CN112210626A

CN112210626A - 一种检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的引物探针组合、试剂盒

Info

Publication number: CN112210626A
Application number: CN202011301141.9A
Authority: CN
Inventors: 傅光华; 黄瑜; 傅秋玲; 万春和; 程龙飞; 陈红梅; 刘荣昌; 施少华; 林建生
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-11-19
Filing date: 2020-11-19
Publication date: 2021-01-12
Anticipated expiration: 2040-11-19
Also published as: CN112210626B

Abstract

本发明提供了一种检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的引物探针组合，属于畜禽疾病诊断技术领域，包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针包括番鸭呼肠孤病毒探针和新型番鸭细小病毒探针，所述番鸭呼肠孤病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述新型番鸭细小病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。采用本发明提供的引物探针组合能够对引起种鸭跛行的番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒进行快速鉴别诊断。

Description

一种检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的引物探针组合、试剂盒

技术领域

本发明属于畜禽疾病诊断技术领域，尤其涉及一种检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的引物探针组合、试剂盒。

背景技术

番鸭呼肠孤病毒(Duck Reovirus，DRV)是引起番鸭发生“花肝病”或“肝白点病”的病原，最早于1950年在南非发现。鸭呼肠孤病毒感染后可引起番鸭出现软脚、跛行，排白色稀粪。多见于10-45日龄鸭，发病率为30～90％，死亡率为10～30％。病程一般为2～14天，死亡高峰为发病后5～7天。两周龄以内患病番鸭死亡严重，少量病鸭耐过后生长发育不良，成为僵鸭，影响养殖效益。目前，呼肠孤病毒感染的宿主范围逐渐扩大，最初只感染番鸭，目前发现还可感染半番鸭、麻鸭、北京鸭等，该病无明显季节性。

新型番鸭细小病毒(Novel Muscovy Duck Parvovirus，NMDPV)是近来在鸭群中新出现的水禽细小病毒变异株，该病毒主要感染10-50日龄的半番鸭、番鸭和樱桃谷鸭，感染后鸭表现张口呼吸、软脚、跛行、腹泻，发病后康复鸭表现生长迟缓，腿骨、翅易断。鸭群发病率为5％-20％不等，严重时发病率可达50％以上，病死率较低。

番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒在鸭群普遍流行，鸭群感染发病后均出现软脚、跛行的现象，且发病鸭康复后均表现生长不良。这两种病毒感染发病时的临床特征和对鸭群造成的危害极为相似，容易混淆，易造成误诊，对养殖企业的市场竞争力和经济效益造成严重损失。鸭养殖生产过程中迫切需要一种能对导致鸭跛行的病原进行快速检测的简便方法，以指导临床的疫病诊断和治疗方案制定，从而减少经济损失。目前已有单一的分别检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的方法，但尚未见同时检测并鉴别这两种可引起鸭跛行的病原的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的引物探针组合、试剂盒，采用本发明提供的引物探针组合能够同时检测出番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的引物探针组合，包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述探针包括番鸭呼肠孤病毒探针和新型番鸭细小病毒探针，所述番鸭呼肠孤病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述新型番鸭细小病毒探针的核苷酸序列如SEQID No.4所示。

本发明还提供了一种检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的试剂盒，包括质粒标准品和上述技术方案所述的引物探针组合；所述质粒标准品包括番鸭呼肠孤病毒σ蛋白基因质粒和新型番鸭细小病毒NS1基因质粒。

优选的，所述引物对的工作摩尔浓度为0.04～0.8μmol/L。

优选的，所述引物对的工作摩尔浓度为0.2μmol/L。

优选的，所述探针的工作摩尔浓度为0.04～0.4μmol/L。

优选的，所述番鸭呼肠孤病毒探针和新型番鸭细小病毒探针的工作摩尔浓度比为2～4:1.5～3。

优选的，所述质粒标准品的浓度为2×10⁵copies/μL。

优选的，所述引物探针组合的使用方法包括：利用上述技术方案所述的引物探针组合对样品进行PCR扩增，经1％凝胶琼脂糖电泳后得到检测结果，当扩增出323bp的片段时，所述样品中含有番鸭呼肠孤病毒；当扩增出206bp的片段时，所述样品中含有新型番鸭细小病毒。

优选的，所述PCR扩增的扩增体系每30μL包括以下组分含量：10×DNA连接酶反应缓冲液3μL，DNA连接酶1μL，10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液3μL，Taq DNA聚合酶1μL，浓度为10mmol/L的dNTPs 1μL，浓度为10μmol/L的探针3μL，浓度为10μmol/L的上下游引物各1μL，样品2μL，加去离子水补足至30μL。

优选的，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃5min；进入循环95℃50s；55℃～63℃5～10min；循环6次后进入下一个变温循环95℃30s，52℃～56℃30s，72℃30s进行35个循环，循环结束后于72℃10min结束反应。

本发明提供了一种检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的引物探针组合，包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针包括番鸭呼肠孤病毒探针和新型番鸭细小病毒探针，所述番鸭呼肠孤病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述新型番鸭细小病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

本发明的有益效果：

与检测番鸭呼肠孤病毒的RT-PCR方法、检测新型番鸭细小病毒的PCR方法相比，本发明能在一个反应管和一次PCR反应中同时鉴别、检测2种病毒，减轻工作量并节省时间，达到快速检测病原的目的。目前还没有同时检测这两种可引起种鸭跛行病原的快速检测方法，与现有的检测番鸭呼肠孤病毒、新型番鸭细小病毒相关的单一病原(RT-)PCR或荧光定量(RT-)PCR检测方法相比，本发明最大的优势在于在PCR扩增阶段，仅通过一对PCR扩增引物来检测两种病原，PCR扩增时引物数量的减少极大的保障了PCR扩增的准确性、特异性，避免了因多对引物混合后相互干扰，或自联而导致PCR扩增效率降低及非特异性扩增的现象。

附图说明

图1为番鸭呼肠孤病毒RT-PCR检测结果，M为DNA相对分子质量标准；1为番鸭呼肠孤病毒样品；2为阴性对照；

图2为新型番鸭细小病毒PCR检测，M为DNA相对分子质量标准；1为新型番鸭细小病毒样品；2为阴性对照；

图3为番鸭呼肠孤病毒及新型番鸭细小病毒PCR检测结果，M为DNA相对分子质量标准；1为番鸭呼肠孤病毒及新型番鸭细小病毒混合样品；2为鸭呼肠孤病毒样品；3为新型番鸭细小病毒样品；4为阴性对照。

具体实施方式

本发明优选基于番鸭呼肠孤病毒σ蛋白基因和新型番鸭细小病毒NS1基因保守序列及绿色荧光蛋白基因序列，设计合成分别针对番鸭呼肠孤病毒σ蛋白基因和新型番鸭细小病毒的2条特异性探针和引物对。本发明设计的探针扩增引物3末端为绿色荧光蛋白基因序列，扩增获得的3个探针序列除了两端各20多个核苷酸为相应的病毒基因序列外，中间的序列均为绿色荧光蛋白基因序列。

在本发明中，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

5’-CACAACATCGAGGACGGCAGCGT-3’；

所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

5’-GCGGATCTTGAAGTTCACCT TGA-3’。

在本发明中，所述探针包括鸭呼肠孤病毒探针和新型番鸭细小病毒探针，所述鸭呼肠孤病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，加粗的序列为编码绿色荧光蛋白的序列，具体如下：

所述新型番鸭细小病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，加粗的序列为编码绿色荧光蛋白的序列，具体如下：

本发明还提供了一种同时检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的试剂盒，包括质粒标准品和上述技术方案所述的引物探针组合；所述质粒标准品包括番鸭呼肠孤病毒σ蛋白基因质粒和新型番鸭细小病毒NS1基因质粒。

在本发明中，所述质粒标准品的浓度优选为2×10⁵copies/μL。

在本发明中，所述引物对的工作摩尔浓度优选为0.04～0.8μmol/L，更优选为0.2μmol/L。

在本发明中，所述探针的工作摩尔浓度优选为0.04～0.4μmol/L。在本发明中，所述番鸭呼肠孤病毒探针和新型番鸭细小病毒探针的工作摩尔浓度比优选为2～4:1.5～3。

在本发明中，所述引物探针组合的使用方法优选包括：利用上述技术方案所述的引物探针组合对样品进行PCR扩增，经1％凝胶琼脂糖电泳后得到检测结果，当扩增出323bp的片段时，所述样品中含有番鸭呼肠孤病毒；当扩增出206bp的片段时，所述样品中含有新型番鸭细小病毒。

在本发明中，所述样品优选为临床上采集获得疑似含毒组织、棉拭子样品或含毒尿囊液等，应用商品化的病毒核酸(DNA/RNA)提取试剂盒提取获得的核酸样品，其中RNA样品需经反转录成cDNA后，作为后续PCR检测的模板。

在本发明中，所述反转录体系为每20μL优选包括以下组分含量：5×反转录反应液4μL，反转录酶AMV(5U/μL)1μL，RNA酶抑制剂(40U/μL)1μL，浓度为的dNTPs(10mmol/L)1μL，随机6碱基反转录引物(10μmol/L)1μL，样品RNA 3μL，DEPC处理水补足至20μL。在本发明中，所述反转录的反应程序包括：25℃10min；45℃～50℃30min；85℃5min；4℃10min结束反应。

反转录产物和DNA核酸样品用于后续PCR扩增检测。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

(1)杂交探针扩增引物的设计与制备

参照番鸭呼肠孤病毒σ蛋白基因和新型番鸭细小病毒NS1基因保守序列，及绿色荧光蛋白基因序列，设计了2对用于合成分别针对番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的2条特异性杂交探针扩增引物，引物信息见表1。以上引物送福州铂尚生物技术有限公司合成后，用无菌超纯水稀释成10μM的浓度，-20℃保存备用。

表1引物信息

(2)杂交探针制备与纯化

以绿色荧光蛋白质粒(pIRES2-EGFP,Takara生物技术有限公司)作为模板，分别用以上2对引物进行扩增。PCR反应体系为50μL：2x Phanta Max Super-Fidelity Buffer 25μL，DNA聚合酶1μL(5u/μL)，dNTP 1μL(10mM)，上、下游引物(10μM)各1μL，模板2μL(100ng)，用去离子水补充体积至50μL。反应程序如下：94℃预变性15min，按95℃30s、55℃30s、72℃50s进行35个循环，最后72℃延伸10min结束反应，取5μL产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，扩增产物经纯化回收后即可作为病毒核酸特异性杂交探针。为验证这些探针的正确性，可将纯化回收探针克隆进平端克隆载体pEASY-Blunt，送生工上海生物工程有限公司进行测序，2种探针的序列分别如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

实施例2

多病毒PCR检测方法的建立

1.杂交探针检测引物的设计与制备参照杂交探针中绿色荧光蛋白基因序列，设计1对用于检测该杂交探针扩增的反向扩增引物，上游引物为Seq ID No.1(JC-GFPF):5’-CACAACATCGAGGACGGCAGCGT-3’，下游引物为Seq ID No.2(JC-GFPR):5’-GCGGATCTTGAAGTTCACCT TGA-3’。应用这对引物进行检测时，番鸭呼肠孤病毒应扩增出323bp的特异性片段，新型番鸭细小病毒206bp的特异性片段。

2.检测样品核酸的制备取保存的番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒，瞬时离心后，取200μL上清，用DNA/RNA提取试剂盒(QIAGEN公司)分别提取2种病毒的基因组核酸，参照试剂盒操作说明书进行。提取获得的RNA样品按Reverse transcription kit(Invitrigen公司)操作说明书，用六碱基随机引物反转录获得cDNA，cDNA和提取获得的DNA分别作为下一步进行PCR扩增的模板。

3.番鸭呼肠孤病毒PCR扩增取上述制备的番鸭呼肠孤病毒基因组cDNA样品、纯化的杂交探针(SEQ ID No.3)及检测引物(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)进行PCR扩增。PCR反应体系为30μL：包括10×Taq DNA连接酶反应缓冲液3μL，Taq DNA连接酶0.5μL(5U/μL)，10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液3μL(含Mg²⁺)，Taq DNA聚合酶0.50μL(5U/μL)，dNTPs 1μL(10mM)，检测引物各1μL(浓度10μmol/L)，杂交探针4pg，样品cDNA 200ng或2μL ddH₂O为空白对照，去离子水补足至30μL。反应程序如下：95℃15min；95℃30s，58℃7min循环6次；95℃30s，5330s，72℃30s进行35个循环，最后72℃10min结束反应。取产物5μL扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳观察扩增结果。空白对照无扩增产物，鸭甲肝病毒样品可扩增出323bp的片段(见图1)。

4.新型番鸭细小病毒PCR扩增取制备番鸭细小病毒DNA样品、杂交探针(SEQ IDNo.4)及检测引物(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)进行PCR扩增。PCR反应体系为30μL：包括3μL Taq DNA连接酶反应缓冲液，0.5μL Taq DNA连接酶，3μL Taq DNA聚合酶反应缓冲液，0.50μL Taq DNA聚合酶，1μL dNTPs(10mM)，检测引物各1μL(浓度10μmol/L)，3pg杂交探针，样品cDNA 200ng或2μL ddH₂O为空白对照，去离子水补足至30μL。反应程序如下：95℃15min；95℃30s，58℃7min循环6次；95℃30s，5330s，72℃30s进行35个循环，最后72℃10min结束反应。取产物5μL扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳观察扩增结果。空白对照无扩增产物，鸭星状病毒样品可扩增出206bp的片段(见图2)。

4.番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的PCR扩增取上述制备的番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒核酸样品(cDNA或DNA)、杂交探针(SEQ ID No.3-4)及检测引物(SEQID No.1和SEQ ID No.2)进行PCR扩增。PCR反应体系为30μL：包括3μL Taq DNA连接酶反应缓冲液，0.5μL Taq DNA连接酶，3μL Taq DNA聚合酶反应缓冲液，0.50μL Taq DNA聚合酶，1μL dNTPs(10mM)，检测引物各1μL(10mM)，两种杂交探针SEQ ID No.3和SEQ ID No.4分别取4pg和3pg，两种病毒基因组cDNA核酸样品各2μL或番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒基因组cDNA单独一种cDNA样品2μL或6μL ddH₂O为空白对照，去离子水补足至30μL。反应程序如下：95℃15min；95℃30s，58℃7min循环6次；95℃30s，5330s，72℃30s进行35个循环，最后72℃10min结束反应。扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳观察扩增结果。空白对照无扩增产物，番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒基因组cDNA和DNA两种核酸混合样品可扩增出两个片段，大小分别为323bp和206bp，一种核酸只能扩增出相应大小的片段(见图3)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的引物探针组合、试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacaacatcg aggacggcag cgt 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcggatcttg aagttcacct tga 23

<210> 3

<211> 183

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agtaggtatc ttatcctagc agcacggggc cgtcgccgat gggggtgttc tgctggtagt 60

ggtcggcgag ctgcacgctg ccgtcctcga tgttgtggcg gatcttgaag ttcaccttga 120

tgccgttctt ctgcttgtcg gccatgatat agacgttgtg gctgttggac taactcaggt 180

gta 183

<210> 4

<211> 182

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgatggagt agtcagagca gcacggggcc gtcgccgatg ggggtgttct gctggtagtg 60

gtcggcgagc tgcacgctgc cgtcctcgat gttgtggcgg atcttgaagt tcaccttgat 120

gccgttcttc tgcttgtcgg ccatgatata gacgttgtgg ctgttgaacc tcactctgct 180

ga 182

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agtaggtatc ttatcctagc agcacggggc cgt 33

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacacctgag ttagtccaac agccacaacg tct 33

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgatggagt agtcagagca gcacggggcc gt 32

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcagcagagt gaggttcaac agccacaacg tct 33

Claims

1.一种检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的引物探针组合，其特征在于，包括引物对和探针，所述引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述探针包括番鸭呼肠孤病毒探针和新型番鸭细小病毒探针，所述番鸭呼肠孤病毒探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述新型番鸭细小病毒探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示。

2.一种同时检测番鸭呼肠孤病毒和新型番鸭细小病毒的试剂盒，其特征在于，包括质粒标准品和权利要求1所述的引物探针组合；所述质粒标准品包括番鸭呼肠孤病毒σ蛋白基因质粒和新型番鸭细小病毒NS1基因质粒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的工作摩尔浓度为0.04～0.8μmol/L。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的工作摩尔浓度为0.2μmol/L。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的工作摩尔浓度为0.04～0.4μmol/L。

6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述番鸭呼肠孤病毒探针和新型番鸭细小病毒探针的工作摩尔浓度比为2～4:1.5～3。

7.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒标准品的浓度为2×10⁵copies/μL。

8.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合的使用方法包括：利用权利要求1所述的引物探针组合对样品进行PCR扩增，经1％凝胶琼脂糖电泳后得到检测结果，当扩增出323bp的片段时，所述样品中含有番鸭呼肠孤病毒；当扩增出206bp的片段时，所述样品中含有新型番鸭细小病毒。

9.根据权利要求8所述的引物探针组合，其特征在于，所述PCR扩增的扩增体系每30μL包括以下组分含量：10×DNA连接酶反应缓冲液3μL，DNA连接酶1μL，10×Taq DNA聚合酶反应缓冲液3μL，Taq DNA聚合酶1μL，浓度为10mmol/L的dNTPs 1μL，浓度为10μmol/L的探针3μL，浓度为10μmol/L的上下游引物各1μL，样品2μL，加去离子水补足至30μL。

10.根据权利要求8或9所述的引物探针组合，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃5min；进入循环95℃50s；55℃～63℃5～10min；循环6次后进入下一个变温循环95℃30s，52℃～56℃30s，72℃30s进行35个循环，循环结束后于72℃10min结束反应。