CN109913592A - ENTV-2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测引物对及诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ENTV‑2的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测引物对，包括引物ENTV‑2‑F和引物ENTV‑2‑R，它们分别具有序列表中SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的碱基序列，该引物对可用于特异性扩增ENTV‑2。据此，发明人还研制了相应诊断试剂盒。本发明的引物对及诊断试剂盒，具有简单便捷、重复性好、敏感度高、特异性强、经济高效等优点，可以用于临床样本的快速、实时、定量诊断，为今后快速准确诊断该病提供方便。

Description

ENTV-2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测引物对及诊断试剂盒

技术领域

本发明属于羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus,ENTV-2)检测技术领域，尤其涉及ENTV-2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测引物对及诊断试剂盒。

背景技术

山羊地方性鼻内腺瘤(Enzootic nasal adenoma,ENA)是由山羊地方性鼻内肿瘤病毒引起的慢性、接触性的传染病，临床表现为食欲减退、机体消瘦、呼吸困难、鼻腔流出多量鼻液，剖检可见山羊鼻腔内有鼻腺肿瘤增生物病变，它可单侧或双侧性地堵塞鼻腔。自1939年该病在德国发现以来，相继在法国、美国、西班牙、加拿大、中国、印度等国家报道该病的存在。ENTV-2已经在我国多个省市报道，对我国的养羊业造成了极大的危害。该病在不同季节均可发生，发病率为0.1％-15％，但是发病致死率高达100％。该病发病较慢，感染该病毒后数月才出现明显的临床症状，因此对该病的早期诊断可为防治和净化提供坚实的基础。

由于山羊体内存在与ENTV-2基因组高度同源的内源性反转录病毒(ERVs)，因此建立该病病毒的分子生物学诊断方法比较困难。随着本病和ERVs的全基因序列测定的完善，为ENTV-2的分子生物学诊断提供了条件。目前国内外学者对ENTV-2诊断已经建立普通PCR和限制性酶切分析的分子生物学方法，但仍存在一定的缺陷。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供敏感性、特异性、准确性较好的ENTV-2的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测引物对及诊断试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

ENTV-2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测引物对，包括引物ENTV-2-F和引物ENTV-2-R，它们分别具有序列表中SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的碱基序列。

上述PCR检测引物对用于扩增ENTV-2中的gag基因。

ENTV-2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测诊断试剂盒，该试剂盒含有引物ENTV-2-F和引物ENTV-2-R，它们分别具有序列表中SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的碱基序列。

上述诊断试剂盒，包括以下试剂：阳性对照标准品、PCR反应液、阴性对照；阳性对照标准品为含有ENTV-2基因序列的重组质粒，PCR反应液包括提取的RNA反转录得到的cDNA模板、引物ENTV-2-F和引物ENTV-2-R、SYBR Green I Mix、ddH₂O，阴性对照为双蒸水。

重组质粒为pMD18-ENTV-2。

引物ENTV-2-F和引物ENTV-2-R的摩尔比为1:1。

根据羊地方性鼻内肿瘤病毒检测存在的问题，发明人针对ENTV-2gag基因的片段，设计了ENTV-2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测引物对，包括引物ENTV-2-F和引物ENTV-2-R，它们分别具有序列表中SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的碱基序列，该引物对可用于特异性扩增ENTV-2。据此，发明人还研制了相应诊断试剂盒。应用本发明能够直接从鼻拭子和组织样品中检测ENTV-2，检测方法的批内与批间变异系数均小于2％，重复性好，可检出最低为3.68×10¹copies/ul，灵敏度高。试验表明，本发明只能检出ENTV-2，而对常见的山羊呼吸道病毒小反刍兽疫病毒、山羊痘病毒、口蹄疫病毒、羊口疮病毒的扩增结果均为阴性，说明此法特异性强。综上，本发明的引物对及诊断试剂盒，具有简单便捷、重复性好、敏感度高、特异性强、经济高效等优点，可以用于临床样本的快速、实时、定量诊断，为今后快速准确诊断该病提供方便。

附图说明

图1是荧光定量PCR标准曲线。

图2是荧光定量PCR扩增的溶解曲线。

图3荧光定量特异性试验图，图中：1ENTV-2，2羊口疮病毒，3口蹄疫病毒，4羊痘病毒，5小反刍兽疫病毒，6阴性对照。

图4是标准样品倍比稀释的扩增曲线图。

图5是敏感性试验电泳图，图中：1：2000Marker；2-11分别为3.68×10¹⁰-3.68×10¹copies/μL。

图6是敏感性试验扩增图，图中：1-8分别为分别为3.68×10¹-3.68×10⁸copies/μL。

具体实施方式

一、实验材料

1菌株和质粒

大肠杆菌trans5α感受态细胞购自全式金有限责任公司。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒广西株为申请人分离保存、山羊痘病毒核酸、小反刍兽疫病毒核酸、口蹄疫病毒核酸为北京微生物研究所馈赠；羊口疮病毒为申请人分离获得并由申请人保存。

2试剂及仪器

病毒DNA/RNA提取试剂盒购自Axygen公司、SYBR Premix Ex Taq预混液和pMD18-T载体购自大连宝生物公司、DL2000Marker和EasyScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMix购自南京诺维赞生物科技有限公司、胶回收试剂盒购自北京天根生化责任有限公司、质粒提取试剂盒购自上海生物工程股份有限公司。

Sigma3-18k低温超高速离心机购自德国Sigma公司、LC96实时荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司、NanoDrop2000购自美国Thermo公司。

二、实时荧光定量PCR检测标准品的制备

1引物的设计和合成及筛选

在NCBI上查找山羊地方性鼻内肿瘤病毒的全基因序列为参考进行比对(KU179192.1，KU258870.1，KU258876.1，HM104174.1，KU980910.1，NC_004994.2，AY197548.2)，在gag基因上选择较保守的区域，同时与山羊内源性的反转录病毒序列(EF680305.1)比对，寻找ENTV-2和内源性反转录病毒基因序列有差异的部分，在gag基因上用Oligo7.0进行引物设计，设计两对引物，如表1所示，在上海生物工程有限公司合成。

表1引物序列

试验过程中，利用两对引物分别进行扩增，结果表明引物对1的特异性较差，很难鉴别诊断内源性的反转录病毒(ERVs)和ENTV-2，引物对2特异性良好，故用于本发明研发，命名为ENTV-2-F和ENTV-2-R，其碱基序列如下：

ENTV-2-F:5’-CCTCCGTCCCTAAAAATGCGACCTT-3’(ENTV-SC481-505)，

ENTV-2-R：5’-GCGACTCCTGAGTTCTGTAAAACCAC-3’(ENTV-SC 658-680)。

2病毒RNA提取及反转录

取收集的病变部位组织研磨液，3000r/min，4℃离心10min后，吸取上清液用于病毒RNA的提取。用Axygen DNA/RNA提取试剂盒进行RNA的提取，具体步骤根据说明书进行。用南京诺维赞EasyScript First-Strand cDNA SynthesisSuperMix反转录试剂盒将提取到的RNA进行反转录得到c DNA。

3PCR扩增

以反转录产物cDNA为模板进行PCR反应，其中PCR反应体系为50μL，Mix为25mL，上下游引物各1.5mL(10μmol/L)，cDNA模板为2μL，ddH₂O为20mL。

上述各组分混匀后瞬时离心，在PCR仪上进行以下的程序：95℃预变性3min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环，最后72℃延伸5min，吸取5μ进行琼脂糖凝胶电泳(1.5％)。

4目的产物的纯化回收

将大量的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切取目的片段，用天根胶回收试剂盒进行胶回收，纯化目的基因片段。

5目的基因的克隆与产物的转化鉴定

将ENTV-2gag基因保守序列中长度为200bp的目标片段(SEQ.ID.NO.5)，与pMD18-T载体连接，转化至Trans5α感受态细胞，在有氨苄抗性的平板上纯化培养，并进行PCR、测序鉴定，测序结果表明与ENTV-2GX株gag基因对应区域的同源性为100％，将成功构建的重组质粒命名为pMD18-ENTV-2。

三、实时荧光定量PCR反应及标准曲线的绘制

将少量纯化的pMD18-ENTV-2于超微量分光光度计测定其浓度和纯度，OD260/OD280为1.853，浓度为116.32ng/μL，根据公式换算重组质粒的拷贝数为3.68×10¹⁰copies/μL，将重组质粒10倍梯度稀释，取3.68×10⁸-3.68×10¹拷贝数的重组质粒建立标准曲线(图1)，横坐标代表质粒拷贝数的对数，纵坐标为ct值；因而推导出相应的回归方程为Y＝-3.6850x+37.75,回归方程与标准曲线的决定系数R²为0.999，扩增的效率为1.87。

荧光定量PCR扩增产物的溶解曲线见图2。标准品各个稀释度的溶解温度Tm值在81℃左右，单一的峰说明无引物二聚体和非特异性的扩增产物出现，所建立的PCR方法引物特异性好。

反应的条件和PCR体系见表2

表2实时荧光定量PCR反应体系及条件

四、特异性试验

采用建立的荧光定量PCR方法对ENTV-2阳性质粒、羊口疮病毒DNA及小反刍兽疫病毒cDNA、羊痘病毒DNA进行扩增，结果如图3所示，只有ENTV-2出现了特异性扩增，其他病毒核酸扩增结果显示阴性，说明该方法具有较好的特异性。

五、敏感性试验

将已经计算出拷贝数的重组质粒10倍梯度稀释，每个梯度的阳性重组质粒分别为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，由图5和图6可知能检测出最低的拷贝数为3.68×10¹copies/μL。

六、重复性试验

以3.68×10⁷、3.68×10⁶、3.68×10⁵、3.68×10⁴、3.68×10³、3.68×10²copies/μL，三个稀释度的ENTV-2重组质粒样品作为模板，进行荧光定量PCR的批内和批间重复性试验，结果如表3所示，三次的批内和批间变异系数均小于2％，表明建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的重复性。

表3实时荧光定量PCR批内和批间重复性试验

实时荧光定量PCR是在普通PCR的方法上通过监测荧光强度实现了对PCR在整个反应中动态的变化，还可以对病毒的拷贝数进行测定。因此，本发明敏感更佳，减少了后续的电泳步骤因而更加快速，为今后检测山羊地方性鼻内腺瘤提供了一种快速、特异性高、准确的方法。

序列表

<110> 广西大学

<120> ENTV-2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测引物对及诊断试剂盒

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgattcgtg attgcctgga ttt 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtggtattt agcagcttct tcg 23

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cctccgtccc taaaaatgcg acctt 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcgactcctg agttctgtaa aaccac 26

<210> 5

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cctccgtccc taaaaatgcg accttccgat aatgatgatt cactttcctc cacagatgag 60

gaggaattag ccgaagaagc tgctaaatac caccaggaag attggggttt tttagcacaa 120

gaaaaaggga cgttaacatc cacaaatgag ttggttcaat gcttaaaaaa ccttactgtg 180

gttttacaga actcaggagt 200

Claims (6)

1.ENTV-2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测引物对，其特征在于包括引物ENTV-2-F和引物ENTV-2-R，它们分别具有序列表中SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的碱基序列。

2.权利要求1所述的PCR检测引物对用于扩增ENTV-2中的gag基因。

3.一种ENTV-2的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有引物ENTV-2-F和引物ENTV-2-R，它们分别具有序列表中SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2的碱基序列。

4.根据权利要求3所述的诊断试剂盒，其特征在于包括以下试剂：阳性对照标准品、PCR反应液、阴性对照；所述阳性对照标准品为含有ENTV-2基因序列的重组质粒，PCR反应液包括提取的RNA反转录得到的cDNA模板、引物ENTV-2-F和引物ENTV-2-R、SYBR GreenI Mix、ddH₂O，所述阴性对照为双蒸水。

5.根据权利要求4所述的诊断试剂盒，其特征在于：所述重组质粒为pMD18-ENTV-2。

6.根据权利要求4所述的诊断试剂盒，其特征在于：所述引物ENTV-2-F和引物ENTV-2-R的摩尔比为1:1。