CN110628944A - 鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒 - Google Patents

鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的特异性引物，包括用于检测鸭3型腺病毒的检测引物DAdV3‑1/DAdV3‑2，和用于检测鸭新型呼肠孤病毒的检测引物NDRV‑7/NDRV‑8，如SEQ ID NO.1‑4所示。一种鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，包括上述特异性引物，以及阳性质粒。一种鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的方法：提取待测样品的基因组，利用特异性引物进行扩增，对扩增产物进行电泳并观察有无扩增条带，从而作出判断。本发明对两种病毒核酸的最低检出量均低于10pg，且对其他常见鸭病毒均检不出，具有敏感性高、特异性好等优点。

Description

鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及一种鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，属于生物检测技术领域。
背景技术
鸭腺病毒(Duck adenovirus，DAdV)目前有1型、2型和3型三种不同的流行株。1型鸭腺病毒，又称为产蛋下降综合征病毒，于1976年首次发生在荷兰，主要引起蛋鸡产蛋下降，鸭群感染主要表现为呼吸道症状；2型鸭腺病毒首次报道于法国，主要感染番鸭，临床表现为消瘦、跛行；3型鸭腺病毒(DAdV3)2014年开始发生于我国南方地区，主要感染番鸭，临床表现为消瘦、跛行，剖检肝脏肿胀、坏死、发白，脾脏坏死，多发于2-3周龄的番鸭。鸭新型呼肠孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)感染是近几年发生的一种严重危害我国养鸭业的新型疾病。该病可感染番鸭、樱桃谷鸭、麻鸭等不同品种的鸭，以2周龄内的雏鸭感染最为常见，也最为严重，容易继发细菌感染，死亡率可达20％。病鸭主要表现为生长发育迟缓、蹲窝、跛行等，剖检以肝脾坏死为主。
鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒均可感染番鸭，是生产中常见的鸭病，两者在发病日龄、临床症状、剖检病变等方面较为相似，临床上较难区分，给这两种疾病的防治带来了很大困难。因此生产中迫切需要一种快速鉴别这两种疾病的方法，以提高疾病治疗的针对性。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，以快速鉴别这两种病毒。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种用于鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的特异性引物，包括用于检测鸭3型腺病毒的检测引物DAdV3-1/DAdV3-2，和用于检测鸭新型呼肠孤病毒的检测引物NDRV-7/NDRV-8；所述检测引物DAdV3-1/DAdV3-2的核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示，其扩增片段大小为516bp；
DAdV3-1：5'-TTCTTCAGGCGCTATGTCTG-3'(SEQ ID NO.1)；
DAdV3-2：5'-ATGGAAGCCTTGTCAAGCC-3'(SEQ ID NO.2)。
所述检测引物NDRV-7/NDRV-8核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示，其扩增片段大小为196bp；
NDRV-7：5'-ATGTCGCTGTCACGGGTAA-3'(SEQ ID NO.3)；
NDRV-8：5'-TGGTAGGAACCACGCTCAA-3'(SEQ ID NO.4)。
所述特异性引物在制备鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒中的应用。
一种鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，包括上述用于鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的特异性引物，以及阳性质粒，还包括PCR反应所必需的试剂；所述阳性质粒为重组质粒T-DAdV3和T-NDRV。
进一步地，所述试剂盒以100次用量计，包括如下组分：RT-PCR反应液体系4800μL，阳性质粒200μL；所述RT-PCR反应液中含有上述用于鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的特异性引物；所述阳性质粒为终浓度均为0.1ng/μL的重组质粒T-DAdV3和T-NDRV的混合物。
进一步地，所述RT-PCR反应液体系由括如下组分组成：
所述重组质粒T-DAdV3或T-NDRV，可按如下方法制备得到：提取DAdV3或NDRV病毒核酸，并利用引物DAdV3-1/DAdV3-2、或NDRV-7/NDRV-8进行PCR和RT-PCR扩增目的条带，回收目的条带，与载体pMD18-T相连接，转化至DH5α感受态细胞，并提取质粒，PCR鉴定阳性后送测序；取序列正确的质粒标记为T-DAdV3或T-NDRV，分别作为DAdV3、NDRV的阳性对照。
所述DAdV3阳性PCR扩增的反应体系(50μL)由如下组分组成：ddH2O 38.5μL、10×PCR缓冲液5μL、2.5mM dNTP 3μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、20pmol/μL上下游引物各0.5μL、样品核酸2μL。
所述DAdV3阳性PCR扩增的反应程序为：95℃ 5min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸30sec，共30个循环；72℃延伸5min。
所述NDRV阳性RT-PCR扩增的反应体系(50μL)由如下组分组成：DEPC处理水22μL、2×One Step RT-PCR mix 25μL、20pmol/μL上下游引物各0.5μL、样品核酸2μL。
所述NDRV阳性RT-PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min、94℃变性2min；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min。
所述鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒在鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒中的应用。
一种鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的方法，包括如下步骤：
(1)样品核酸提取：取200μL待测病料匀浆液，利用病毒核酸提取试剂盒提取样品核酸，备用；
(2)RT-PCR反应：利用特异性引物DAdV3-1/DAdV3-2和NDRV-7/NDRV-8对待测样品进行RT-PCR扩增；
进一步地，RT-PCR扩增的条件为：取RT-PCR反应液48μL，样品核酸2μL，混匀后按下面的程序进行RT-PCR反应：50℃反转录30min、94℃变性2min；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min；
(3)阳性对照：利用特异性引物DAdV3-1/DAdV3-2和NDRV-7/NDRV-8对阳性质粒进行RT-PCR扩增；
进一步地，RT-PCR扩增的条件为：取RT-PCR反应液48μL，加入阳性质粒2μL，混匀后按下面的程序进行反应：50℃反转录30min、94℃变性2min；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min；
(4)阴性对照：以DEPC处理水为阴性对照；
进一步地，RT-PCR扩增的条件为：取RT-PCR反应液48μL，加入DEPC处理水2μL，混匀后按下面的程序进行反应：50℃反转录30min、94℃变性2min；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min；
(5)电泳观察：取上述样品PCR产物、阳性对照产物和阴性对照产物，进行琼脂糖凝胶电泳，并观察：在阴、阳性对照成立的条件下，若出现516bp的单一条带，可判定为鸭3型腺病毒阳性；若出现196bp的单一条带，可判定为鸭新型呼肠孤病毒阳性；若同时出现516bp和196bp的条带，则判定为两者混合感染；若516bp和196bp的条带均无，则判定为鸭3型腺病毒阴性、鸭新型呼肠孤病毒阴性。
本发明通过将GenBank中已经登录的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒所有基因序列与本试验室分离毒株基因序列进行比对，根据保守区域各设计了5对引物，利用阳性病毒通过大量试验对这些引物的敏感性、特异性、使用浓度、配合使用比例等多方面进行比对筛选，最终筛选的这两对特异性引物具有良好的特异性和敏感性，并且不相互影响，能在同一个体系中快速地鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒这两种在生产中难以区分的病毒单独感染或是混合感染，在临床上尚属首次报道，并具有省时、省力、成本低等优点，具有重要的应用价值。
本发明的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，对两种病毒核酸的最低检出量均低于10pg，且对其他常见鸭病毒病均检不出，具有敏感性高、特异性好等优点。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：本发明试剂盒的特异性检测结果；其中，M为DNA Marker DL2000，1-13所对应的病毒分别为鸭新型呼肠孤病毒、鸭3型腺病毒、鸭新型呼肠孤病毒和鸭3型腺病毒混合物、A型鸭甲肝病毒、C型鸭甲肝病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒、肉鸭细小病毒、鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭副粘病毒、产蛋下降综合征病毒和阴性对照。
图2：本发明试剂盒对于鸭3型腺病毒的敏感性检测结果；其中，M为DNA MarkerDL2000，1-7所对应的病毒DNA的含量分别为4.5ng、450pg、45pg、4.5pg、0.45pg、0.045pg、0.0045pg。
图3：本发明试剂盒对于鸭新型呼肠孤病毒的敏感性检测结果；其中，M为DNAMarker DL2000，1-7所对应的病毒DNA的含量分别为9.2ng、920pg、92pg、9.2pg、0.92pg、0.092pg、0.0092pg。
图4：本发明试剂盒对于鸭3型腺病毒的重复性试验；其中，M为DNA MarkerDL2000，1-3所对应的为三次重复检测结果。
图5：本发明试剂盒对于鸭新型呼肠孤病毒的重复性试验；其中，M为DNA MarkerDL2000，1-3所对应的为三次重复检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1检测引物的设计
通过将GenBank中已经登录的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒所有基因序列与本试验室分离毒株基因序列进行比对，根据保守区域各设计了5对引物。
用于检测鸭3型腺病毒的5对引物序列如下：
DAdV3-1(上游引物)：5'TTCTTCAGGCGCTATGTCTG 3'；
DAdV3-2(下游引物)：5'ATGGAAGCCTTGTCAAGCC 3'；
扩增片段大小516bp。
DAdV3-3(上游引物)：5'TCTTCAGATGGGTCCACAA 3'；
DAdV3-4(下游引物)：5'TGTTGGCCACCTCACCG 3'；
扩增片段大小523bp。
DAdV3-5(上游引物)：5'GACTTGACGACGGCTACG 3'；
DAdV3-6(下游引物)：5'ACTTGACCCTTGGTTTGG 3'；
扩增片段大小543bp。
DAdV3-7(上游引物)：5'CACCTCAACAAGGAGCACAA 3'；
DAdV3-8(下游引物)：5'CGGAGCTAAAGGGAATGGT 3'；
扩增片段大小630bp。
DAdV3-9(上游引物)：5'CTTTCAACCTGGTGGAGAAC 3'；
DAdV3-10(下游引物)：5'TCAAGCCGTAAATCGTTCC 3'；
扩增片段大小558bp。
用于检测鸭新型呼肠孤病毒的5对引物序列如下：
NDRV-1(上游引物)：5'GAGACGCCTGACTACGATTA 3'；
NDRV-2(下游引物)：5'GGAGATGCTTGGAGTGAGA 3'；
扩增片段大小372bp。
NDRV-3(上游引物)：5'TTGTCTCCGATCCTCTCCG 3'；
NDRV-4(下游引物)：5'TCTTTGAAAGCTATGTCAGCC 3'；
扩增片段大小302bp。
NDRV-5(上游引物)：5'TCATTCATTTGGGCAGCGG 3'；
NDRV-6(下游引物)：5'AGTAGTGTGTAAAGCATGGACT 3'；
扩增片段大小226bp。
NDRV-7(上游引物)：5'ATGTCGCTGTCACGGGTAA 3'；
NDRV-8(下游引物)：5'TGGTAGGAACCACGCTCAA 3'；
扩增片段大小196bp。
NDRV-9(上游引物)：5'GTGATGCTGCCGAGATGA 3'；
NDRV-10(下游引物)：5'CGTGAGCCGAAGGATGTA 3'；
扩增片段大小184bp。
通过大量试验对这些引物的敏感性、特异性、使用浓度、配合使用比例等多方面进行比对筛选(这些实验结果量非常大)，最终各筛选了1对最佳引物，用于鸭3型腺病毒和鸭新型呼肠孤病毒的检测，如下：
用于检测鸭3型腺病毒的引物记为DAdV3-1/DAdV3-2，扩增片段大小为516bp，其序列结构如下所示：
DAdV3-1(上游引物)：5'-TTCTTCAGGCGCTATGTCTG-3'；
DAdV3-2(下游引物)：5'-ATGGAAGCCTTGTCAAGCC-3'。
用于检测鸭新型呼肠孤病毒的引物记为NDRV-7/NDRV-8，扩增片段大小为196bp，其序列结构如下所示：
NDRV-7(上游引物)：5'-ATGTCGCTGTCACGGGTAA-3'；
NDRV-8(下游引物)：5'-TGGTAGGAACCACGCTCAA-3'。
虽然本发明的引物是通过软件设计得到的，然而保守区域的选择是发明人经过对比后得出的，付出了创造性劳动。且引物设计的原则是由发明人根据保守区域的特点(比如碱基分布比例)所设定的(比如引物长度)。通过设计软件得到若干组引物后，这些引物的特异性如何、灵敏度如何，是无法预知的(设计软件在设计引物时，是不会考虑特异性、灵敏度的平衡的)，其仅能作为一个参考，以协助发明人初步确定引物设计的大致位置，但要想得到特异性强、灵敏度高的引物(引物的长度越长，特异性越高，但是灵敏度越低；引物的长度越短，灵敏度越高，但特异性越差；这两方面需要有一个平衡点)，需要发明人付出创造性劳动，进行大量的、繁复的设计、筛选和验证工作，选择合适长度的引物，以实现特异性和灵敏度的统一。因此，设计软件所起到的作用是辅助，要想得到成熟的可实际应用的引物和探针，需要发明人付出创造性劳动。
实施例2双重RT-PCR的特异性
按照病毒核酸提取试剂盒说明分别提取鸭新型呼肠孤病毒、鸭3型腺病毒、鸭新型呼肠孤病毒和鸭3型腺病毒混合物、A型鸭甲肝病毒、C型鸭甲肝病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒、肉鸭细小病毒、鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭副粘病毒和产蛋下降综合征病毒的核酸，并以此为模板分别进行RT-PCR反应。
各病毒核酸的RT-PCR反应体系(50μL)包括：DEPC处理水21μL、2×One Step RT-PCR mix 25μL、20pmol/μL引物DAdV3-1 0.5μL、20pmol/μL引物DAdV3-2 0.5μL、20pmol/μL引物NDRV-7 0.5μL、20pmol/μL引物NDRV-8 0.5μL、样品核酸2μL。
反应程序为：50℃反转录30min、94℃变性2min；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min。
反应结束后，取5μL PCR产物加入1.5℅琼脂糖凝胶中进行电泳观察，结果如图1所示。可见，本发明所述鉴别诊断方法能从鸭3型腺病毒中扩增出大小516bp的单一条带，从鸭新型呼肠孤病毒中扩增出大小196bp的单一条带，从鸭3型腺病毒和鸭新型呼肠孤病毒混合物中扩增出大小516bp和196bp两条条带，而从A型鸭甲肝病毒、C型鸭甲肝病毒、番鸭呼肠孤病毒、番鸭细小病毒、肉鸭细小病毒、鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭副粘病毒和产蛋下降综合征病毒中扩增不出任何条带。
实施例3双重RT-PCR的敏感性
按照病毒DNA提取试剂盒说明提取纯化后鸭3型腺病毒的核酸，按照病毒RNA提取试剂盒说明提取纯化后鸭新型呼肠孤病毒的核酸，利用分光光度计分别测定DNA和RNA的含量，并进行10倍稀释，利用上述反应体系和条件进行RT-PCR扩增，反应结束后，各取5μL所述RT-PCR产物加入1.5℅琼脂糖凝胶中进行电泳观察，结果分别如图2、图3所示。可见，鸭3型腺病毒DNA的最低检出量为4.5pg，鸭新型呼肠孤病毒RNA的最低检出量为9.2pg。
实施例4双重RT-PCR的重复性
利用上述RT-PCR方法分别对鸭3型腺病毒和鸭新型呼肠孤病毒阳性的病料进行扩增，各重复三次，确定其重复性，结果如图4、图5所示。可见，经三次重复均能扩增出目的条带，且条带的亮度基本一致。
实施例5鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒感染的试剂盒
本实施例所述鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒感染的试剂盒，以100次使用剂量计，包括以下成分：
(1)RT-PCR反应液4800μL，具体包括：
(2)阳性质粒：重组质粒T-DAdV3和T-NDRV混合物200μL，各重组质粒的终浓度均为0.1ng/μL；
所述重组质粒T-DAdV3和T-NDRV的详细制备方法如下：
按照病毒核酸提取试剂盒提取DAdV3和NDRV的核酸，并分别利用引物DAdV3-1/DAdV3-2、NDRV-7/NDRV-8进行PCR和RT-PCR扩增目的条带，反应条件如下：
DAdV3扩增的反应体系(50μL)包括如下组分：
ddH2O 38.5μL、10×PCR缓冲液5μL、2.5mM dNTP 3μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、20pmol/μL上下游引物各0.5μL、样品核酸2μL；
所述PCR扩增的反应程序为：95℃ 5min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸30sec，共30个循环；72℃延伸5min。
NDRV扩增步骤的反应体系(50μL)包括如下组分：
DEPC处理水22μL、2×One Step RT-PCR mix 25μL、20pmol/μL上下游引物各0.5μL、样品核酸2μL。
所述RT-PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min、94℃变性2min；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min。
回收目的条带，与载体pMD18-T相连接，转化至DH5α感受态细胞，并提取质粒，PCR鉴定阳性后送测序；取序列正确的质粒标记为T-DAdV3和T-NDRV，分别作为DAdV3和NDRV的阳性对照。
分别测定重组质粒T-DAdV3和T-NDRV的浓度，均稀释成0.2ng/μL，等量混合，终浓度均为0.1ng/μL。
实施例6利用试剂盒鉴别鸭3型腺病毒和鸭新型呼肠孤病毒感染的具体操作
本实施例所述鉴别鸭3型腺病毒和鸭新型呼肠孤病毒感染的方法，利用实施例5所述的试剂盒进行，具体操作步骤如下：
(1)样品核酸提取：取200μL待测病料匀浆液，按照病毒DNA/RNA共提取试剂盒说明提取病毒核酸，备用；
(2)RT-PCR反应：取试剂盒中的RT-PCR反应液48μL，加入样品核酸2μL，混匀后按下面的程序进行反应：50℃反转录30min、94℃变性2min；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min。
(3)阳性对照：取试剂盒中的RT-PCR反应液48μL，加入阳性质粒2μL，混匀后按上述反应程序进行扩增。
(4)阴性对照：取试剂盒中的RT-PCR反应液48μL，加入DEPC处理水2μL，混匀后按上述反应程序进行扩增。
(5)电泳观察：取5μL上述PCR产物加入1.5℅琼脂糖凝胶中进行电泳观察，在阴阳性对照成立的条件下，若出现大小516bp的条带，可判定为鸭3型腺病毒阳性；若出现大小196bp的条带，可判定为鸭新型呼肠孤病毒阳性；若大小516bp和196bp的条带均出现，可判定为鸭3型腺病毒和鸭新型呼肠孤病毒混合感染。
实施例7临床应用
本实施例临床应用检验的样品为不同时期不同鸭场送检的样品50份。应用本试剂盒和病毒分离鉴定法同时检测送检样品，横向比较两种方法的符合率情况。
结果显示，按照实施例6中步骤利用本试剂盒检出鸭3型腺病毒阳性病料为4份，阳性检出率为8％，而利用病毒分离法鉴定检出阳性病料3份，阳性检出率为6％，两种方法的符合率为98％(具体如下表2所示)。
表2试剂盒与病毒分离鉴定比较(DAdV3)
注：检出符合率＝(共同阳性数+共同阴性数)/总样品数×100％
结果显示，按照实施例6中步骤利用本试剂盒检出鸭新型呼肠孤病毒阳性病料为12份，阳性检出率为24％，而病毒分离鉴定检出阳性病料9份，阳性检出率为18％，两种方法的符合率为94％(具体如下表3所示)。
表3试剂盒与病毒分离鉴定比较(NDRV)
注：检出符合率＝(共同阳性数+共同阴性数)/总样品数×100％
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 山东省农业科学院家禽研究所
<120> 鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒
<140> 2019107272758
<141> 2019-08-07
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ttcttcaggc gctatgtctg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atggaagcct tgtcaagcc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgtcgctgt cacgggtaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
tggtaggaac cacgctcaa 19

Claims (10)

1.一种用于鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的特异性引物，包括用于检测鸭3型腺病毒的检测引物DAdV3-1/DAdV3-2，和用于检测鸭新型呼肠孤病毒的检测引物NDRV-7/NDRV-8；所述检测引物DAdV3-1/DAdV3-2的核苷酸序列如下所示：
DAdV3-1：5'-TTCTTCAGGCGCTATGTCTG-3'；
DAdV3-2：5'-ATGGAAGCCTTGTCAAGCC-3'；
所述检测引物NDRV-7/NDRV-8核苷酸序列如下所示：
NDRV-7：5'-ATGTCGCTGTCACGGGTAA-3'；
NDRV-8：5'-TGGTAGGAACCACGCTCAA-3'。
2.权利要求1所述的特异性引物在制备鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒中的应用，在鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒中的应用。
3.一种鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，包括权利要求1所述的用于鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的特异性引物，以及阳性质粒，还包括PCR反应所必需的试剂；所述阳性质粒为重组质粒T-DAdV3和T-NDRV。
4.根据权利要求3所述的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒以100次用量计，包括如下组分：RT-PCR反应液体系4800μL，阳性质粒200μL；所述RT-PCR反应液中含有权利要求1所述的用于鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的特异性引物；所述阳性质粒为终浓度均为0.1ng/μL的重组质粒T-DAdV3和T-NDRV的混合物。
5.根据权利要求4所述的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述RT-PCR反应液体系由括如下组分组成：
6.根据权利要求3或4所述的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述重组质粒T-DAdV3或T-NDRV，可按如下方法制备得到：提取DAdV3或NDRV病毒核酸，并利用引物DAdV3-1/DAdV3-2、或NDRV-7/NDRV-8进行PCR和RT-PCR扩增目的条带，回收目的条带，与载体pMD18-T相连接，转化至DH5α感受态细胞，并提取质粒，PCR鉴定阳性后送测序；取序列正确的质粒标记为T-DAdV3或T-NDRV，分别作为DAdV3、NDRV的阳性对照。
7.根据权利要求6所述的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒，其特征在于：所述DAdV3阳性PCR扩增的反应体系(50μL)由如下组分组成：ddH2O 38.5μL、10×PCR缓冲液5μL、2.5mM dNTP 3μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL、20pmol/μL上下游引物各0.5μL、样品核酸2μL；
或/和：所述DAdV3阳性PCR扩增的反应程序为：95℃5min预变性；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸30sec，共30个循环；72℃延伸5min；
或/和：所述NDRV阳性RT-PCR扩增的反应体系(50μL)由如下组分组成：DEPC处理水22μL、2×One Step RT-PCR mix 25μL、20pmol/μL上下游引物各0.5μL、样品核酸2μL；
或/和：所述NDRV阳性RT-PCR扩增的反应程序为：50℃反转录30min、94℃变性2min；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min。
8.权利要求3-7中任一项所述的鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒鉴别诊断试剂盒在鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒中的应用。
9.一种鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的方法，包括如下步骤：
(1)样品核酸提取：取200μL待测病料匀浆液，利用病毒核酸提取试剂盒提取样品核酸，备用；
(2)RT-PCR反应：利用特异性引物DAdV3-1/DAdV3-2和NDRV-7/NDRV-8对待测样品进行RT-PCR扩增；
所述特异性引物DAdV3-1/DAdV3-2和NDRV-7/NDRV-8的核苷酸序列如下所示：
DAdV3-1：5'-TTCTTCAGGCGCTATGTCTG-3'；
DAdV3-2：5'-ATGGAAGCCTTGTCAAGCC-3'；
NDRV-7：5'-ATGTCGCTGTCACGGGTAA-3'；
NDRV-8：5'-TGGTAGGAACCACGCTCAA-3'；
(3)阳性对照：利用特异性引物DAdV3-1/DAdV3-2和NDRV-7/NDRV-8对阳性质粒进行RT-PCR扩增；
(4)阴性对照：以DEPC处理水为阴性对照；
(5)电泳观察：取上述样品PCR产物、阳性对照产物和阴性对照产物，进行琼脂糖凝胶电泳，并观察：在阴、阳性对照成立的条件下，若出现516bp的单一条带，可判定为鸭3型腺病毒阳性；若出现196bp的单一条带，可判定为鸭新型呼肠孤病毒阳性；若同时出现516bp和196bp的条带，则判定为两者混合感染；若516bp和196bp的条带均无，则判定为鸭3型腺病毒阴性、鸭新型呼肠孤病毒阴性。
10.根据权利要求9所述的鉴别鸭3型腺病毒与鸭新型呼肠孤病毒的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，RT-PCR扩增的条件为：取RT-PCR反应液48μL，样品核酸2μL，混匀后按下面的程序进行RT-PCR反应：50℃反转录30min、94℃变性2min；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min；
所述步骤(3)中，RT-PCR扩增的条件为：取RT-PCR反应液48μL，加入阳性质粒2μL，混匀后按下面的程序进行反应：50℃反转录30min、94℃变性2min；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min；
所述步骤(4)中，RT-PCR扩增的条件为：取RT-PCR反应液48μL，加入DEPC处理水2μL，混匀后按下面的程序进行反应：50℃反转录30min、94℃变性2min；94℃变性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸20sec，共30个循环；72℃延伸5min。
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