CN108796132A

CN108796132A - 一种n-mdpv检测引物和探针及其应用

Info

Publication number: CN108796132A
Application number: CN201810725410.0A
Authority: CN
Inventors: 万春和; 黄瑜; 陈翠腾; 程龙飞; 傅秋玲; 施少华; 傅光华; 陈红梅; 刘荣昌
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-07-04
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2018-11-13

Abstract

本发明提供一种N‑MDPV检测引物和探针及其应用，所述引物和探针序列如下：上游引物NMM‑F：5’‑TACGAATGAACAAACCAA‑3’，下游引物NMM‑R：5’‑CGCTCTTAATATCTCCTCTA‑3’，探针NMM‑P序列为：5’‑TGAACGAGCGAATGAGCCTTCC‑3’，其5’‑端标记荧光报告基团FAM，3’‑端标记荧光淬灭基团Eclipse。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可检测N‑MDPV感染，为后续研究N‑MDPV的致病机理和开展分子流行病学奠定基础。

Description

一种N-MDPV检测引物和探针及其应用

技术领域

本发明涉及一种N-MDPV检测引物和探针及其应用，属于鸭病学领域。

背景技术

实时荧光定量PCR方法（Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针（荧光共振能量传递探针）和分子信标（molecular Beacon）。TaqMan探针法是指Real-time PCR 扩增时在加入一对引物时，还同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA、BHQ等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号。随着Real-time PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与Real-time PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。由于TaqMan实时荧光定量探针在常规SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的基础上，加入一条更特异性的探针，使检测目的基因只有和TaqMan探针特异性的结合，才能检测到阳性扩增信号，使检测结果更特异性，避免了SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法可能导致的结果误读误判，被广泛应用于病原学检测领域。

新型番鸭细小病毒（novel Muscovy duck parvovirus，N-MDPV）为近年来鸭群新发传染病。通过对N-MDPV分离株（NM100株）进行基因组序列测序分析发现，其基因组为5073nt，具有MDPV基因组结构特征。经序列比对分析发现，其与番鸭细小病毒重组株（SAAS-SHNH株）核苷酸序列同源性最高为99.5%，与经典MDPV代表株（FM株）基因组核苷酸同源性为93.7%，与经典GPV代表株（B株）基因组核苷酸同源性为85.5%。经遗传进化分析发现，NM100株在基因组全长、VP1基因的遗传进化上与MDPV处于同一大的遗传分支，但在VP3基因遗传进化上却与GPV处于同一大的遗传分支；与2015年感染樱桃谷鸭的新型GPV（novel gooseparvovirus, N-GPV）分离株差别较大，两者之间的基因组核苷酸同源性仅为85.4%，并处于不同的遗传进化分支。通过Simplot 3.5.1同源重组分析发现，NM100株与MDPV代表株FM株、鹅细小病毒活疫苗SYG61v株在419-610位（位于左侧ITR的3’端和NS的5’端）和3116-4249位（位于VP3基因）存在两处同源重组 [Wan C, et al. Complete Genome Sequence of aNovel Duck Parvovirus Isolated in Fujian, China. Kafkas Univ Vet Fak, 2016,22: 971-975.）]。

MDPV为无囊膜、正二十面体对称、单股DNA病毒。MDPV基因组全长均为5.1Kb左右。研究发现，MDPV基因组在5’-末端（terminal）和3’-末端均为含有发夹结构（hairpinstructure）的末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR），以及2个大的开放阅读框（ORF）组成。左侧的ORF编码病毒复制相关蛋白NS，右侧的ORF编码病毒抗原相关蛋白VP（VP蛋白可经不同的切割形成3个主要抗原蛋白VP1、VP2和VP3），VP2、VP3与VP1共同使用相同的3’-末端和同一终止密码子。

关于GPV和MDPV的实时荧光定量PCR方法，见有Woźniakowski等于2012年基于GPV和MDPV的ITR区的发夹结构特征建立了一种检测GPV和MDPV的实时荧光定量PCR方法(Woźniakowski G, et al. Quantitative analysis of waterfowl parvoviruses in geeseand Muscovy ducks by real-time polymerase chain reaction: correlation betweenage, clinical symptoms and DNA copy number of waterfowl parvoviruses. BMC VetRes. 2012, 8:29. )，该方法无法科学有效区分GPV和MDPV感染。近年来研究发现，MDPV的ITR区均存在大量的变异（Wang J, Huang Y, Zhou M, Zhu G. Analysis of the genomesequence of the pathogenic Muscovy duck parvovirus strain YY reveals a 14-nucleotide-pair deletion in the inverted terminal repeats. Arch Virol. 2016,161(9): 2589-2594.），使得该方法在MDPV的检测上会由于病毒的变异而导致探针不匹配，导致出现错误的检测结果。

细小病毒属细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒亚科（Parvovirinae）依赖细小病毒属（Dependoparvovirus），包括鹅细小病毒（goose parvovirus，GPV）和番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）。近年来，随着研究的深入，在我国鸭群中先后出现N-MDPV和N-GPV，并具有宿主感染特异性。经过流行病学调查发现，N-MDPV可感染番鸭和半番鸭；N-GPV可感染北京鸭、樱桃谷鸭和半番鸭；MDPV仅可感染番鸭；而GPV可感染鹅、番鸭、天鹅和鸿雁。上述流行病学数据表明，在半番鸭中对N-MDPV和N-GPV感染进行鉴别诊断存在现实需求。

检测N-GPV的实时荧光定量PCR方法的引物和探针均见有针对VP3基因设计(WangJ, et al. Development of a taqman-based real-time PCR assay for the rapid andspecific detection of novel duck- origin goose parvovirus. Mol Cell Probes.2017, 34: 56-58.和Niu X, et al. Development of a TaqMan-based real-time PCRassay for the detection of Novel GPV. J Virol Methods. 2016, 237: 32-37.)，由于N-MDPV在VP3基因上和GPV处于同一遗传进化分支，也导致上述检测GPV的TaqMan实时荧光定量PCR方法在检测N-MDPV上由于潜在的病毒基因重组，可能存在结果的误判误诊（即方法也可检测出N-MDPV）。

本发明基于GenBank数据库中（N-MDPV和N-GPV）的NS基因（NS基因在水禽细小病毒中的长度一致，均为1884bp，不存在缺失现象）特征，设计特异性的引物和探针，建立基于TaqMan探针特异性N-MDPV的实时荧光定量PCR方法，该方法对N-GPV无交叉反应，为后续研究半番鸭中N-MDPV的致病机理和开展流行病学调查奠定基础，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明提供一种N-MDPV检测引物和探针，该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可检测N-MDPV感染，为后续研究半番鸭中N-MDPV的致病机理和开展流行病学调查奠定基础。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

一种N-MDPV检测引物和探针，序列如下：

上游引物NMM-F：5’-TACGAATGAACAAACCAA-3’，

下游引物NMM-R：5’-CGCTCTTAATATCTCCTCTA-3’ ，

所述探针序列NMM-P为：5’-TGAACGAGCGAATGAGCCTTCC-3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

反应体系为：Probe qPCR Mix混合液12.5 μL、上/下游引物（NMM-F和NMM-R，浓度为10 μmol/L）各0.5 μL、探针（NMM-P，浓度为5 μmol/L）2 μL、DNA模板1 μL、水（Nuclease-free Water）补足至25 μL。反应条件为：95℃ 30s 预变性；95℃ 5 s、58℃ 10s、72℃ 15s，共40个循环。

本发明的另一目的是提供所述的引物和探针在制备检测N-MDPV试剂盒中的应用。

有益效果

1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过和实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。

2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中N-MDPV的Ct值，直接对其感染N-MDPV进行准确定量。

3、灵敏度高：最低可检测29.7拷贝/μL。

4、特异性强：和半番鸭中的常见传染病[如新型鹅细小病毒（N-GPV）、鸭腺病毒A型（DAdV-A）、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌（E. coli）、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)]均均无反应信号，仅对N-MDPV检测出现荧光信号。

5、重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行N-MDPV检测的组内变异系数为0.44%-1.43%，组间变异系数0.63%-2.21%。

附图说明

图1 4株N-MDPV和N-GPV NS基因核苷酸同源性比较。

图2 4株N-MDPV和N-GPV NS蛋白遗传进化分析。

图3 N-MDPV和N-GPV探针序列分析。

图4 实时荧光定量PCR方法的灵敏度测定；1-6：2.97×10⁵ 拷贝/μL-2.97×10⁰ 拷贝/μL；7：阴性对照。

图5 实时荧光定量PCR方法的标准曲线。

图6 实时荧光定量PCR方法的特异性试验；其中1：N-MDPV； Controls：N-GPV、DAdV-A、DEV、E. coli、R.A.和P.M.对照样品。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

实施例1

1、相关试验病原

1.1 试验用毒株

新型番鸭细小病毒（N-MDPV）由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定和保存。

1.2 试验对照毒株和菌株

半番鸭中常见核酸类型为DNA的病原，如新型鹅细小病毒（N-GPV）、鸭腺病毒A型（DAdV-A）、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌（E. coli）、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

、TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

2.1 NS基因比较分析

对GenBank中上传的4株N-MDPV（SAAS-SHNH株，GenBank登录号KC171936；ZW株，GenBank登录号KY744743；NM100株，GenBank登录号KU641556；FJM3株，GenBank登录号KR075690）和4株N-GPV（SDLC01株，GenBank登录号KT343253；QH15株，GenBank登录号KT751090；AH1605株，GenBank登录号MF441227；SDLY1512株，GenBank登录号MF441221）进行核苷酸同源性比较。结果可见（图1），4株N-MDPV相互之间的核苷酸同源性在99.4%-99.7%之间；4株N-GPV相互之间的核苷酸同源性在99.7%-100%之间；4株N-MDPV和N-GPV核苷酸同源性在82.2%-82.4%之间。

应用遗传进化软件MEGA 6.0绘制相互之间的遗传进化树，绘制时以MDPV经典株FM株（GenBank登录号U22967）和FZ91-30株（GenBank登录号KT865605）；GPV经典株B株（GenBank登录号U22967）和Y株（GenBank登录号KC178571）为对照。结果可见，4株N-MDPV和遗传进化上和经典MDPV处于一个大的遗传进化分支；4株N-GPV和遗传进化上和经典GPV处于一个大的遗传进化分支；4株N-MDPV和4株N-GPV在遗传进化上距离较远。

可见，MDPV和N-GPV的NS基因相互之间的核苷酸同源性较高，但也存在一定的差别；在遗传进化上也处于不同的遗传进化分支。上述结果为开展N-MDPV特异性TaqMan的检测方法的引物和探针设计提供理论依据和设计基因靶区。

2.2 引物和探针的设计

根据NS基因的分析比对结果，设计针对N-MDPV的特异性引物，

上游引物NMM-F：5’-TACGAATGAACAAACCAA-3’， NS基因位置：1467-1484；

下游引物NMM-R：5’-CGCTCTTAATATCTCCTCTA-3’ ， NS基因位置：1565-1584；

所述探针NMM-P序列为： 5’-TGAACGAGCGAATGAGCCTTCC-3’， NS基因位置：1503-1524，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。引物和探针均在宝日医生物技术（北京）有限公司合成。

需要指出的是，4株N-MDPV的探针3’-末端序列（1521-1524位）（均为TTCC）和4株N-GPV的探针3’-末端序列（1521-1524位）（均为AGAG）明显不同（见图3）。经NCBI数据库进行引物的Primer-BLAST分析。Primer-BLAST分析表明，本发明设计的相关引物和探针特异性强、无交叉干扰，符合试验设计预期。

2.3 阳性标准品的构建

利用NS的基因特征，利用Oligo 7 引物设计软件设计引物，上游引物NSF1：5＇-ATGGCATTTTCTAGGCCTCTTCA-3＇、下游引物NSR1：5＇- TTATTGTTCATTCTCCATATCAT-3＇，预期扩增片段大小为1884 bp。使用PCR扩增试剂（2×PCR Master MIX）推荐的50 μL体系进行扩增，其中2×PCR Master Mix反应液 25 μL、上/下游引物（NSF1/ NSR1）（引物浓度为10 μmol·L^-1）各1 μL、提取的核酸( N-MDPV分离株 NM100株)模板DNA 1 μL，补充灭菌去离子水至终反应体系50 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为95℃预变性5 min后进入循环，94℃变性50 s 、53℃退火35s、72 ℃延伸120s，35个循环结束后，72℃终延伸10 min。

PCR反应结束后，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将NS基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取8个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养14 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（NSF1/ NSR1）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经Blast分析后，符合实验预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品（P-NS）。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为2.97×10⁷ 拷贝/μL。经线性化酶切后，进行连续10倍倍比稀释，获得的浓度分别为2.97×10⁷ 拷贝/μL、2.97×10⁶ 拷贝/μL、2.97×10⁵ 拷贝/μL、2.97×10⁴ 拷贝/μL、2.97×10³ 拷贝/μL、2.97×10² 拷贝/μL、2.97×10¹ 拷贝/μL和2.97×10⁰ 拷贝/μL。

2.4 TaqMan实时荧光定量PCR反应条件优化

按照Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒说明书配制25 μL的实时荧光定量PCR反应体系，筛选出的最佳反应体系为：Probe qPCR Mix混合液12.5 μL、上/下游引物（NMM-F和NMM-R）（10 μmol/L）各0.5 μL、探针（NMM-P）（5 μmol/L）2 μL、DNA模板1 μL、水（Nuclease-free Water）补足至25 μL。最佳反应条件为：95℃ 30s 预变性；95℃ 5 s、58℃ 10s、72℃15s，共40个循环。

分别以标准品（P-NS）含量为2.97×10⁵ 拷贝/μL-2.97×10⁰ 拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得本发明的最低检测限为29.7拷贝/μL（图4）。

分别以标准品（P-NS）含量为2.97×10⁷拷贝/μL-2.97×10¹ 拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线，见图5）。获得实时荧光定量PCR标准曲线的线性方程的斜率为-3.358，相关系数为1.000，扩增效率为99%，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。

2.5 特异性检测

用优化后的实时荧光定量PCR条件，分别对N-MDPV、N-GPV、DAdV-A、DEV、 E. coli、R.A.、 P.M.进行检测。结果可见（图6），仅对N-MDPV出现阳性扩增，对N-GPV、DAdV-A、DEV、E. coli、R.A.、P.M.（图中的Controls）均未见阳性扩增信号（图6）。

2.6重复性试验

用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为2.97×10⁵、2.97×10³、2.97×10¹的标准品进行检测，每种质粒含量重复3次，计算组内（intra-group）变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20 ℃保存，每隔7d取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测3次，计算组间（inter-group）变异系数。建立的实时荧光定量PCR检测方法进行的组内变异系数为0.44%-1.43%，组间变异系数0.63%-2.21%，表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

临床应用

使用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测的引物和探针的检测方法，对临床收集的30份番鸭泄殖腔棉拭子、30份樱桃谷鸭和30份鹅泄殖腔棉拭子进行检测，结果可见30份番鸭泄殖腔棉拭子检测到阳性样品12份，阳性率为40%；30份樱桃谷鸭和30份鹅泄殖腔棉拭子均没有检测到阳性样品。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 一种N-MDPV检测引物和探针及其应用

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tacgaatgaa caaaccaa 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgctcttaat atctcctcta 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgaacgagcg aatgagcctt cc 22

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggcatttt ctaggcctct tca 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ttattgttca ttctccatat cat 23

Claims

1.一种N-MDPV检测引物和探针，其特征在于：所述引物和探针序列如下：

上游引物NMM-F：5’-TACGAATGAACAAACCAA-3’，

下游引物NMM-R：5’-CGCTCTTAATATCTCCTCTA-3’ ，

所述探针NMM-P序列为：5’-TGAACGAGCGAATGAGCCTTCC-3’，其5’-端标记荧光报告基团FAM，3’-端标记荧光淬灭基团Eclipse。

2.如权利要求1所述的引物和探针在制备检测N-MDPV试剂盒中的应用。