CN116855641A - 一种用于制备检测丁型冠状病毒试剂盒的引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于制备检测丁型冠状病毒试剂盒的引物对及其应用，属于生物技术领域。所述引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的引物对能特异地扩增出样品中的丁型冠状病毒的ORF1ab基因片段，检测灵敏度高，最低检测限达6.19×10‑6ng/μL，结果准确，可将其应用到对丁型冠状病毒的检测和鉴定当中。该引物对对丁型冠状病毒的不同毒株的检测具有通用性，可应用于鸟类粪便样品中丁型冠状病毒核酸的检测。本发明为今后对该病的流行检测和防控提供检测工具。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于制备检测丁型冠状病毒试剂盒的引物对及其应用。
背景技术
冠状病毒(Coronaviridae)分为甲、乙、丙、丁四个属，又称为α、β、γ、δ属。丁型冠状病毒是冠状病毒科丁型冠状病毒属(Deltacoronavirus)的统称，为单股正链RNA病毒，国际病毒分类委员会(The International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)鉴定的丁型冠状病毒包括Andecovirus、Buldecovirus、Herdecovirus三个亚属、七个种。丁型冠状病毒主要感染约30个科，108个属的不同种类野禽，具有广泛的演化多样性和复杂的宿主生态学特征，但极少受到研究人员关注。
2009年，Woo等首次从野鸟中发现了3种新型冠状病毒，后经遗传分析确定为新的冠状病毒属——丁型冠状病毒属(Comparative analysis of complete genomesequences of three avian coronaviruses reveals a novel group3c coronavirus.JVirol.2009,83(2):908-17.)。2021年11月，John等首次报道在感染新冠病毒SARS-CoV的三名海地儿童血浆中检测到猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus，PDCoV)，成为丁型冠状病毒属病毒第一个人畜共患病例(Independent infections of porcinedeltacoronavirus among Haitian children.Nature.2021,600(7887):133-137.)。
当前公开的丁型冠状病毒的基因组序列十分有限且缺乏详细的流行病学及病毒特征描述。有假病毒入侵实验证明部分野禽Delta冠状病毒的S蛋白的假病毒可以分别利用禽或猪的氨基肽酶N(APN)介导入侵相应种属细胞(Susceptibility of Chickens toPorcine Deltacoronavirus Infection.Viruses,2019,11(6).)；另有动物实验证明，PDCoV能够感染鸡胚(Chicken or Porcine Aminopeptidase N Mediates Cellular Entryof Pseudoviruses Carrying Spike Glycoprotein from the AvianDeltacoronaviruses HKU11,HKU13,and HKU17.J Virol,2023,97(2):e0194722.)。这意味着PDCoV和野禽丁型冠状病毒可能具有传染病学特性上的相似性，两者共感染同种动物的潜力也在提示重组发生的风险，这可能进一步导致更多跨种传播事件的发生。
因此，丁型冠状病毒是具有潜在人畜共患风险的一类病毒，从公共卫生学的角度，加大丁型冠状病毒在野生动物和家禽家畜中的检测力度将有助于新发病毒疾病的监控和预防。
由于缺乏高效的检测工具，新的丁型冠状病毒的发现依赖于宏病毒组(ViralMetagenomics)检测，该方法检测周期长、检测成本高且依赖于公开的基因组序列进行注释。由于丁型冠状病毒现有公开基因组序列主要集中在PDCoV，数据库多样性差，通过宏病毒组学的方法进行丁型冠状病毒检测的假阴性事件难以被忽视。
RT-PCR是以病毒的RNA为模板进行反转录，再以PCR进行核酸扩增来检测病毒的方法，相较于病毒分离鉴定等传统的方法，RT-PCR方法检测速度快，灵敏度高，在动物疾病诊断上得到了广泛的应用。本发明拟通过丁型冠状病毒的保守序列设计通用引物，建立PCR方法为丁型冠状病毒的检测提供有效的工具。
发明内容
本发明的目的在于针对丁型冠状病毒的鉴定提供一种特异、敏感且高效的PCR检测方法，开发相应的检测试剂盒，用于快速准确鉴定丁型冠状病毒，对于公共卫生具有重要意义。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种用于检测丁型冠状病毒的引物对，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述引物对是根据丁型冠状病毒高度保守ORF1ab基因设计合成的，对丁型冠状病毒属不同毒株的检测具有通用性。利用该引物对能特异性地扩增出丁型冠状病毒基因组cDNA上ORF1ab基因300-400bp的片段，而冠状病毒科其他三个属(甲型、乙型、丙型)无法扩增出相应的基因片段，因此，利用该引物对能够快速鉴别丁型冠状病毒。
本发明提供了一种包含所述引物对的PCR检测试剂盒。所述PCR检测试剂盒的组成包括：
(1)总RNA提取试剂，包括Vazyme RNA isolater Total RNA Extracion Reagent、氯仿、异丙醇、乙醇、RNase-free ddH2O，其中氯仿、异丙醇、乙醇使用分析纯化工产品；
(2)反转录试剂，包括5×Reaction Buffer、Oligo(dT)18primer、Random Hexamerprimer、RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL)、RevertAid M-MuLV RT(200U/μL)、dNTPMix、RNase-free ddH2O，试剂来自Thermo RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒；
(3)PCR反应试剂，包括2×Taq Plus Master Mix II(Vazyme)、10mM的上下游引物；所述上游引物为5'-GCCTATCTAAAGCATATTGCTG ATGGTGG-3'；下游引物为5'-GGGTTCAAGGCGGGCACCACTTGAACC CTTCACTCGTTTAAATAGG-3'。
(4)阳性对照，感染猪丁型冠状病毒(PDCoV)的ST细胞培养上清中RNA反转录后的cDNA；
(5)阴性对照，未感染病毒的ST细胞培养上清中RNA反转录后的cDNA。
本发明提供了所述的引物对在制备检测丁型冠状病毒试剂盒中的应用。所述试剂盒中包括：RNA提取试剂、反转录试剂、PCR反应试剂、阳性对照和阴性对照。
进一步的，所述丁型冠状病毒包括Andecovirus、Buldecovirus、Herdecovirus三个亚属。
本发明还提供了一种以非诊断目的检测丁型冠状病毒的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的总RNA，通过反转录获取cDNA；
(2)建立PCR反应体系，以所述cDNA为模板，采用所述的引物对进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测；
如扩增产物中出现300-400bp的条带，则说明待测样品中含有丁型冠状病毒，否则，说明待测样品中不含丁型冠状病毒。
本发明提供的引物对对丁型冠状病毒属毒株的检测具有通用性，利用1％浓度琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，如待测样品中含有丁型冠状病毒，则会在300-400bp之间出现明亮条带；如待测样品中不含丁型冠状病毒，则无法扩增出相应产物。
具体的，由于冠状病毒具有多样性，不同丁型冠状病毒毒株间ORF1ab基因序列长度存在差别，例如Buldecovirus亚属代表毒株PDCoV的扩增产物序列长度为369bp；Herdecovirus亚属代表毒株NhCoV的扩增产物序列长度为392bp；Andecovirus亚属代表毒株WiCoV的扩增产物序列长度为374bp。
进一步的，所述待测样品为野禽及其他野生动物粪便或离体病理组织。所述离体病理组织为病死动物的肝脏、脾脏等易分离的组织。从病死动物中解剖得到的待测样品进行预处理，再用于总RNA提取。
所述的PCR反应体系包括：含有DNA聚合酶和dNTP的PCR反应预混液、上下游引物各0.4mM。
所述PCR反应的条件为：第一步，95℃预变性5min；第二步，95℃变性15s、56℃退火15s、72℃延伸60s，35个循环；第三步，72℃延伸10min。
以上述PCR反应体系及反应条件，对丁型冠状病毒的最低检测限为6.19×10-6ng/μL。
与现有技术相比，本发明具备的有益效果：
(1)本发明提供的引物对能特异地扩增出样品中的丁型冠状病毒的ORF1ab基因片段，检测灵敏度高，最低检测限达6.19×10-6ng/μL，结果准确，可将其应用到对丁型冠状病毒的检测和鉴定当中。
(2)本发明提供的引物对对丁型冠状病毒的不同毒株的检测具有通用性。
(3)本发明提供的引物对可应用于鸟类粪便样品中丁型冠状病毒核酸的检测。
(4)本发明建立了一种快速、特异、准确的丁型冠状病毒的检测方法，开发相应的试剂盒，为今后对该病的流行检测和防控提供检测工具。
附图说明
图1为实施例1的引物扩增结果图，其中M为DNA marker；1为PDCoV阳性样品，由于样品浓度高，出现拖尾情况；2为阴性对照。
图2为实施例2的引物广谱性检测结果图，其中M为DNA marker；1、2和3分别为Buldecovirus亚属、Herdecovirus亚属和Andecovirus亚属代表毒株PDCoV、NhCoV和WiCoV的核酸样品；4为阴性对照。
图3为实施例3的引物敏感性检测结果图，其中M为DNA marker；1，6.19×101ng/μL；2，6.19×100ng/μL；3，6.19×10-1ng/μL；4，6.19×10-2ng/μL；5，6.19×10-3ng/μL；6，6.19×10-4ng/μL；7，6.19×10-5ng/μL；8，6.19×10-6ng/μL；9，6.19×10-7ng/μL。
图4为实施例4的引物特异性检测结果图，其中M为DNA marker；1为丁型冠状病毒阳性对照；2为甲型冠状病毒cDNA样品；3为乙型冠状病毒cDNA样品；4为丙型冠状病毒cDNA样品。
图5为实施例5的临床样品检测结果，其中M为DNA marker；1为阳性对照；2-16为15份临床样品；17为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、下述实施例中利用的试剂盒组成包括：
(1)总RNA提取试剂，包括Vazyme RNA isolater Total RNA Extracion Reagent、氯仿、异丙醇、乙醇、RNase-free ddH2O，其中氯仿、异丙醇、乙醇使用分析纯化工产品。
(2)反转录试剂，包括5×Reaction Buffer、Oligo(dT)18primer、Random Hexamerprimer、RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL)、RevertAid M-MuLV RT(200U/μL)、dNTPMix、RNase-free ddH2O，试剂来自Thermo RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒。
(3)PCR反应试剂，包括25μL的2×Taq Plus Master Mix II(Vazyme)、2μL的上下游引物DCoV-F和DCoV-R、1μL的cDNA和20μL的ddH2O；
上下游引物DCoV-F和DCoV-R是根据丁型冠状病毒的ORF1ab基因序列设计并合成，具体的，DCoV-F：5'-GCCTATCTAAAGCATATTGC TGATGGTGG-3'；DCoV-R：5'-GGGTTCAAGGCGGGCACCACTTGAACC CTTCACTCGTTTAAATAGG-3'。
(4)阳性对照，从感染PDCoV CH-HA3-2017毒株的ST细胞培养上清提取RNA反转录为cDNA，以此cDNA为模板，利用上述引物对进行PCR扩增获得369bp的产物，扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，序列分析表明扩增的DNA片段为ORF1ab基因片段的部分序列。
(5)阴性对照，未感染的ST细胞培养上清抽提RNA的cDNA。
2、下述实施例中涉及的菌株包括：
甲型冠状病毒FCoV WSU 79-1683毒株、丙型冠状病毒IBV ZJ971毒株、丁型冠状病毒PDCoV CH-HA3-2017毒株以及ST细胞由农业农村部动物病毒学重点实验室(KLAV)保存。乙型冠状病毒SARS-CoV-2、丁型冠状病毒Herdecovirus亚属和Andecovirus亚属代表毒株NhCoV和WiCoV对应的cDNA片段由浙江尚亚生物技术公司合成，合成的序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
3、下述本实施例中，考虑技术普及成本和区分背景杂带的效果，使用TBE溶液配制的1％浓度琼脂糖凝胶进行PCR扩增产物的电泳检测。
实施例1：样品检测方法
1、样品处理
采集的新鲜野鸟粪便按1:3体积比加入灭菌PBS充分震荡混匀，反复冻融三次后，于4℃12,000g离心10min，取上清液200μL于新的灭菌离心管中。
另收集ST细胞感染PDCoV CH-HA3-2017毒株的培养上清200μL作为阳性对照；正常ST细胞的培养上清200μL作为阴性对照。
2、总RNA抽提
在上述200μL上清中加入RNA isolater Total RNA Extracion Reagent(Vazyme)至总体积1mL，混匀后裂解5min，加入200μL的氯仿震荡后静置10min，4℃、12,000g离心10min。小心地将上清转移到新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇混匀后静置10min，4℃、12,000g离心10min。弃掉离心管中液体，小心加入1mL的75％乙醇(用RNase-free ddH2O配制)，4℃、12,000g离心10min。弃掉并晾干管中所有液体，用无RNA酶水溶解管底沉淀即得到总RNA。上述所有实验均在无RNA酶环境进行。
3、反转录
向无RNA酶的PCR管中依次加入5μg的总RNA、1μL Oligo(dT)18primer、1μL RandomHexamer primer，用RNase-free ddH2O补齐体积至12μL，再加入4μL 5×Reaction Buffer、1μL RiboLock RNase Inhibitor(20U/μL)、2μL dNTP Mix、1μL RevertAid M-MuLV RT。反应体系配置完成后使用PCR仪进行反转录PCR，程序为：25℃10min，42℃60min，72℃5min。反应完成即可获得cDNA。
4、PCR反应
取反转录产物cDNA 1μL，分别加入引物10mM的DCoV-F和DCoV-R引物各2μL，2×TaqPlus Master Mix II 25μL，加水至50μL。上述PCR反应体系经：95℃预变性5min，95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸60s，35个循环，72℃延伸10min的程序进行PCR扩增。
PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，YeaRed染色，在紫外线下观察。阳性样品在369bp的位置出现了明亮的条带，而阴性样品没有条带出现，如图1所示。
5、PCR产物测序验证
割胶回收图1中阳性的PCR产物，将回收的PCR产物连接到T载体后，送测序公司测序。序列分析的结果显示，扩增的片段为369bp，序列如SEQ ID NO.3所示。经BLAST分析显示，该序列属于丁型冠状病毒ORF1ab基因序列。
实施例2：试剂盒的广谱性检测
为检测描述引物的广谱性，需验证该引物能够特异性扩增丁型冠状病毒所属三个亚属的成员，现已有PDCoV毒株CH-HA3-2017(属于Buldecovirus亚属)样品作为阳性对照，委托杭州尚亚公司合成Night_heron_coronavirus_HKU19_NC_016994(属于Herdecovirus亚属，GenBank No.NC_016994)和Wigeon_coronavirus_HKU20_NC_016995(属于Andecovirus亚属，GenBank No.NC_016995)序列的DNA合成片段。
参照实施例1程序进行PCR检测，结果如图2所示，描述引物能够从样品中检测出丁型冠状病毒全部三个亚属代表毒株的cDNA。
实施例3：试剂盒的敏感性检测
将阳性对照样品用描述引物进行PCR后，将产物连接pMD-18T载体，转化大肠杆菌，挑取带有阳性重组质粒的单克隆大肠杆菌扩繁，抽提重组质粒，定量后作为PCR敏感性试验扩增的模板。
从丁型冠状病毒获得的PCR扩增片段的阳性重组质粒DNA浓度为61.9ng/μL，将其进行10倍系列稀释后进行PCR反应。
结果如图3显示，模板稀释到6.19×10-6ng/μL，还能看到明显PCR扩增目的片段。因此，本发明建立的丁型冠状病毒PCR方法至少能检测到每微升里的0.00000619ng即6.19×10-6ng的DNA。
实施例4：试剂盒的特异性检测
为检测描述引物在多种冠状病毒中特异性检测出丁型冠状病毒，需验证该引物对甲型冠状病毒、乙型冠状病毒、丙型冠状病毒不敏感。
使用FCoV细胞培养物和IBV感染的鸡胚尿囊液获得甲型冠状病毒和丙型冠状病毒的阳性cDNA，以及委托杭州尚亚公司合成SARS-CoV Wuhan-Hu-1毒株(GenBank No.NC_045512.2)的cDNA，参照实施例1程序进行PCR检测。
结果如图4显示，描述引物能够特异性地扩增出丁型冠状病毒样品的条带，对甲型冠状病毒、乙型冠状病毒、丙型冠状病毒样品不敏感。
实施例5：试剂盒的临床检测应用
按照实施例1的方法，对2022年8月在青海省青海湖地区采集的15份野禽粪便样品实施检测，检测结果如图5所示，阳性样品在370bp左右的位置出现了明亮的条带，而阴性样品没有条带出现。
扩增成功的样品送杭州尚亚公司进行一代测序，其中一份阳性样品的测序结果如SEQ ID NO.7所示。将返回的拼接序列在NCBI网页版使用BLAST功能进行搜索，在NR库中匹配的高评分序列全部为Delta冠状病毒。可知本实施例中检出的阳性样品确实含有Delta冠状病毒核酸。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种用于检测丁型冠状病毒的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种包含如权利要求1所述的引物对的PCR检测试剂盒。
3.如权利要求1所述的引物对在制备检测丁型冠状病毒试剂盒中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述丁型冠状病毒包括Andecovirus、Buldecovirus、Herdecovirus三个亚属。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中包括：RNA提取试剂、反转录试剂、PCR反应试剂、阳性对照和阴性对照。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述阳性对照为感染猪丁型冠状病毒的ST细胞培养上清中RNA反转录后的cDNA；所述阴性对照为未感染病毒的ST细胞培养上清中RNA反转录后的cDNA。
7.一种以非诊断目的检测丁型冠状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取待测样品的总RNA，通过反转录获取cDNA；
(2)建立PCR反应体系，以所述cDNA为模板，采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增；
(3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测；
如扩增产物中出现300-400bp的条带，则说明待测样品中含有丁型冠状病毒，否则，说明待测样品中不含丁型冠状病毒。
8.如权利要求7所述的检测丁型冠状病毒的方法，其特征在于，所述待测样品为野禽粪便或离体病理组织。
9.如权利要求7所述的检测丁型冠状病毒的方法，其特征在于，所述的PCR反应体系包括：含有DNA聚合酶和dNTP的PCR反应预混液、上下游引物各0.4mM。
10.如权利要求7所述的检测丁型冠状病毒的方法，其特征在于，PCR反应的条件为：第一步，95℃预变性5min；第二步，95℃变性15s、56℃退火15s、72℃延伸60s，35个循环；第三步，72℃延伸10min。
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