CN111455096A

CN111455096A - 一种基于raa荧光法快速检测流感病毒n9的引物、探针及检测试剂盒

Info

Publication number: CN111455096A
Application number: CN202010123000.6A
Authority: CN
Inventors: 郑伟; 郑乐怡; 鲍泽英; 王刚; 陈淑丹; 吴忠华; 郭利川; 汤赛君; 王智宏; 应清界
Original assignee: Jiangsu Qitian Gene Biotechnology Co ltd; Hangzhou International Travel Health Care Center Hangzhou Customs Port Outpatient Department
Current assignee: Jiangsu Qitian Gene Biotechnology Co ltd; Hangzhou International Travel Health Care Center Hangzhou Customs Port Outpatient Department
Priority date: 2020-02-27
Filing date: 2020-02-27
Publication date: 2020-07-28

Abstract

本发明提供一种基于RAA荧光法检测流感病毒N9的引物、探针及检测试剂盒，所述引物和探针适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出流感病毒N9，特异性能够达到100％，所述检测试剂盒能够方便快速且准确地鉴定流感病毒N9，操作方便，检测时间短，15min内可以完成检测，无需像PCR一样通过高温95℃变性使DNA解旋，再在50～60℃退火，最后在72℃完成延伸，只需在30～42℃下进行等温扩增即可完成检测。也无需像LAMP技术一样使用4‑6条引物在65℃情况下进行扩增且容易产生假阳性。

Description

一种基于RAA荧光法快速检测流感病毒N9的引物、探针及检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，尤其是涉及一种基于RAA荧光法快速检测流感病毒N9的引物、探针及检测试剂盒。

背景技术

流行性感冒(流感)是一种由流行性感冒病毒引起的季节性急性上呼吸道感染疾病,主要通过患者的飞沫、患者与患者之间的接触或与被污染物品的接触迅速传播。这种疾病通常表现为发热、寒颤、头痛、肌肉酸痛和干咳。据世界卫生组织(World HealthOrganization,WHO)不完全统计,平均每年全世界约有三百万到五百万人感染流感病毒,其中约有五十万人死于流感病毒。

流行性感冒病毒简称流感病毒,是一种RNA病毒,呈球形或丝状,直径80～120nm,有一层脂质囊膜膜上有蛋白质,是由凝血素(H)和神经氨酸酶(N)组成,均具抗原性,易发生变异。A型流感病毒主要有H和N变异,H有16个亚型,N有9个亚型,因此A型流感病毒又分很多亚型。A型流感病毒是引起人畜流感的主要病毒,且经常发生抗原变异,传染性大,传播迅速,极易发生大范围流行。

A型流感病毒中的禽流感病毒，危害大，并且禽流感病毒血清型众多，变异性极强，给养禽业及相关行业带来了毁灭性打击，对动物卫生、食品安全、人类健康和国家经济安全构成严重威胁，因此防治禽流感具有重要的公共卫生意义，已成为世界各国人畜共患病监测的重点。

目前检测流感病毒的方法主要有流感病毒分离培养、血清免疫学检测、分子生物学检测、环介导等温扩增法等。

病毒分离培养是鉴定病毒的经典方法,包括传统病毒分离培养和快速病毒分离培养。传统的流感病毒分离培养主要包括流感病毒鸡胚接种和细胞培养。

血清学检测方法的原理是抗原抗体反应,通常检测的抗原有核蛋白、血凝素、神经氨酸酶蛋白和膜蛋白M2e等。

分子生物学方法如实时荧光PCR具有灵敏度，特性好，但需要专业技术人员和复杂的仪器和完备的实验室，时间周期也需要1.5-2小时；逆转录环介导等温扩增法(LAMP)具有等温60-65℃，具有很好的特异性，但假阳性率较高，引物设计复杂。

发明内容

本发明的第一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种基于RAA荧光法检测流感病毒N9的引物。

本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种基于RAA荧光法检测流感病毒N9的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列如SEQ IDNo.1所示：CTAGTACTTGACCACYCAATGCATTCCACYCTGC；所述下游引物序列如SEQ IDNo.2所示：CAGAGGGAAACACTCAAAYGGAACAATACAC。

本发明的第二个目的在于，针对现有技术的不足，提供一种基于RAA荧光法检测流感病毒N9的探针。

本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种基于RAA荧光法检测流感病毒N9的探针，其特征在于，所述探针的序列如SEQIDNo.3所示：CTGCTRTTGTAYACTGTGGGCGGTGATGATAGTGGCCAGCTTATCAG。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：

优选地，所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数30bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数15bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基AG，其中的碱基A用四氢呋喃残基替换。

优选地，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，优选为FAM或HEX。

优选地，所述荧光淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL，优选为BHQ1或BHQ2。

本发明还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种基于RAA荧光法检测流感病毒N9的检测试剂盒。

本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种基于RAA荧光法检测流感病毒N9的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：引物、探针、RAA荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为如SEQ IDNo.1所示序列；所述下游引物序列为如SEQIDNo.2所示序列，所述探针的序列如SEQ IDNo.3所示，其优选方案如前文所示。

优选地，所述上游引物和下游引物的浓度分别优选为0.01～0.1mM，更优选为0.05mM。

优选地，所述探针的浓度优选为0.02～0.07mM，更优选为0.03mM。

优选地，所述反应缓冲液包括以下含量组分：浓度为300mM的Tris-HCl缓冲液(PH＝8.0)、浓度为280mM的MgAc和质量分数为20％的PEG 20000。

优选地，所述阳性质控品中含有流感病毒N9的基因组DNA；所述流感病毒N9的基因组DNA的浓度为1×10⁴Copies/ul。

优选地，所述阴性质控品为ddH₂O或纯化水。

本发明提供一种基于RAA荧光法检测流感病毒N9的引物、探针及检测试剂盒，所述引物和探针适用于RAA荧光法检测，并且能够准确地检测出流感病毒N9，特异性能够达到100％，所述检测试剂盒能够方便快速且准确地鉴定流感病毒N9，操作方便，检测时间短，15min内可以完成检测，无需像PCR一样通过高温95℃变性使DNA解旋，再在50～60℃退火，最后在72℃完成延伸，只需在30～42℃下进行等温扩增即可完成检测。也无需像LAMP技术一样使用4-6条引物在65℃情况下进行扩增且容易产生假阳性。

检测试剂盒所用的检测方法快速、容易实现高通量，同时降低了检测时间和检测成本，研究表明本发明提供的基于RAA荧光法快速检测流感病毒N9的试剂盒，检测流感病毒N9时与其他呼吸道病毒如人偏肺病毒(MPV)、人博卡病毒(BOV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、人鼻病毒、H1N1甲流病毒、H3N2甲流病毒、乙流病毒无交叉反应，具有特异性强，特异性达100％。灵敏度高，每反应检测灵敏度达到为10Copies。

本发明提供的基于RAA荧光法快速检测流感病毒N9的试剂盒，不需要大型仪器设备，适用于现场检测及适用于大规模的筛选。

附图说明

图1为不同浓度质粒DNA灵敏度检测结果。

图2为与常规荧光定量PCR的比较试验结果。

图3为流感病毒N9质粒DNA重复性检测结果。

图4为流感病毒N9的特异性检测结果。

具体实施方式

参照附图和具体实施例对本发明作进一步地详细地描述。

本发明提供了一种基于RAA荧光法快速检测流感病毒N9的引物、探针及检测试剂盒，其实现方法有以下几个步骤：

1).选择正确的流感病毒N9保守序列进行引物探针设计；

2).选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团；

3).合成引物探针；

4).合成阳性质粒；

5).制备阳性质粒标准品；

6).筛选灵敏度高的引物探针；

7).用筛选出来的引物探针进行RAA荧光检测实验；

根据基因名称流感病毒N9在Genebank中找到相应的全基因序列(www.ncbi.nlm.nih.gov)，运用DNASTAR软件进行同源性分析和b1ast序列分析，筛出流感病毒N9高度保守序列如SEQ IDNo.4所示：CAGAGGGAAACACTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCAGTATCGCGCTCTGATAAGCTGGCCACTATCATCACCGCCCACAGTATACAATAGCAGGGTGGAATGCATTGGGTGGTCAAGTACTAG；以高度保守序列作为检测目的基因，合成阳性质粒并进行引物探针设计；

引物设计包括上游引物和下游引物，设计上游引物为SEQ IDNo.1所示序列：CTAGTACTTGACCACYCAATGCATTCCACYCTGC；下游引物为SEQ IDNo.2所示序列：CAGAGGGAAACACTCAAAYGGAACAATACAC。

根据以上序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成DNA质粒，质粒大小129bp；

1、引物探针设计

采用RAA技术引物及探针设计原则进行的设计，通过筛选和评价，确定上游引物为SEQ IDNo.1所示序列：

5’-CTAGTACTTGACCACYCAATGCATTCCACYCTGC-3’

下游引物为SEQ IDNo.2所示序列：

5’-CAGAGGGAAACACTCAAAYGGAACAATACAC-3’

探针序列为为SEQ IDNo.3所示序列：

5’-CTGCTRTTGTAYACTGTGGGCGGTGATGATAGTGGCCAGCTTATCAG-3’

2、选择荧光修饰基团和荧光淬灭基团

根据实验仪器采用的是无锡奇天生物科学仪器有限公司生产的RAA-F1620荧光基因检测仪，所检测的荧光为FAM荧光，因此荧光修改基团选为FAM，荧光淬灭基团选为BHQ1；

也可以根据仪器检测荧光的性能，将荧光修饰基团选择为HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；荧光淬灭基团选择TAMRA、Eclipse、BHQ2、BHQ3或DABCYL；

但优选荧光修饰基团为FAM、HEX，优选荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2。

3、所述探针的修饰方法优选包括：荧光报告基团修饰在探针序列离5'端碱基数30bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3'端碱基数15bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔2个碱基AG，其中碱基A用四氢呋喃残基替换。

4、引物探针及质粒均委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。

5、质粒阳性标准品制备

重组质粒通过转接大肠杆菌培养并提取，得到质粒后用超微量紫外分光光度计进行浓度测定并进行拷贝数计算，按浓度梯度稀释制备成1.0×10¹copies/ul-1.0×10¹⁰Copies/ul备用。

6、组成试剂盒

基于RAA荧光法快速检测流感病毒N9的试剂盒，包括RAA荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阳性质控品、阴性质控品，引物和探针；

上游引物和下游引物的浓度独立优选为0.01～0.05mM，更优选为0.03mM。

探针的浓度优选为0.01～0.05mM，更优选为0.02mM。

试剂盒中包括RAA荧光通用反应试剂，RAA荧光通用反应试剂优选为经过低温冷冻干燥的冻干粉。本发明实施例中RAA荧光通用反应试剂购自江苏奇天基因生物科技有限公司，货号为F00001，反应规格为50ul，使用前用反应缓冲液进行重溶。

重溶RAA反应缓冲液优选包括以下含量的组分：浓度为300mM的Tris-HCl(PH＝8.0)缓冲液、浓度为280mM的MgAc和质量分数为20％的PEG 20000。本发明中，Tris-HCl缓冲液、MgAc和PEG 20000的浓度均为终浓度。本发明对所述Tris-HCl缓冲液、MgAc和PEG 20000的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。本发明实施例中所述Tris-HCl、和PEG20000的购自Sigma-Aldrich，MgAc购自国药沪试。

试剂盒包括阳性质控品。所述阳性质控品中优选含有流感病毒N9的基因组DNA。所述流感病毒N9的基因组DNA的浓度优选为1×10⁴Copies/ul。本发明实施例中所述阳性质控品通过重组质粒转接大肠杆菌培养并提取。

试剂盒包括阴性质控品。阴性质控品优选为ddH₂O或纯化水。

在本发明中，上述方案所述的RAA荧光法检测流感病毒N9的试剂盒的使用方法，优选包括如下步骤：

(1)提取待测样品(流感病毒N9质粒)的RDNA，提取方法可以采用市售商品化的病毒核酸提取试剂，按说明书进行操作。本发明中采用西安天隆的核酸自动提取仪，选用西安天隆的配套核酸提取试剂进行DNA的提取；提取得到的质粒DNA-20℃保存备用。

(2)将检测仪器RAA-F1620接通电源进行预热，对反应参数进行设置，反应参数设置为39℃，反应时间：20min。

(3)在42.5μL反应缓冲液中加入1μL探针和1μL引物，充分混合后添加到RAA荧光通用反应试剂中混合；得到反应预混液；

(4)将5μL所述步骤(1)中得到的DNA提取液与所述步骤(3)中得到的反应混合液充分混合，得到的反应体系进行放入检测仪器RAA-F1620进行检测荧光信号；

(5)根据RAA-F1620检测仪器中的阳性判定方法，将斜率值K≥20时，判定为阳性。斜率值K＜20时判定为阴性。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：灵敏度实验

上游引物为SEQ IDNo.1所示序列：：

5’-CTAGTACTTGACCACYCAATGCATTCCACYCTGC-3’

下游引物为SEQ IDNo.2所示序列：：

5’-CAGAGGGAAACACTCAAAYGGAACAATACAC-3’

探针序列为为SEQ IDNo.3所示序列：：

5’-CTGCTRTTGTAYACTGTGGGCGGTGATGATAGTGGCCAGCTTATCAG-3’

采用荧光报告基团(FAM)和荧光淬灭基团(BHQ1)修饰探针；

试剂盒组成如表1所示：

制备好的重组质粒工作标准品，分别为：

工作标准品1，含有0.2×10⁶Copies/ul流感病毒N9质粒非传染性DNA片段。

工作标准品2，含有0.2×10⁵Copies/ul流感病毒N9质粒非传染性DNA片段。

工作标准品3，含有0.2×10⁴Copies/ul流感病毒N9质粒非传染性DNA片段。

工作标准品4，含有0.2×10³Copies/ul流感病毒N9质粒非传染性DNA片段。

工作标准品5，含有0.2×10²Copies/ul流感病毒N9质粒非传染性DNA片段。

工作标准品6，含有0.2×10¹Copies/ul流感病毒N9质粒非传染性DNA片段。

灵敏度实验实施方法：

(1)反应缓冲液的配制

从试剂盒中反应缓冲液管里吸取301μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlPE管，再加入16μL探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mM，引物的浓度为0.03mM)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。

(2)RAA荧光反应试剂重溶

准备7个RAA荧光基础反应试剂，吸取步骤1中混匀的反应缓冲液45μL分别加入到准备好的7个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为RAA反应体系。

(3)加样反应

在以上7个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中分别加入5μL阴性质控品、5μL标准工作品6、5μL标准工作品5、5μL标准工作品4、5μL标准工作品3、5μL标准工作品2、5μL标准工作品1为模板，加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。

将反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图1所示。结果显示最快5分钟明显有扩增，15分钟内所有标准工作品均有扩增，每个反应管灵敏度可以达到1.0×10¹Copies，即在每个反应管中存在10Copies，就可以在15分钟内检测出来，表明本发明灵敏度高。

(4)常规荧光定量PCR比较试验

以上海之江流感病毒N9核酸检测试剂盒为比较试剂盒，根据试剂盒说明书配置反应体系(19μL反应液、1μL酶液、)，在反应体系中分别加入5μL阴性质控品、5μL标准工作品6、5μL标准工作品5、5μL标准工作品4、5μL标准工作品3、5μL标准工作品2为模板，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为25μL。

将反应管放入ABI Vii7荧光PCR仪中，设定反应条件为45℃-10min、95℃-15min；再按95℃-15sec→60℃-60sec循环40次。检测结果如图2所示。结果显示上海之江流感病毒N9核酸检测试剂盒灵敏度下限为1.0×10²Copies，而本发明灵敏度可以达到1.0×10¹Copies，表明本发明的灵敏度高于传统荧光PCR检测方法。

实施例2：重复性实验

引物探针及阳性质控品序列与实施例1相同。

试剂盒组成如表1所示。

重复性实验的实施方法为：

(1)反应缓冲液配制：

从试剂盒中反应缓冲液管里吸取173μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlPE管，再加入8μL探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mmol/，引物的浓度为0.03mM)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。

(2)RAA荧光基础反应试剂重溶

准备4个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的4个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混均，成为RAA反应体系，并做好标记。

(3)加样反应

在以上4个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中分别加入5μL阴性质控品、其他3个反应管中分别加入5μL流感病毒N9质粒DNA；每加好一个样就盖好管子盖子。加好样后每个反应管进行充分混均，每个反应管总体积为50μL。

将混匀的4个反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如图3所示。结果显示扩增反应重复性好。

实施例3：特异性实验

引物探针及阳性质控品序列与实施例2相同。

试剂盒组成如表1所示。

特异性实验的实施方法为：

特异性实验中流感病毒N9以N9重组DNA质粒代替，H1N1、H3N2、乙流病毒、人偏肺病毒、人博卡病毒、呼吸道合胞病毒、人鼻病毒样本由浙江国际旅行保健中心提供，并通过西安天隆全自动核酸提取仪及配套试剂盒提取病毒RNA，-80℃保存备用。

实施方法：

(1)反应缓冲液的配制

样本RNA反应缓冲液配制：从试剂盒中反应缓冲液管里吸取370μL反应缓冲液加入预先准备好的1.5mlPE管，再加入18μL探针与引物的混合物(探针的浓度为0.02mM，引物的浓度为0.03mM)，充分混匀，得混匀后的反应缓冲液。

(2)RAA荧光基础反应试剂重溶

准备8个RAA荧光基础反应试剂，每次吸取45μL步骤1中混匀的反应缓冲液分别加入到准备好的8个RAA荧光基础反应试剂管中，使冻干粉充分溶解并混匀，成为RAA反应体系，并做好标记。

(3)加样反应

在以上8个配制好的RAA荧光基础反应试剂试管中分别加入5μL阴性质控品、5μLN9重组DNA质粒、5μLH1N1 RNA、5μLH3N2 RNA、5μL乙流病毒RNA、5μL人偏肥病毒RNA、5μL人博卡病毒RNA、5μL呼吸道合胞病毒RNA、5μL人鼻病毒RNA；每加好一个样就盖好管子盖子，加好样后每个反应管进行充分混匀，每个反应管总体积为50μL。

(4)检测

将混匀的8个反应管放入RAA-F1620荧光检测仪中，设定反应温度为39℃，反应时间20分钟。检测结果如附图4所示。结果显示只有N9重组DNA质粒样本有扩增，为阳性，其他样本及阴性质控品均没有扩增，均为阴性。表明本发明提供的检测方法特异性强。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州国际旅行卫生保健中心（杭州海关口岸门诊部）

江苏奇天基因生物科技有限公司

<120> 一种基于RAA荧光法快速检测流感病毒N9的引物、探针及检测试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> 流感病毒N9型(influenza virus N9)

<400> 1

Cys Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Thr Gly Ala Cys Cys Ala Cys Tyr

1 5 10 15

Cys Ala Ala Thr Gly Cys Ala Thr Thr Cys Cys Ala Cys Tyr Cys Thr

20 25 30

Gly Cys

<210> 2

<211> 31

<212> PRT

<213> 流感病毒N9型(influenza virus N9)

<400> 2

Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Ala Ala Cys Ala Cys Thr Cys Ala

1 5 10 15

Ala Ala Tyr Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Thr Ala Cys Ala Cys

20 25 30

<210> 3

<211> 47

<212> PRT

<213> 流感病毒N9型(influenza virus N9)

<400> 3

Cys Thr Gly Cys Thr Arg Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Ala Cys Thr Gly

1 5 10 15

Thr Gly Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Ala Thr Gly Ala Thr Ala Gly

20 25 30

Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly Cys Thr Thr Ala Thr Cys Ala Gly

35 40 45

<210> 4

<211> 129

<212> PRT

<213> 流感病毒N9型(influenza virus N9)

<400> 4

Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Ala Ala Cys Ala Cys Thr Cys Ala

1 5 10 15

Ala Ala Cys Gly Gly Ala Ala Cys Ala Ala Thr Ala Cys Ala Cys Gly

20 25 30

Ala Thr Ala Gly Gly Thr Cys Cys Cys Ala Gly Thr Ala Thr Cys Gly

35 40 45

Cys Gly Cys Thr Cys Thr Gly Ala Thr Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly

50 55 60

Cys Cys Ala Cys Thr Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Gly Cys

65 70 75 80

Cys Cys Ala Cys Ala Gly Thr Ala Thr Ala Cys Ala Ala Thr Ala Gly

85 90 95

Cys Ala Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Cys Ala Thr Thr

100 105 110

Gly Gly Gly Thr Gly Gly Thr Cys Ala Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala

115 120 125

Gly

Claims

1.一种基于RAA荧光法快速检测流感病毒N9的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物序列如SEQ ID No.1所示：CTAGTACTTGACCACYCAATGCATTCCACYCTGC；所述下游引物序列如SEQ ID No.2所示：CAGAGGGAAACACTCAAAYGGAACAATACAC。

2.一种基于RAA荧光法快速检测流感病毒N9的探针，其特征在于，所述探针的序列如SEQ ID No.3所示：CTGCTRTTGTAYACTGTGGGCGGTGATGATAGTGGCCAGCTTATCAG。

3.一种基于RAA荧光法快速检测流感病毒N9的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：引物、如权利要求2所述的探针、RAA荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性质控品和阳性质控品，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物序列为如SEQ ID No.1所示序列，所述下游引物序列为如SEQ ID No.2所示序列。