CN108048603A - 一种k亚群禽白血病病毒检测试剂盒 - Google Patents

一种k亚群禽白血病病毒检测试剂盒 Download PDF

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CN108048603A CN201810074475.3A CN201810074475A CN108048603A CN 108048603 A CN108048603 A CN 108048603A CN 201810074475 A CN201810074475 A CN 201810074475A CN 108048603 A CN108048603 A CN 108048603A
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陈建
严立福
郑晓翠
廖明
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    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
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Abstract

本发明公开了一种K亚群禽白血病病毒检测试剂盒，涉及病毒荧光定量PCR检测技术领域。本发明的试剂盒含有1对特异性引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.2‑3所示。本发明试剂盒使用方法简单、成本低廉，反应结果易于观察，灵敏度高、特异性强，可快速地检测K亚群禽白血病病毒，非常适用于疾病监测、现场应急以及临床标本的检测，适合大范围推广应用。

Description

一种K亚群禽白血病病毒检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测K亚群禽白血病病毒的靶序列、荧光定量PCR引物，本发明还涉及利用该靶序列进行K亚群禽白血病病毒检测的方法和试剂盒。
背景技术
目前，针对禽白血病的防控与治疗没有有效的的疫苗和药物，国内外对禽白血病病毒(ALV)的控制主要是定期对种鸡进行ALV抗原检测，淘汰带毒阳性鸡，以达到彻底清除ALV的目的。K亚群禽白血病病毒(ALV-K)是近几年新发现的一种新亚型禽白血病病毒，其致瘤能力弱，体内外复制能力弱。但是，禽白血病病毒易突变，其潜在的威胁同样不能忽视，所以对ALV-K的检测及净化是势在必行的。对于ALV的检测，常用方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光实验(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)及荧光定量RT-PCR等，其中ELISA检测有商品化的抗原检测试剂盒，其操作方便、稳定性好、特异性强，是净化ALV最常用的检测方法。但是其针对ALV的保守蛋白P27，不能用于区分所检ALV所属亚群，尤其是不能排除内源性ALV的干扰。IFA检测需要细胞培养技术作为支撑，对检测人员专业能力要求严格。PCR和LAMP操作简便，灵敏性高，但其不能用于病毒基因的病毒载量结果的定量，而且检测结果存在一定的假阳性干扰。RT-PCR技术已经广泛用于ALV-A/B/J的检测，其灵敏性高，稳定性好，特异性强，常用于病毒基因的检测及病毒载量的定量。
虽然荧光定量PCR检测技术非常成熟，但是针对ALV-K病毒的荧光定量检测方法鲜有报道，原因主要是ALV-K核苷酸序列与禽白血病病毒(ALV)其他亚群的核苷酸同源性非常高，不利于选择特异性目标靶序列，例如ALV-K全长核苷酸序列与内源性禽白血病病毒(ALV-E)全长核苷酸序列同源性在93.7％-97.5％之间，两个亚群之间囊膜蛋白基因env仅有166bp左右的序列存在明显差异，其次，ALV-K国外分离株及国内不同地区分离株之间gp85基因的同源性在94.5％-99.9％不等，这进一步缩小了引物设计的序列可选择空间，导致ALV-K保守序列可供选择的空间较小，筛选难度较大，而在引物设计方面，几个碱基的差别会极大程度上影响引物的特异性，进而导致检测结果的不准确。为了丰富ALV-K的检测手段，并对ALV-K的感染进行定量，亟须设计并筛选出一对灵敏性好、特异性强的引物用于ALV-K的检测和定量，以加快禽白血病的净化进程。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的特异性靶序列；本发明的还在于提供上述靶序列的用途，以提高对K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的检测能力。
为实现上述目的，通过对本实验室分离到的16株K亚群禽白血病病毒(ALV-K)和NCBI数据库已报道的(ALV-K)序列比对，通过BLAST软件进行序列同源性分析，找到特异性的保守靶序列，发现了核苷酸完全保守区域，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该靶序列是检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段也可以作为检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的遗传标记物。
进一步，本发明还提供用于特异性扩增上述靶序列的引物。本发明的引物不但适用于已报道的国外ALV-K扩增还适用于国内ALV-K扩增检测。
在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为：
F1:5'-CAGACAGGTTCTCGCTTCCG-3'，
R1:5'-CCATATACCTCCTGTGCGTGT-3。
本发明提供一种K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总DNA为模板，以上述遗传标记物为靶序列，利用本发明提供的引物进行实时荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。
在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否则试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
Ct值小于35的标本为阳性结果；
Ct值大于等于35的标本为阴性结果；
本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为20μl反应体系时，其优选配置为：10μM的上游引物0.5μL，10μM的下游引物0.5μL，2×iTaq Universal SYBR Green Supermix10μL，cDNA模板1μL，RNase free H2O 8μL。
本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性3min；95℃15s、60℃34s，40个循环，每个循环60℃时收集荧光；95℃15s、60℃1min，95℃15s。
本发明每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用：
有效扩增：NTC(－)并且POS(+)
无效扩增：NTC(+)并且POS(+)提示体系污染
无效扩增：NTC(－)并且POS(－)提示体系错误或者试剂失效。
只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否则试验需要重复。
本发明提供了一种用于检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的试剂盒，其包括上述特异性引物对。
本发明试剂盒的引物序列如SEQ ID NO.2-3所示。
本发明试剂盒的工作程序为：95℃预变性3min；95℃15s、60℃34s，40个循环，每个循环60℃时收集荧光；95℃15s、60℃1min，95℃15s；该试剂盒中20μL的反应体系为10μM的上游引物0.5μL，10μM的下游引物0.5μL，2×iTaq Universal SYBR Green Supermix10μL，cDNA模板1μL，RNase free H2O 8μL。
该试剂盒可用于检测K亚群禽白血病病毒，若待测样品Ct值大于或等于35时，则待测样品中K亚群禽白血病病毒为阴性。
本发明提供了用于检测ALV-K保守区域靶序列，以及以该序列为基础设计的引物，具有较强的特异性和灵敏度，最低检测限为25拷贝/μL；运用该方法进行组内和组间实验，其变异系数低于1.95％。利用本发明提供的特异性引物引物进行ALV-K的荧光定量PCR检测方法进一步简化ALV-K的检测的程序、缩短检测周期，可作为检测临床标本的手段，提高ALV-K检测的阳性率，用于净化养殖场ALV-K。本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、阴性阳性对照，该试剂盒的推广应用有利于快速、准确地鉴定ALV-K。另一方面，相对于有探针的荧光定量PCR方法，本发明基于SEQ ID NO.2-3建立的荧光定量PCR检测方法无需与探针配合使用就能够高效特异灵敏地检测ALV-K，极大地降低了成本和操作繁琐度。
附图说明
图1是筛选的四对引物P1、P2、P3、P4运用ABI7500上机检测的溶解曲线(上图)和扩增曲线(下图)结果，P2/K和P2/E分别是引物P2对ALV-K和ALV-E的扩增曲线。
图2是1％琼脂糖凝胶电泳检测荧光定量PCR引物灵敏性结果，条带大小为84bp，1-8为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL，9为阴性对照，M为Marker DS2000。
图3是1％琼脂糖凝胶电泳检测常规PCR引物灵敏性结果，条带大小为1214bp，1-8为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL，9为阴性对照，M为Marker 2。
图4是荧光定量PCR扩增动力学梯度曲线，1-8为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL。
图5是荧光定量PCR标准曲线分析图。
图6是溶解曲线分析图。
图7是荧光定量PCR特异性结果，1是ALV-K，2是阴性对照，3是NDV，4-9分别是AIV、MDV、ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-E。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
1、荧光定量PCR引物的设计
根据禽白血病病毒(ALV)宿主范围、病毒囊膜干扰特性、交叉中和反应类型以及基因组的分子特征，可将禽白血病病毒(ALV)划分为A～K共11个亚群，其中鸡源ALV有A、B、C、D、E、J和新发K亚群7个亚群，其他各亚群核苷酸序列与ALV-K核苷酸序列之间有不同程度的同源性，其中以内源性禽白血病病毒(ALV-E)与ALV-K核苷酸序列同源性最高(93.7％-97.5％)，仅在gp85区域存在两部分差异较大的核苷酸序列(区域1：5836-5925长度77bp，区域2：6039-6116bp长度89bp)。为了排除ALV-E及其他亚群的干扰，参考分离到的多株ALV-K的序列，利用软件Oligo 7和DNAstart在病毒囊膜蛋白基因gp85区域差异较大的两部分内设计并合成了四对引物，这四对引物针对的靶序列相同，但引物序列稍有不同，分别是：
P1:F1:5'-CAGACAGGTTCTCGCTTCCG-3'
R1:5'-CCATATACCTCCTGTGCGTGT-3'；
P2:F2:5'-CTCCGCCGCAACTACAGAA-3'
R1:5'-CGGAAGCGAGAACCTGTCTG-3'；
P3:F3:5'-CACAGACAGGTTCTCGCTTC-3'
R3:5'-CATATACCTCCTGTGCGTGT-3'；
P4:F4:5'-TCCACTGCCGCAACTCAC-3'
R4:5'-GCGGAAGCGAGAACCTGT-3'；
通过试验评估四对引物的特异性、稳定性和灵敏性，最终筛选出一对特异性最好的引物P1，见图1，扩增长度为84bp；
根据图1可知，引物P3和P4对ALV-K的溶解曲线形状不符合正常溶解曲线走向，且引物P3有双峰出现；引物P1和P2均有符合要求的溶解曲线出现，但是引物P2对ALV-E有扩增曲线出现，未能排除ALV-E的干扰；并且可以看到引物P1与P3的序列仅存在几个核苷酸差别，但扩增效果差别很大，因此本发明以引物P1为最佳引物对；
2、病毒核酸的提取
将ALV-K标准毒株GDFX0601(GenBank:KP686142)感染的细胞反复冻融三次之后，离心取细胞沉淀，用DNA提取试剂盒提取细胞总DNA，所获得的DNA置于-20℃备用。
3、常规PCR扩增方法的建立
以步骤2制得的ALV-K病毒DNA为模板，用特异性引物F1和R1进行扩增，扩增片段长度为84bp，扩增体系为50μL；PCR反应体系如下：2xTaq PCR Master Mix 25μL，上下游引物F1和R1各1μL，DNA模板1μL，dd H2O 22μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸8min；将扩增的PCR产物，在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，在84bp左右的位置呈现一条独立明亮的条带(图2)，与预期大小一致，回收纯化PCR产物；
4、阳性质粒标准品的制备
将步骤(3)回收的PCR产物与pMD18-T载体16℃进行连接，命名重组质粒为pMD18-T-K；转化DH5α感受态细胞，在氨苄抗性平板上筛选阳性克隆子；经PCR鉴定的阳性单菌落，用质粒小提试剂盒提取重组质粒；质粒送上海英潍捷基公司测序，做进一步鉴定；重组质粒测序结果与GenBank发表的GDFX0601序列完全一致，表明重组质粒pMD18-T-K构建成功；测得所述重组质粒浓度为76.0ng/μL，经计算为2.5×1010拷贝/μL。
实施例2常规PCR灵敏性实验
将实施例1所得的阳性质粒用dd H2O依次进行10倍梯度稀释，其中泳道1-8为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL，泳道9为阴性对照，按照实施例1所述体系和程序进行扩增，结果如图2所示，条带大小为84bp；
将常规PCR阳性质粒用dd H2O依次进行10倍梯度稀释，其中1-8为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL，9为阴性对照，按照常规PCR体系和程序进行扩增，结果如图3所示，条带大小为1214bp；根据图2结果可知，用荧光定量PCR引物进行常规PCR反应，最低可检测到104拷贝/μL。
根据图3结果可知，用常规PCR引物方法进行灵敏性实验，最低可检测到103拷贝/μL的阳性质粒样品，即常规PCR灵敏性可达到103拷贝/μL。
实施例3荧光定量PCR灵敏性实验
将实施例1制得的阳性质粒用dd H2O依次进行10倍梯度稀释，其中1-8为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL，将所述稀释好的阳性质粒标准品进行荧光定量PCR反应，20μL的反应体系为10μM的上游引物0.5μL，10μM的下游引物0.5μL，2×iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10μL，cDNA模板1μL，RNase free H2O 8μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃15s、60℃34s，40个循环，每个循环60℃时收集荧光；95℃15s、60℃1min，95℃15s。并制作动力学曲线，结果如图4所示。
根据图4结果可知，荧光定量PCR进行灵敏性检测，最低可检测到101拷贝/μL的阳性质粒样品，及荧光定量PCR检测灵敏度可达到2.5×101拷贝/μL。
实施例4荧光定量PCR标准曲线的建立
将实施例1制得的阳性质粒用dd H2O依次进行10倍梯度稀释，其中1-8为108、107、106、105、104、103、102、101拷贝/μL，将所述稀释好的阳性质粒标准品进行荧光定量PCR反应，并制作动力学曲线、标准曲线和溶解曲线。结果如图4、图5和图6所示。
荧光定量反应体系为10μM的上游引物0.5μL，10μM的下游引物0.5μL，2×iTaqUniversal SYBR Green Supermix 10μL，阳性质粒模板1μL，RNase free H2O 8μL；
荧光定量反应程序为95℃预变性3min，95℃15s、60℃34s，40个循环，每个循环60℃时收集荧光，95℃15s、60℃1min，95℃15s；
标准曲线方程：y＝-3.21x+33.65。R2＝0.999，扩增效率＝1.05。
由动力学曲线可知，指数增长期曲线平行，扩增效率相近；由标准曲线方程可知阳性质粒浓度梯度与Ct值呈线性关系，R2＝0.999，线性关系良好；由溶解曲线可知，各梯度溶解曲线对应同一温度。实施例5荧光定量PCR特异性实验
对所建立的荧光定量PCR进行特异性试验，检测NDV、AIV、MDV、ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-E同时设置阴性对照和阳性对照，结果如图7所示；
根据图7结果可知，所建立的方法除对ALV-K有特异性荧光信号外，对其他样品均无荧光信号产生，其中，对阴性对照和NDV在Ct值大于35扩增判为阴性，表明所建立的方法有良好的特异性。实施例6荧光定量PCR稳定性实验
对人工感染ALV-K的3只90日龄SPF鸡肝脏样品进行荧光定量PCR检测，进行组内和组间实验，统计结果的平均值、标准差、变异系数(％)，以评估所建立方法的稳定性。结果如表1所示；
表1肝脏样品荧光定量PCR组内实验和组间实验
根据表1结果可知，组内和组间实验变异系数均小于1.95％，表明所建方法有较好的稳定性，保证了检测结果的可重复性和可信度。
实施例6临床血浆样品的检测
临床血浆样品分离血清，感染细胞，ELISA检测上清；对判为阳性的86份细胞样品的沉淀提取细胞总DNA，用所建立的荧光定量PCR方法进行检测，最终确认10份样品为ALV-K，这一结果经过最终测序验证完全正确；而且，该方法确认的阳性样品数高于常规PCR的8份样品，表明申请方法检测结果的可靠性，同时其灵敏性高于常规PCR方法。
由以上实施例可以得出，申请方法具有良好的灵敏性、特异性和稳定性，且其耗时短、成本低及可用于定量；申请方法和试剂盒丰富了ALV-K的检测手段，同时为加快禽白血病的净化提供了理论依据和技术支持。
上文虽然已对本发明以及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对相应的条件等做一些改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种K亚群禽白血病病毒检测试剂盒
<130> YRI20180007
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cagacaggtt ctcgcttccg ctgtgggcgc gtgcctgtcg ggggcctccc tgagaccggg 60
tgcacacgca caggaggtat atgg 84
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cagacaggtt ctcgcttccg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccatatacct cctgtgcgtg t 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctccgccgca actacagaa 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggaagcgag aacctgtctg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacagacagg ttctcgcttc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catatacctc ctgtgcgtgt 20
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccactgccg caactcac 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcggaagcga gaacctgt 18

Claims (10)

1.一种用于检测K亚群禽白血病病毒的遗传标记物，其具有SEQ ID NO.1所示的序列或其特异性片段。
2.用于扩增权利要求1所述遗传标记物的特异性引物。
3.根据权利要求2所述的特异性引物，其核苷酸序列为：
F1:5'-CAGACAGGTTCTCGCTTCCG-3'，
R1:5'-CCATATACCTCCTGTGCGTGT-3。
4.含有权利要求2或3所述的特异性引物的检测试剂盒。
5.含有权利要求2或3所述的特异性引物的试剂盒。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的工作程序为：95℃预变性3min；95℃ 15s、60℃ 34s，40个循环，每个循环60℃时收集荧光；95℃15s、60℃1min，95℃15s；该试剂盒中20μL的反应体系为10μM的上游引物0.5μL，10μM的下游引物0.5μL，2×iTaqUniversal SYBR Green Supermix 10μL，cDNA模板1μL，RNase free H2O 8μL。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒可用于检测K亚群禽白血病病毒，若待测样品Ct值大于或等于35时，则待测样品中K亚群禽白血病病毒为阴性。
8.一种K亚群禽白血病病毒的检测方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，以权利要求1所述的遗传标记物为靶序列，利用权利要求2或3所述的引物进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。
9.如权利要求8所述的K亚群禽白血病病毒的检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的20μL的反应体系为10μM的上游引物0.5μL，10μM的下游引物0.5μL，2×iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10μL，cDNA模板1μL，RNase free H2O 8μL。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性3min；95℃ 15s、60℃ 34s，40个循环，每个循环60℃时收集荧光；95℃ 15s、60℃ 1min，95℃ 15s。
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