弃上清(该步骤共进行三次)。得到的沉淀室温晾干(约10min)，加入50μL无RNA酶的水，得到纯化PCR产物； Nanodrop(赛默飞ND-1000)检测浓度为732.0ng/μL，-20℃保存。

(3)转录

取1.5μL步骤(2)获得的纯化PCR产物，使用T7转录试剂盒转录crRNA。crRNA 转录体系如表6所示。

表6为crRNA转录体系

名称	体积
		NTP Mix	10μL
PCR产物	1.5μL
		T7 RNA聚合酶	2μL
无Nuclease水	6.5μL
		总体积	20μL

上述crRNA转录体系混匀后，37℃转录过夜，使用DNaseⅠ去除多余的DNA：上一步得到的转录产物加入20μL无RNase的水，加入2μL DNaseⅠ，混匀，37℃孵育 15min。

(4)crRNA的纯化

按照Agencourt RNA Clean XP说明书(Beckman Coulter)纯化步骤(3)转录获得的crRNA，具体步骤如下：磁珠振荡混匀，向转录产物中加入1.8倍体积的磁珠，吹打10次或涡旋30s以混匀磁珠和转录体系，室温静置5min。将反应体系放到磁力架，静置5-10min以分离磁珠。轻轻吸出体系中的液体，避免磁珠被吸出，向磁珠中加入200μL 70％的乙醇(无RNase水配制)，室温孵育30s，吸出乙醇；重复此过程清洗磁珠，共3次。室温晾干体系，去除体系中的乙醇，约10min。加入50μL RNase-free 水，涡旋30s或用移液器吹打10次，吸出上清液，放入无RNase的1.5mL离心管中， Nanodrop测定纯化得到的crRNA浓度为4241.5ng/μL，-80℃分装备用。

获得的crRNA序列具体如下：

GGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUGUUUCCCUCUGAUUGUUGUUCCUUGGCU(序列2；又名crRNA-1)，其中，序列2第1-38位为用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列；序列2第 39-67位为靶向甲型H7N9禽流感病毒靶点序列的向导序列。

crRNA靶点序列如下：AGCCAAGGAACAACAATCAGAGGGAAACA(序列1)，位于甲型H7N9禽流感病毒基因组NA节段(GenBank ID：KF021599.1，序列3)第391-419位(序列 4第73-101位)。

制备出的crRNA，用于后续CRISPR-Cas13a检测。

(四)LwCas13a蛋白

LwCas13a蛋白氨基酸序列为序列7。

LwCas13a蛋白的表达、纯化及活性鉴定可采用常规方法，也可参见文献(pubmed中PMID:32160714)中的方法。

(五)报告RNA

报告RNA为序列两端标记FAM和生物素的20U(天一辉远生物科技有限公司合成)。

(六)侧向流试纸

基于消线法的侧向流试纸按流动方向排序依次包括含有纳米金标记兔源抗FITC抗体的样品垫、含有T线和C线的NC膜以及吸水滤纸这3部分。

1)、含有纳米金标记兔源抗FITC抗体的样品垫

纳米金溶液：每100mL纯化水加入0.4mL 10％(质量体积比g：mL)的氯金酸和0.4mL 10％(质量体积比g：mL)柠檬酸三钠，得到纳米金溶液。

标记兔源抗FITC抗体溶液：每1mL上述纳米金溶液加入0.005mL 0.2M的碳酸钾水溶液以及0.01mg兔抗FITC抗体，得到浓度为0.01mg/mL纳米金标记兔源抗FITC 抗体溶液。

将1mL纳米金标记兔源抗FITC抗体溶液喷在0.006m²面积的样品垫上，包被浓度为0.02mg/mL，得到含有纳米金标记兔源抗FITC抗体的样品垫。

2)、含有T线和C线的NC膜的制备

链霉亲和素溶液，溶质为链霉亲和素，溶剂为磷酸盐包被缓冲液(每100mL含有0.8g NaCl，0.58g Na₂HPO₄·12H₂O，0.06g NaH₂PO₄·2H₂O,0.02mL Proclin300，并用纯化水定容至100mL)，浓度为1.5mg/mL。

羊抗兔IgG(抗FITC抗体的二抗)溶液，溶质为羊抗兔IgG，溶剂为磷酸盐包被缓冲液，浓度为1mg/mL。

将30μL上述链霉亲和素溶液喷施在硝酸纤维素膜(NC膜)上，形成T线，包被浓度为1.5mg/mL；将30μL羊抗兔IgG溶液喷施在NC膜上，形成C线，包被浓度为 1mg/mL；且T线和C线间隔7mm，得到含有T线和C线的NC膜。

3)、侧向流试纸的组装

将上述含有纳米金标记兔源抗FITC抗体的样品垫、含有T线和C线的NC膜和吸水滤纸按照层析方向依次组装在PVC底板上，再用外壳包装，使样品垫部分露出形成加样孔，得到侧向流试纸。

(七)基于CRISPR-Cas13a系统的甲型H7N9禽流感病毒核酸试剂盒的制备

本发明提供的基于CRISPR-Cas13a系统的甲型H7N9禽流感病毒核酸试剂盒包括用于检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR-Cas13a系统及上述(六)中制备的侧向流试纸；

上述用于检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR-Cas13a系统包括单独包装的上述(二)制备的RT-RAA扩增所需引物(序列5和序列6组成的引物)、上述(三)制备的crRNA (序列2)、上述(四)制备的LwCas13a蛋白(序列7)和上述(五)制备的报告RNA，还包括CRISPR-Cas13a反应的如下试剂中的全部或部分：NTP(如NTP Mix)、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、MgCl₂溶液、HEPES缓冲液、RNase free water。

二、基于CRISPR-Cas13a系统的甲型H7N9禽流感病毒核酸的检测方法的确定

本发明检测原理如下：

先用RT-RAA扩增所需引物对待测样本进行扩增，得到RT-RAA扩增产物；再将RT-RAA 扩增产物、crRNA、LwCas13a蛋白在含有报告RNA的CRISPR-Cas13a检测体系中反应，得到反应产物；再将反应产物点在侧向流试纸的加样孔中，反应产物流经纳米金标兔抗 FITC抗体时，体系中的报告RNA的FAM端会标记上用于显现的纳米金；流经链亲和素线时，若待测样本中含有甲型H7N9禽流感病毒靶点，则crRNA、LwCas13a蛋白和RT-RAA 扩增产物形成复合体，且激活LwCas13a蛋白活性，使其切割体系中的RNA(包括报告 RNA)，报告RNA被剪切时，其FAM端不受生物素端的影响，不显示第一条线(“T”线)；若待测样本中不含有甲型H7N9禽流感病毒靶点，则crRNA、LwCas13a蛋白形成复合体，不激活LwCas13a蛋白活性，无法切割报告RNA，报告RNA未被剪切时，FAM端随生物素端同时被拦截在链亲和素线(生物素和链亲和素结合)，其上标记的纳米金显现于第一条线(“T”线)；流经抗体(抗FITC抗体)捕获线时，无论报告RNA是否被剪切，纳米金标兔抗FITC抗体均有机会到达抗体捕获线，一抗(纳米金标兔抗FITC抗体)与二抗(抗FITC抗体)结合，即其上标记的纳米金应该显现于第二条线(“C”线)。

具体检测方法如下：

1、RT-RAA扩增

提取待测样本的核酸，用上述一的(七)制备的试剂盒中的RT-RAA扩增所需上下游引物(序列5和序列6组成的引物)对待测样品核酸进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物。

2、CRISPR-Cas13a反应

将上述RT-RAA扩增产物、上述一的(七)制备的试剂盒中的crRNA(序列2)、上述一的(七)制备的试剂盒中的LwCas13a蛋白(序列7)和上述一的(七)制备的试剂盒中的报告RNA(20U)按照如下表7所示的体系配制：

表7为CRISPR-Cas13a系统检测体系

名称	用量
		RT-RAA产物	5μL
LwCas13a蛋白(浓度45nM)	2μL
		NTP Mix	4μL
T7 RNA聚合酶	1μL
		RNA酶抑制剂(Murine RNase inhibitor)	2μL
MgCl₂溶液	10mM
		HEPES缓冲液	20mM
crRNA	22.5nM
		报告RNA	2nM
RNase free water	Up to 50μL
		总体积	50μL

将表7中的RT-RAA产物替换为ddH₂O，且保持其他试剂组分不变，即为阴性对照。

将表7配制的反应体系的反应管盖上管盖，上下颠倒5-6次混匀，低速离心10 秒钟，将上述反应管放置在37℃条件下反应30分钟，得到CRISPR-Cas13a反应产物。

3、试纸条检测

将上述2得到的CRISPR-Cas13a反应产物全部加入上述一的(七)制备的试剂盒中的试纸条的样品板的加样孔中，静置2-5分钟肉眼观察。

结果判定：

若试纸没有“T”线显现且有“C”线显现，则待测样本含有或候选含有甲型H7N9 禽流感病毒或其核酸；若试纸有“T”线显现且有“C”线显现，则待测样本不含有或候选不含有甲型H7N9禽流感病毒或其核酸；若试纸没有“C”线显现，则试纸失效，需更换试纸重新实验。

实施例2、基于CRISPR-Cas13a系统的检测方法的条件优化和摸索

一、高效RT-RAA扩增引物的筛选

以实施例1中的一(一)中制备的H7N9质粒标准品(10⁶copies/μL)为模板，用实施例1的二的1的方法进行RT-RAA扩增，引物分别为表2所示的各引物组合(组合形式如图1所示)，得到不同引物组合的RT-RAA扩增产物。

设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。

取20μL扩增产物，加入20μL的三氯甲烷：Tris平衡酚＝1：1与反应后产物等量混匀，振荡后离心10min，弃去上清的混合液中，振荡混匀，10000rpm离心10min，吸取上清10μL，加入3μL 6*Loading Buffer，混匀后琼脂糖凝胶电泳。

检测结果如图1所示，结果显示，F1-N-R3(表示F1-N和R3作为引物组合，其他依次类推)、F1-1-R1、F2-1-R1、F2-1-R2、F3-1-R1和F4-1-R1引物组合的扩增效率较高(为降低不同凝胶间差异对实验结果的影响，本次从两块凝胶中均选取一些效率较高的引物组合进行后续筛选)。

于是选择上述引物组合用于后续实验中RT-RAA扩增。

二、最优crRNA筛选

为筛选出最优crRNA，根据实施例1的一的(三)的方法以及表4中的模板和引物合成三种不同crRNA：

crRNA-1-M为模板，crRNA-1/2/3-F和crRNA-1/2-R为引物，得到crRNA-1；

crRNA-2-M为模板，crRNA-1/2/3-F和crRNA-1/2-R为引物，得到crRNA-2；

crRNA-3-M为模板，crRNA-1/2/3-F和crRNA-3-R为引物，得到crRNA-3。

利用上述一中筛选出的高效引物组合F1-N-R3、F1-1-R1、F2-1-R1、F2-1-R2、 F3-1-R1和F4-1-R1所得RT-RAA扩增产物(模板为质粒标准品(10⁶copies/μL))和上述三种不同crRNA分别进行CRISPR-Cas13a反应，再用试纸条检测(方法参照实施例1中二的方法)。

利用软件Image J(NIH,America)读取试纸条上T线灰度值，结果如图2上图所示，F1-N-R3引物组合配合三种crRNA时均可进行检测，F1-1-R1、F2-1-R1、F2-1-R2、 F3-1-R1和F4-1-R1引物组合只能配合crRNA-1进行检测，其余组合检测效率较低。

再次实验：利用上述引物组合F1-N-R3对质粒标准品(10²copies/μL)进行扩增，并将扩增产物分别与crRNA-1、crRNA-2和crRNA-3进行CRISPR-Cas13a反应，再用试纸条检测(方法参照实施例1中二的方法)，同时采用F2-1-R1、F3-1-R1、F4-1-R1 对质粒标准品(10²copies/μL)进行扩增，并将扩增产物与crRNA-1检测(方法参照实施例1中二的方法)，再用试纸条检测(方法参照实施例1中二的方法)。

利用软件Image J(NIH,America)读取试纸条上T线灰度值，结果如图2下图所示，F1-N-R3和F3-1-R1引物组合在配合crRNA-1可进行检测，其余组合效率较低。

因此选择crRNA-1作为针对甲型H7N9禽流感病毒的crRNA用于后续检测实验。

三、最优检测方法的确定

为确定最优检测方法，即确定最优RT-RAA扩增引物组合。

(一)两种引物组合灵敏度测试

将实施例1的一的(一)制备的H7N9质粒标准品利用无RNA酶的水进行系列梯度稀释，得到含有不同浓度甲型H7N9禽流感病毒基因质粒的溶液(浓度依次为10⁶,10⁵， 10⁴,10³,10²,10¹,10⁰,5×10^-1copies/μL)，针对上述二中两种引物组合F1-N-R3引物组合和F3-1-R1引物组合分别按照实施例1中二的方法检测，crRNA为crRNA-1，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。

检测结果如图3所示，加入不同浓度质粒标准品的各组“T”线消失且“C”线显现；阴性对照组“T”线和“C”线均显现。判定加入不同浓度质粒标准品的各组为阳性，阴性对照组为阴性，说明两种引物组合的灵敏度一致。

(二)两种引物组合特异性测试

将实施例1制备的H2N9质粒标准品、H4N9质粒标准品、H5N9质粒标准品和H11N9 质粒标准品和实施例1的一的(一)制备的H7N9质粒标准品分别利用无RNA酶的水稀释至10³copies/μL，针对上述二中两种引物组合F1-N-R3引物组合和F3-1-R1引物组合分别按照实施例1中二的方法检测，crRNA为crRNA-1，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。

检测结果如图4所示，引物组合F1-N-R3中甲型H7N9禽流感病毒的“T”线消失且“C”线显现，为阳性；其他各组“T”线和“C”线均显现，为阴性。引物组合F3-1-R1 中甲型H7N9禽流感病毒、甲型H11N9流感病毒的“T”线消失且“C”线显现，为阳性；其他各组“T”线和“C”线均显现，为阴性。上述结果说明引物组合F1-N-R3的特异性优于引物组合F3-1-R1。

根据上述结果，实施例1的二的检测方法中，RT-RAA扩增采用最优引物组合为 F1-N-R3(F1-N和R3组成的引物对)，最优crRNA为crRNA-1(序列2)。

实施例3、基于CRISPR-Cas13a系统的甲型H7N9禽流感病毒核酸的检测方法的灵敏度检测

检测方法见实施例2的三的(一)中的灵敏度测试方法，RT-RAA扩增引物组合为F1-N-R3，crRNA为crRNA-1。

检测结果如图3所示，加入不同浓度质粒标准品的各组“T”线消失且“C”线显现；阴性对照组“T”线和“C”线均显现。判定加入不同浓度质粒标准品的各组为阳性，阴性对照组为阴性，说明本发明的基于CRISPR-Cas13a系统检测甲型H7N9禽流感病毒核酸的方法的灵敏度为5×10^-1copies/μL，由于本实验体系中加入的模板量为 2μL，因此本方法的灵敏度为1copy/reaction。

实施例4、基于CRISPR-Cas13a系统的甲型H7N9禽流感病毒核酸的检测方法的特异性检测

检测方法见实施例2的三的(二)中的特异性测试方法，RT-RAA扩增引物组合为F1-N-R3，crRNA为crRNA-1。

检测结果如图4所示，甲型H7N9禽流感病毒的“T”线消失且“C”线显现，为阳性；其他各组“T”线和“C”线均显现，为阴性。

说明本发明的基于CRISPR-Cas13a系统检测甲型H7N9禽流感病毒核酸的方法具有很高的特异性，检测过程中不存在交叉反应。

分别将H2N9(GenBank ID：MK345656.1)、H4N9(GenBank ID：CY165752.1)、 H5N9(GenBank ID：MK167354.1)、H11N9(GenBank ID：MH932504.1)病毒序列与 H7N9病毒序列进行比对分析，crRNA和RT-RAA引物靶序列区域结果如图5所示， H2N9、H5N9、H11N9病毒在crRNA、RT-RAA引物靶序列区域与H7N9病毒序列均存在少量差异；H4N9病毒在RT-RAA引物靶序列区域与H7N9病毒序列完全一致，在crRNA靶序列区域与H7N9病毒序列仅存在单碱基差异(序列1第12位)。结合图4中的结果说明本发明的基于CRISPR-Cas13a系统检测甲型H7N9禽流感病毒核酸的方法具有单碱基特异性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR核酸检测试剂盒

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

agccaaggaa caacaatcag agggaaaca 29

<210> 2

<211> 67

<212> DNA/RNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gggauuuaga cuaccccaaa aacgaagggg acuaaaacug uuucccucug auuguuguuc 60

cuuggcu 67

<210> 3

<211> 1398

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgaatccaa atcagaagat tctatgcact tcagccactg ctatcataat aggcgcaatc 60

gcagtactca ttggaatggc aaacctagga ttgaacatag gactgcatct aaaaccgggc 120

tgcaattgct cacactcaca acctgaaaca accaacacaa gccaaacaat aataaacaac 180

tattataatg aaacaaacat caccaayatc caaatggaag agagaacaag caggaatttc 240

aataacttaa ctaaagggct ctgtactata aattcatggc acatatatgg gaaagacaat 300

gcagtaagaa ttggagagag ctcggatgtt ttagtcacaa gagaacccta tgtttcatgc 360

gacccagatg aatgcaggtt ctatgctctc agccaaggaa caacaatcag agggaaacac 420

tcaaacggaa caatacacga taggtcccag tatcgcgccc tgataagctg gccactatca 480

tcaccgccca cagtgtacaa cagcagggtg gaatgcattg ggtggtcaag tactagttgc 540

catgatggca aatccaggat gtcaatatgt atatcaggac caaacaacaa tgcatctgca 600

gtagtatggt acaacagaag gcctgttgca gaaattaaca catgggcccg aaacatacta 660

agaacacagg aatctgaatg tgtatgccac aacggcgtat gcccagtagt gttcaccgat 720

gggtctgcca ctggacctgc agacacaaga atatactatt ttaaagaggg gaaaatattg 780

aaatgggagt ctctgactgg aactgctaag catattgaag aatgctcatg ttacggggaa 840

cgaacaggaa ttacctgcac atgcagggac aattggcagg gctcaaatag accagtgatt 900

cagatagacc cagtagcaat gacacacact agtcaatata tatgcagtcc tgttcttaca 960

gacaatcccc gaccgaatga cccaaatata ggtaagtgta atgaccctta tccaggtaat 1020

aataacaatg gagtcaaggg attctcatac ctggatgggg ctaacacttg gctagggagg 1080

acaataagca cagcctcgag gtctggatac gagatgttaa aagtgccaaa tgcattgaca 1140

gatgatagat caaagcccat tcaaggtcag acaattgtat taaacgctga ctggagtggt 1200

tacagtggat ctttcatgga ctattgggct gaaggggact gctatcgagc gtgtttttat 1260

gtggagttga tacgtggaag acccaaggag gataaagtgt ggtggaccag caatagtata 1320

gtatcgatgt gttccagtac agaattcctg ggacaatgga actggcctga tggggctaaa 1380

atagagtact tcctctaa 1398

<210> 4

<211> 285

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

agctcggatg ttttagtcac aagagaaccc tatgtttcat gcgacccaga tgaatgcagg 60

ttctatgctc tcagccaagg aacaacaatc agagggaaac actcaaacgg aacaatacac 120

gataggtccc agtatcgcgc cctgataagc tggccactat catcaccgcc cacagtgtac 180

aacagcaggg tggaatgcat tgggtggtca agtactagtt gccatgatgg caaatccagg 240

atgtcaatat gtatatcagg accaaacaac aatgcatctg cagta 285

<210> 5

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

aattctaata cgactcacta tagggtcatg cgacccagat gaatgcaggt tctatgc 57

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

ggtgatgata gtggccagct tatcagggcg 30

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 7

Met Lys Val Thr Lys Val Asp Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Ile Glu

1 5 10 15

Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu

20 25 30

Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu Asp Ile Tyr Ile Lys Asn

35 40 45

Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu

50 55 60

Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His Leu Lys Asp Ser Val Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala Val Gln Asp Lys Asn Tyr

85 90 95

Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Lys Asn Lys Asn Ser Phe

100 105 110

Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Val Asn Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Glu Ile Phe Arg Lys Asp Val Glu Ala Lys Leu Asn Lys Ile Asn

130 135 140

Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile

145 150 155 160

Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile

165 170 175

Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asn Asp Tyr Ile Asn

180 185 190

Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Lys Glu Asp Ile Glu

195 200 205

Lys Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys Lys His Glu Lys Tyr Lys

210 215 220

Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu

225 230 235 240

Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Ile

245 250 255

Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser

260 265 270

Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys

275 280 285

Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln

290 295 300

Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp

305 310 315 320

Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu

325 330 335

Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys

340 345 350

Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile

355 360 365

Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val

370 375 380

Ser Ser Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn

385 390 395 400

Glu Asn Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn

405 410 415

Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn

420 425 430

Glu Asn Lys Gln Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser

435 440 445

Tyr Asp Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala

450 455 460

Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe

465 470 475 480

Asn Leu Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala

485 490 495

Pro Ser Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys

500 505 510

Lys Leu Lys Leu Lys Ile Phe Lys Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe

515 520 525

Asn Tyr Tyr Glu Lys Asp Val Ile Ile Lys Tyr Leu Lys Asn Thr Lys

530 535 540

Phe Asn Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys

545 550 555 560

Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn Thr Leu Lys Phe Phe Trp

565 570 575

Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Leu Leu

580 585 590

Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Lys Phe Val Lys Asn Ser

595 600 605

Lys Val Phe Phe Lys Ile Thr Asn Glu Val Ile Lys Ile Asn Lys Gln

610 615 620

Arg Asn Gln Lys Thr Gly His Tyr Lys Tyr Gln Lys Phe Glu Asn Ile

625 630 635 640

Glu Lys Thr Val Pro Val Glu Tyr Leu Ala Ile Ile Gln Ser Arg Glu

645 650 655

Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile Asp Phe

660 665 670

Ile Gln Gln Ile Phe Leu Lys Gly Phe Ile Asp Tyr Leu Asn Lys Asn

675 680 685

Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Ser Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asn Asp Ile

690 695 700

Phe Ser Lys Ile Lys Ile Lys Lys Asp Asn Lys Glu Lys Tyr Asp Lys

705 710 715 720

Ile Leu Lys Asn Tyr Glu Lys His Asn Arg Asn Lys Glu Ile Pro His

725 730 735

Glu Ile Asn Glu Phe Val Arg Glu Ile Lys Leu Gly Lys Ile Leu Lys

740 745 750

Tyr Thr Glu Asn Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu Leu Asn

755 760 765

His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr Gln Ser

770 775 780

Ala Asn Lys Glu Glu Thr Phe Ser Asp Glu Leu Glu Leu Ile Asn Leu

785 790 795 800

Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu Glu Ala

805 810 815

Asn Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Glu Asn Lys Ile Lys Asp

820 825 830

Arg Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe Asp Gly

835 840 845

Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys Tyr Gly

850 855 860

Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Ile

865 870 875 880

Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu Ile Glu

885 890 895

Lys Asn Tyr Thr Met Gln Gln Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala Arg Pro

900 905 910

Lys Lys Asp Glu Lys Phe Asn Asp Glu Asp Tyr Lys Glu Tyr Glu Lys

915 920 925

Ala Ile Gly Asn Ile Gln Lys Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys Val Glu

930 935 940

Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Lys Ile Leu His

945 950 955 960

Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg Phe Arg

965 970 975

Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn His Tyr Ile Glu Glu Ile Phe Asn

980 985 990

Phe Asp Asn Ser Lys Asn Val Lys Tyr Lys Ser Gly Gln Ile Val Glu

995 1000 1005

Lys Tyr Ile Asn Phe Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Asp Asn Val Glu

1010 1015 1020

Lys Arg Ser Ile Tyr Ser Asp Lys Lys Val Lys Lys Leu Lys Gln

1025 1030 1035

Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn

1040 1045 1050

Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu Glu Asn

1055 1060 1065

Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Ile

1070 1075 1080

Met Lys Ser Ile Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala

1085 1090 1095

Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Glu Ile Gln Thr Leu

1100 1105 1110

Glu Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys

1115 1120 1125

Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys

1130 1135 1140

Val Met Phe Glu Tyr Lys Ala Leu Glu

1145 1150

Claims

1.一种用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的试剂盒，包括用于特异性检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR-Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；

所述用于检测甲型H7N9禽流感病毒的CRISPR-Cas13a系统如下a1）-a9）和水组成；

a1）crRNA；

所述crRNA的靶点序列为序列1；

所述crRNA的核苷酸序列为序列2；

所述crRNA在所述系统中的浓度为22.5 nM；

a2）LwCas13a蛋白；所述LwCas13a蛋白的核苷酸序列为序列7，且其在所述系统中的浓度为45nM；

a3）NTP Mix，其按照每50ul所述系统加入4ul量加入；

a4）T7 RNA聚合酶，其按照每50ul所述系统加入1 µL量加入；

a5）RNA酶抑制剂，其按照每50ul所述系统加入2 µL量加入；

a6）MgCl₂溶液，其在所述系统中的浓度为10 mM；

a7）HEPES缓冲液，其在所述系统中的浓度为20 mM；

a8）报告RNA，所述报告RNA由20个U组成，所述报告RNA的两个末端分别标记生物素和与所述侧向流试纸的样品垫标记的纳米金标记兔源抗FITC抗体结合的FAM基团；其在所述系统中的浓度为2 nM；

a9）RT-RAA产物，其按照每50ul所述系统加入5 µL量加入；

所述RT-RAA产物采用的引物为用于扩增待测样本靶点序列的RT-RAA扩增引物，且所述RT-RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7 RNA聚合酶识别的区域；所述RT-RAA扩增引物由序列5所示的单链DNA分子和序列6所示的单链DNA分子组成；

所述侧向流试纸按样品流动方向依次包括含有纳米金标记兔源抗FITC抗体的样品垫、含有T线和C线的NC膜和吸水滤纸；

所述T线由链霉亲和素形成；

所述C线由所述纳米金标记兔源抗FITC抗体的二抗羊抗兔IgG形成。

2.权利要求1所述试剂盒在如下c1-c3任一中的应用：

c1)制备检测或辅助检测甲型H7N9禽流感病毒产品；

c2)制备检测或辅助检测甲型H7N9禽流感病毒核酸产品；

c3) 制备检测或辅助检测待测样本中是否含有甲型H7N9禽流感病毒核酸产品。

3.一种检测或辅助检测甲型H7N9禽流感病毒核酸的方法，所述方法为非疾病诊断治疗目的，其包括如下步骤：

b1、提取待测样本的核酸，用权利要求1所述试剂盒中的RT-RAA扩增引物对待测样本的核酸进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物；

b2、将所述RT-RAA扩增产物、权利要求1所述试剂盒中的所述crRNA、权利要求1所述试剂盒中的所述LwCas13a蛋白在含有权利要求1所述试剂盒中的所述报告RNA的体系中反应，得到反应产物；

b3、将所述反应产物加入权利要求1所述试剂盒中的所述侧向流试纸的样品垫的加样孔中，静置观察；

若试纸没有T线显现且有C线显现，则待测样本含有或候选含有甲型H7N9禽流感病毒核酸；若试纸有T线显现且有C线显现，则待测样本不含有或候选不含有甲型H7N9禽流感病毒核酸。