CN117844983A - 一种鸽新城疫病毒快速检测试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于RT‑RAA和CRISPR/Cas12a的鸽新城疫病毒快速检测试剂盒及应用。该试剂盒包含重组聚合酶扩增RT‑RAA体系和CRISPR/Cas12a体系，其中，RT‑RAA体系中靶标DNA序列的RAA引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；CRISPR/Cas12a体系中的crRNA扩增引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。该体系检测敏感性高、特异性好、操作简单、检测时间短而且不需要复杂的仪器设备，适用于鸽新城疫病毒的快速、精准检测，可为鸽新城疫病毒流行病学的调查及鸽新城疫的有效防控提供重要技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及病毒快速检测技术领域，具体涉及一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的鸽新城疫病毒快速检测试剂盒及应用。
背景技术
鸽I型副黏病毒(Pigeonparamyxoviruses type 1，PPMV-1)又称鸽新城疫病毒，常引起鸽新城疫，是危害养鸽业的重要病原之一。PPMV-1是新城疫病毒(Newcastlediseasevirus，NDV)在适应鸽群后产生的抗原变异株，系统发育分析表明PPMV-1毒株存在遗传多样性，具有多个基因亚型。它能引起包括野鸽、家养鸽等鸟类发生感染，是危害鸽养殖业的重要疫病病原之一。PPMV-1可通过空气、污染物、排泄物等进行传播，鸽群四季均可发生感染，春冬季节发病率较高。PPMV-1有明显的宿主限制性，目前该毒株仅能从鸽群或野鸟中分离到，鸽群感染PPMV-1发病率和死亡率通常超过50％，幼鸽发病率和死亡率高于成年鸽，严重影响鸽产业的发展。因此，建立快速、精准的PPMV-1检测方法，对于鸽新城疫的防控具有重要意义。
CRISPR/Cas技术是近年来备受欢迎的基因编辑技术，目前已在小鼠、大肠杆菌和水稻等生物的基因组编辑研究中广泛应用。其中Cas12a蛋白(Cpf1)通过crRNA与DNA结合释放非特异性单链DNA酶活性，可用于核酸快速检测。重组酶介导的扩增技术(Recombinase-aid amplification，RAA)是使用了重组酶、单链DNA结合蛋白以及DNA聚合酶等多种酶在恒定温度下协同扩增的技术，可以实现高效的核酸扩增。侧向流层析试纸条(Lateral flowdipstick，LFD)是一种可视化观察扩增产物的端点检测技术，RAA扩增的双标记产物通过抗原抗体结合作用，在检测线位置形成“荧光素抗体-双标记核酸扩增产物-胶体金复合体”，几分钟内即可肉眼直接观察结果，便于现地快速检测。
目前针对新城疫的实验室诊断方法主要分为免疫学诊断和分子生物学诊断两大类，现有检测方法各有优势，但仍依赖于大型仪器设备和专业操作人员，极大地限制了其应用范围，因此急需开发出一种快速检测鸽新城疫病毒的产品和检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鸽新城疫病毒的快速检测试剂盒及其应用，检测快速、准确，为鸽新城疫病毒流行病学的调查及鸽新城疫的有效防控提供重要技术支撑。
为了达到上述目的，本发明提供了一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的鸽新城疫病毒快速检测试剂盒，该检测试剂盒包含RT-RAA体系和CRISPR/Cas12a体系；
其中，RT-RAA体系包含基于靶标DNA序列的RAA引物对，该RAA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；CRISPR/Cas12a体系包含核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的crRNA。
进一步地，上述的靶标DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步地，上述crRNA的扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步地，上述CRISPR/Cas12a体系还包括Cas12a蛋白、ssDNA报告探针和/或无核酸酶水；
其中，上述的ssDNA报告探针为5’-F-TTATTATT-Q-3’，F为荧光素，Q为荧光淬灭剂。
进一步地，上述CRISPR/Cas12a体系包含2μL的1μM Cas12a、1μL的100ng/μLcrRNA、2μL的Buffer、1μL的50U RNasin Inhibitor、13μL的RNase-free ddH2O和1μL的1μMssDNA。
本发明提供的检测试剂盒可用于以下任意一项中，包含鸽新城疫病毒检测、鸽新城疫病毒流行病学调查或/和鸽新城疫的防控。
本发明提供的用于鸽新城疫病毒的检测试剂盒，具有以下优点：
1.RAA-CRISPR-Cas12a检测鸽新城疫病毒检测限低至102拷贝/μL，具有较高的灵敏性。
2.RAA-CRISPR-Cas12a检测鸽新城疫病毒具有良好的特异性。该方法不与其他禽呼吸道病原禽流感病毒(AIV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)发生反应，具有很高的特异性。
3.RAA-CRISPR-Cas12a检测时间短。检测鸽新城疫病毒总花费时间为50分钟，可以满足快速、特异性的核酸检测需求。
4.不需要荧光定量PCR仪、PCR等贵重实验设备，恒温水浴条件下即可完成。
附图说明
图1为本发明中的crRNA体外转录电泳。
图2为本发明中的靶标DNA(NDV)的扩增电泳结果。
图3为本发明中CRISPR/Cas12a的顺式切割活性检测结果。
图4为本发明中CRISPR/Cas12a的反式切割活性检测结果。
图5为本发明中NDV-RAA引物对靶标DNA的扩增电泳结果。
图6为本发明中CRISPR/Cas12a敏感性检测分析结果。
图7为本发明中RAA-CRISPR/Cas12a特异性分析的荧光信号分析结果。
图8为本发明中RAA-CRISPR/Cas12a联用侧向流层析试纸条测试结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
说明：本发明中未具体说明的方法均为本领域的常规技术方法，未具体说明的试剂耗材等均为本领域常用的试剂耗材。
本发明欲基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a开发一种新城疫病毒检测体系，应用于PPMV-1的即时快速检测，具体包括如下：
实验例1crRNA与靶标DNA的引物设计及合成
从NCBI数据库中获取了28株NDV的全基因组序列，基因登录号分别为FJ436305.1、FJ436306.1、FJ794269.1、FJ986192.2、GU187941.1、GU978777.1、HQ717357.1、JF930146.1、JF950510.1、JN400896.1、JN800306.2、JN986837.1、KC853020.1、KJ920203.1、KM374060.1、KM885157.1、KP027403.1、KP742770.1、KP776462.1、KP861633.1、KR072665.1、KR732614.1、MG867723.1、MK796809.1、MN862498.1、MZ737133.1、NC_039223.1、FJ751919.1。利用BioEdit软件分别进行序列比对。根据CRISPR/Cas12对核苷酸的识别特性(5′-TTTN-3′)并结合基因组序列比对结果，在较为保守的L基因处选择了PAM序列。根据T7启动子、LbCas12a的scaffold序列以及靶序列(PAM序列后的20bp)设计互补的crRNA转录模板链，设计的crRNA转录模板链与靶标DNA的引物如下所示：
NDV-crRNA-F(SEQ ID NO.1)：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATTAGAATCAAATGATTTTGAT；
NDV-crRNA-R(SEQ ID NO.2)：
ATCAAAATCATTTGATTCTAATCTACACTTAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC；
NDV-Target DNA-F(SEQ ID NO.3)：
CCATGGGAAGAAGAATTCAGGT；
NDV-Target DNA-R(SEQ ID NO.4)：
CTCGAGTCATGATTGCGGTTT。
将合成的两条DNA单链(crRNA转录模板链)经变性后缓慢退火形成DNA双链，之后使用HiScribeTM T7 Quick High RNA Synthesis Kit(New England Biolabs，Massachusetts，USA，货号：E2050S)与柱式RNA快速浓缩纯化试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：B518688)分别进行体外转录与纯化，具体操作步骤如下：
1、crRNA合成
1)根据测量的DNA浓度，加入1μg退火后合成的DNA双链，并按下表1体外转录反应体系来准备所需试剂。
2)按照反应体系，将试剂放在冰上融化，混匀离心，按照表1的体系配制反应，充分混匀离心，最后采用封口膜封口，于37℃水浴锅内孵育4h。
表1 T7体外转录体系
3)向离心管内加入DNaseⅠ(消化去除体系内剩余的DNA)，于37℃水浴锅内孵育15min。
2、crRNA纯化
1)向待纯化的RNA溶液中加入9倍体积BufferA，充分混匀。
2)向上述溶液中加入1.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀。
3)将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液全部加至吸附柱中，12,000rpm室温离心30sec，倒掉收集管中废液。如果溶液总体积大于700μL，重复这一步直到所有的溶液通过吸附柱。
4)将吸附柱放回收集管中，加入700μL RPE Solution，于12,000rpm室温离心30sec，倒掉收集管中废液。
5)将吸附柱放回收集管中，加入300μL RPE Solution，于12,000rpm室温离心30sec，倒掉收集管中废液。
6)将吸附柱放回收集管中，10,000rpm离心2min。
7)将吸附柱放入新的RNase-free的1.5mL离心管中，吸附膜加入50μLDEPC-H2O，室温静置2min，12,000rpm离心1min，将所得到的RNA溶液置于-80℃保存或用于后续试验。为提高RNA得率，重复步骤7一次。纯化后吸取5μL RNA溶液+1μL 6×DNA上样缓冲液于PCR小管中充分混匀，1％琼脂糖凝胶120V电泳20min。
所得crRNA体外转录电泳图如图1所示，其中，泳道1为DL2000的Maker；泳道2为crRNA转录产物，结果表明crRNA体外转录成功，所得crRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。具体为(5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAGAAUCAAAUGAUUUUGAU-3’)
3、靶标DNA(NDV)的合成
将含有靶标DNA序列的质粒pET-32a(+)-NDV(生工生物工程(上海)股份有限公司合成)利用上述合成的NDV-Target DNA-F、NDV-Target DNA-R两条引物进行PCR产物扩增与回收。
其中，靶标DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)如下：
CCATGGGAAGAAGAATTCAGGTGTGTGGCCACGAGTCAAGATAGATACGATATATGGGAAGGTCATTGGGCAGCTACATGCTGACTCAGCAGAGATTTCACATGATGTCATGTTGAGAGAGTACAAAAGTTTATCTGCCCTTGAATTTGAGCCATGTATAGACTATGACCCTGTTACCAATCTAAGTATGTTCTTAAAAGACAAGGCAATCGCACATCCGAAAGATAACTGGCTCGCCTCATTTAGGCGGAACCTTCTCTCTGAGGACCAGAAGAAACAGGTAAAGGAGGCAACCTCAACTAACCGCCTCTTGATAGAGTTTTTAGAATCAAATGATTTTGATCCATATAAGGAGATGGAATACTTGACAACCCTTGAGTACCTAAGAGACGACAGTGTGGCGGTATCGTACTCACTCAAGGAGAAGGAGGTGAAGGTTAATGGGCGGATTTTTGCTAAGTTGACAAAGAGATTAAGAAACTGCCAGGTAATGGCAGAAGGGATTCTAGCCGACCAGATTGCACCTTTTTTCCAGGGGAATGGAGTCATTCAAGATAGCATATCCTTGACTAAGAGTATGTTAGCAATGAGTCAACTGTCTTTTAACAGCAATAGGAAACGTATCACTGACTGCAAGGAAAGGGTTTCCTCAAACCGCAATCATGACTCGAG。
其中，PCR扩增体系为：PrimeSTAR Max Premix(2X)(宝日医生物技术(北京)有限公司，货号：R045A)25μL、NDV-Target DNA-F 1μL、NDV-Target DNA-R 1μL、pET-32a(+)-NDV0.5μL、灭菌水22.5μL。
PCR扩增程序为：98℃10s；55℃5s、72℃10s(30个循环)。
取扩增产物5μL+1μL 6×DNA上样缓冲液于PCR小管中充分混匀，1％琼脂糖凝胶120V电泳23min，靶标DNA扩增电泳结果如图2所示，其中，泳道1为DL2000 Maker；泳道2为靶标DNA(NDV)的扩增产物；泳道3为阴性对照(模板为H2O)。可知，产物片段在672bp左右，条带单一符合预期。同时对扩增产物进行纯化回收。
实验例2CRISPR/Cas12a顺式切割活性试验
在总反应体积为20μL的PCR管中加入Cas12a(1μM)(New England Biolabs，Massachusetts，USA，货号：M0653T)2μL、体外转录所得的crRNA(100ng/μL)1μL、10XBuffer2μL、RNasin Inhibitor(50U)1μL、RNase-free ddH2O 11μL、靶标DNA 3μL，37℃孵育60min，用于检测CRISPR/Cas12a的顺式切割活性。
取所得反应产物5μL+1μL 6×DNA上样缓冲液于PCR小管中充分混匀，通过1％琼脂糖凝胶以120V电泳23min，得到CRISPR/Cas12a顺式切割电泳结果如图3所示，其中，泳道1为DL2000 Maker；泳道2为靶标DNA扩增产物。全长672bp的靶标DNA被切割为330bp的DNA产物，说明实验例1中设计合成的crRNA可以成功激活Cas12a顺式切割活性。
实验例3ssDNA报告探针设计与验证
报告探针由标记的荧光基团FAM、淬灭基团BHQ1/生物素Biotin与序列TTATTATT组成，由宝生物工程(大连)有限公司合成，记为ReporterⅠ(5’-FAM-TTATTATT-BHQ1-3’)。将合成的报告探针干粉4000rpm，离心5min后，用无酶水稀释至200μM作为储液，取出储液在避光小管中稀释为终浓度1μM的工作液，其余储液-20℃保存备用。
在总反应体积为20μL的PCR管中加入Cas12a(1μM)2μL、crRNA(100ng/μL)1μL、Buffer 2μL、RNasin Inhibitor(50U)1μL、RNase-free ddH2O10μL和靶标DNA 3μL，1μLReporterⅠ(1μM)，利用QuantStudio5(Applied Biosystems，USA)测试CRISPR/Cas12a反式切割活性。
CRISPR/Cas12a反式切割活性结果如图4所示，可知，Cas12a具有由靶标DNA的特异性识别激发的非特异性切割ssDNA的反式切割活性，样品的荧光信号值与对照相比具有显著性差异。
实验例4RAA引物设计与优化
针对NDV的靶标序列分别设计了多组RAA引物，经普通PCR进行第一次筛选，选取符合要求的组别利用RT-基础型核酸扩增试剂(RAA法)(杭州众测生物有限公司，货号：S003ZC)进行扩增，设置一组阴性对照。
取反应产物5μL+1μL 6×DNA上样缓冲液于PCR小管中充分混匀，1％琼脂糖凝胶120V电泳23min，得到NDV-RAA引物对靶标DNA的扩增电泳结果如图5，其中，泳道1为DL2000bp DNA相对分子质量Maker，泳道2为使用NDV-RAA-F/R引物对靶标DNA的扩增产物；泳道3为阴性对照组。可知，扩增产物由200bp与400bp两组产物组成，经实验验证在RAA-CRISPR/Cas12a系统里，经RAA扩增后产物有成倍比例关系的双条带扩增效率要优于单条带，因此选取的NDV-RAA引物序列如下：
NDV-RAA-F(SEQ ID NO.5)：
AACCTCAACTAACCGCCTCTTGATAGAGTTT；
NDV-RAA-R(SEQ ID NO.6)：
CTGCCATTACCTGGCAGTTTCTTAATCT。
实验例5RAA-CRISPR/Cas12a敏感性分析
以NDV-Target DNA-F、NDV-Target DNA-R为引物，以包含靶标DNA序列的质粒pET-32a(+)-NDV为模板进行扩增，将不同稀释浓度的扩增产物经RT-RAA基础型核酸扩增试剂扩增后做后续反应模板。扩增操作方法如下：
(1)根据反应数量，按照反应体系配制含有水13.5μL、ABuffer 25μL、NDV-RAA-F(10μM)2μL、NDV-RAA-R(10μM)2μL的反应液，混合均匀后加入装有反应干粉的检测单元管中；
(2)向检测单元管中加入5μL不同稀释浓度的扩增产物，其中，稀释倍数共10个，分别为100～109；
(3)再向检测单元管盖上加入2.5μL的B Buffer，盖上管盖，上下颠倒充分混匀6次，低速离心10s；
(4)在42℃条件下孵育30min。
按照Cas12a(1μM)2μL、crRNA(100ng/μL)1μL、Buffer 2μL、RNasin Inhibitor(50U)1μL、RNase-free ddH2O 10μL、ReporterⅠ(1μM)1μL和经RAA扩增完的反应液3μL混合进行反应，利用QuantStudio5(Applied Biosystems，USA)FAM通道每隔2min收集一次荧光信号，每个反应做三个重复。反应程序为预反应37℃1min，荧光信号采集37℃2min(30个循环)。
CRISPR/Cas12a敏感性检测分析结果如图6所示，可知，在靶标DNA浓度稀释拷贝数为102时，样品荧光信号值与空白对照差异性显著，表明该体系最低检测限度为102拷贝。
实验例6RAA-CRISPR/Cas12a特异性分析
为评估建立的针对鸽新城病毒的RAA-CRISPR/Cas12a体系的特异性，选择兽医临床常见的家禽呼吸道疫病病原禽流感病毒(AIV)及禽传染性支气管炎病毒(IBV)进行检测，所用毒株均为山西农业大学动物医学学院家禽重要疫病防控实验室保存。病原RNA经RT-RAA扩增后，按照Cas12a(1μM)2μL、crRNA(100ng/μL)1μL、Buffer 2μL、RNasin Inhibitor(50U)1μL、RNase-free ddH2O 10μL、ReporterⅠ(1μM)1μL和经RAA扩增完的反应液3μL组装进行反应，同时，设置模板为H2O的阴性对照(NC)，靶标DNA序列为模板的记为阳性对照(NDV)；利用QuantStudio5(Applied Biosystems，USA)FAM通道每隔2min收集一次荧光信号，每个反应做三个重复。反应程序为预反应37℃1min，荧光信号采集37℃2min(30个循环)。
RAA-CRISPR/Cas12a特异性分析的荧光信号分析结果如图7所示，可知只有NDV样品的荧光信号与对照组相比有显著差异，表明建立的针对NDV的RAA-CRISPR/Cas12a体系特异性较强。
实验例7RAA-CRISPR/Cas12a与侧向流层析试纸条(LFD)联用检测
按照Cas12a(1μM)2μL、crRNA(100ng/μL)1μL、Buffer 2μL、RNasin Inhibitor(50U)1μL、RNase-free ddH2O 10μL、ReporterⅡ(1μM，5’-FAM-TTATTATT-Biotin-3’)1μL和经RAA扩增完的反应液3μL组装进行反应，37℃孵育10min后，用无酶水将反应后的体积由20μL补足至60μL并吸打混匀后。把CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条(南京沃博生物科技有限公司，货号：JY0301)插入反应管中，液面不超过结合垫最上端，待判读区全部浸润后2min内读取结果。根据试纸条显色情况直接读取检测结果，试纸条质控线(C线)和检测线(T线)均出现红色条带；试纸条质控线(C线)不显色，检测线(T线)出现红色条带。上述两种情况均说明报告基团被激活继而显色，结果均可判定为阳性。试纸条质控线(C线)出现一条红色条带，检测线(T线)不显色，判定为阴性结果。
得到RAA-CRISPR/Cas12a联用侧向流层析试纸条测试结果如图8所示，可知待测靶标DNA样品T线出现红色条带，C线无条带，符合阳性判定情况之一；而阴性只有C线出现红色条带，证明该检测结果有效。
应用例临床样品的检测
采用所建立的RAA-CRISPR/Cas12a-LFD体系对50份鸽咽拭子/肛拭子样本进行鸽新城疫病毒检测鉴定，同时利用qPCR与普通PCR进行检测。样本RNA使用8分钟超快病毒DNA/RNA双提试剂盒(中实基因科技天津有限公司，货号：ZS-M11006)提取，操作方法如下：
(1)在1.5mL离心管(自备)中加入200μL病毒液(粪便提取液、血清、血浆等)，加入50μL SolutionV1和20μL Protease K，漩涡混合均匀，室温消化5min。
(2)消化完毕后，向上述样本中加入700μL SolutionV2，漩涡混合1min。
(3)将上述混合液全部倒入到吸附柱V中，13000rpm离心1min。
(5)倒掉废液，向吸附柱V中加入500μLWashing Buffer，13000rpm离心15sec。重复此步骤一次。
(6)将吸附柱V重新放回离心机，13000rpm空离心1min，将残留的乙醇彻底甩干。
(7)将吸附柱芯放入到1.5mL RNase Free离心管中，向吸附柱芯中加入40μLNuclease Free H2O，13,000rpm离心1min，洗脱液即为DNA/RNA产物。
对上述所提取的样本进行RT-RAA扩增，步骤如下：
(1)根据反应数量，按照反应体系配制含有水13.5μL、ABuffer 25μL、上游引物(10μM)2μL、下游引物(10μM)2μL的反应液，混合均匀后加入装有反应干粉的检测单元管中。
(2)向检测单元管中加入5μL待测样本。
(3)再向检测单元管盖上加入2.5μL的B Buffer，盖上管盖，上下颠倒充分混匀6次，低速离心10s。
(4)在42℃条件下孵育30min。
侧向流试纸条反应操作方法如下：按照Cas12a(1μM)2μL、crRNA(100ng/μL)1μL、Buffer 2μL、RNasin Inhibitor(50U)1μL、RNase-free ddH2O 10μL、ReporterⅡ(1μM)1μL和经RT-RAA扩增完的反应液3μL组装进行反应，37℃孵育10min后，用无酶水将反应后的体积由20μL补足至60μL并吸打混匀后。把CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条(南京沃博生物科技有限公司，货号：JY0301)插入反应管中，2min后读取结果。得到50个临床样品检测结果如下表2，可知，本方案提供的RT-RAA和CRISPR/Cas12a联用的检测体系可以对鸽新城疫病毒进行有效地检测，准确率高。
表2临床样品检测结果
综上可知，本发明在CRISPR技术的基础上与RAA技术相结合，建立了基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a鸽新城疫病毒检测体系和检测方法，该体系可用于制备鸽新城疫病毒的检测试剂盒，其检测敏感性高、特异性好、操作简单、检测时间短而且不需要复杂的仪器设备，适用于鸽新城疫病毒的快速、精准检测，可为鸽新城疫病毒流行病学的调查及鸽新城疫的有效防控提供重要技术支撑。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (6)
1.一种基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的鸽新城疫病毒快速检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包含RT-RAA体系和CRISPR/Cas12a体系；
其中，所述RT-RAA体系包含基于靶标DNA序列的RAA引物对，所述RAA引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述CRISPR/Cas12a体系包含核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示的crRNA。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述的靶标DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述crRNA的扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a体系还包括Cas12a蛋白、ssDNA报告探针和/或无核酸酶水；
其中，所述ssDNA报告探针为5’-F-TTATTATT-Q-3’，所述F为荧光素，Q为荧光淬灭剂。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a体系包含2μL的1μM Cas12a、1μL的100ng/μL crRNA、2μL的Buffer、1μL的50U RNasin Inhibitor、13μL的RNase-free ddH2O和1μL的1μM ssDNA。
6.如权利要求1～5中任意一项所述的检测试剂盒在以下任意一项中的应用，包含：
1)鸽新城疫病毒检测；
2)鸽新城疫病毒流行病学调查；
3)鸽新城疫的防控。
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