CN108004350A

CN108004350A - 番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量pcr检测引物

Info

Publication number: CN108004350A
Application number: CN201711297933.1A
Authority: CN
Inventors: 林甦; 陈少莺; 王劭; 黄梅清; 程晓霞; 俞博; 肖世峰
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2018-05-08

Abstract

本发明提供一种番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，其中，MDPV引物序列如下：上游引物P1：TAATGGTGGCAGGAATGCACAGTTC，下游引物P2：TGTTACCATGATGTCTGAAAT；GPV引物序列如下：上游引物P3：GAGGTAGACAGCAACAGAAA，下游引物P4：GCTCGTCCGTGACCATA。目前，还没有基于SYBR Green II的双重实时荧光定量PCR检测引物及方法可以同时将GPV各种基因亚型完全地和MDPV区分开来的相关研究报道和发明专利，本发明的建立可填补相关领域空白。

Description

番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量PCR检测引物

技术领域

本发明属于预防兽医学领域，涉及番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，具体涉及用于MDPV和GPV多重SYBR Green II实时荧光定量PCR方法的引物及方法。

背景技术

番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)是引起雏番鸭以腹泻、软脚和呼吸困难为主要症状的雏番鸭疫病（俗称“三周病”）的病原，主要引起3周龄以内雏番鸭发病，发病率为27%～62%，病死率为22%～43%，是危害番鸭养殖的重要病原。该病最早由我国学者程由铨于1988年在世界首次分离鉴定到MDPV，随后法国、美国、日本等地相继报道了本病的流行。

鹅细小病毒（Gosling parvovirus，GPV）也称小鹅瘟病毒，是引起雏鹅和雏番鸭的一种高度接触性、急性败血性传染病（小鹅瘟，Gosling Plague）的病原。该病最早由我国学者方定一于1956年在江苏扬州发病鹅群中发现，并在世界首次分离到GPV。该病发病率和死亡率高，且传播速度快，是对养鹅业产生严重危害的一种重要传染病。近十多年来，GPV出现了新的变异株，如1997年以来在我国番鸭群暴发流行一种新基因亚型MDGPV(代表株GPV PT株)；2015年以来在我国半番鸭、樱桃谷鸭群暴发流行一种以短喙长舌易骨折生长障碍为特征的疫病，其病原为不同于GPV和GPV PT株的新型GPV（称为SBDS-GPV）

MDPV和GPV在分类学上均为细小病毒科依赖病毒属成员。两者在形态结构上难以鉴别，在基因组序列上高度同源。MDPV和GPV基因组核苷酸以及推导氨基酸序列同源性分别为81.9%和88.9%，因而临床鉴别诊断难度较大，普通PCR诊断方法很难鉴别诊断。

SYBR Green II实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物，使用实时监测的荧光定量PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、灵敏度高、定量准确、适用性广等优点。双重SYBR Green II实时荧光定量PCR是在单重实时荧光定量PCR的基础上，利用2组引物扩增的目的片段其GC含量的差异所导致的Tm值差异，在SYBR Green II实时荧光定量PCR反应完成后结合熔解曲线峰值的差异来对MDPV和GPV进行快速鉴别诊断和病毒载量分析。

目前，尽管针对MDPV和GPV的荧光定量PCR检测方法均有报道，也包括同时可以检测MDPV和GPV的单管双重荧光定量PCR鉴别方法。但由于近年来我国番鸭群中流行的新基因亚型GPV（MDGPV），与经典GPV和MDPV都有较高的同源性，导致用现有的双重荧光定量PCR方法鉴别时往往将它误判为MDPV。目前还没有一套可以同时将GPV各种基因亚型完全地和MDPV区分开来的双重荧光定量PCR检测引物及方法，本发明的建立可填补相关领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）双重实时荧光定量PCR检测引物及方法，利用2组引物扩增的目的片段其GC含量的差异所导致的Tm值差异，在SYBR Green II实时荧光定量PCR反应完成后结合熔解曲线峰值的差异来对MDPV和GPV进行快速鉴别诊断和病毒载量分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）双重实时荧光定量PCR检测引物，所述双重SYBR Green II实时荧光定量PCR检测引物，其中，MDPV引物序列如下：上游引物P1：TAATGGTGGCAGGAATGCACAGTTC，下游引物P2：TGTTACCATGATGTCTGAAAT；GPV引物序列如下：上游引物P3：GAGGTAGACAGCAACAGAAA，下游引物P4：GCTCGTCCGTGACCATA。

所述的双重实时荧光定量PCR扩增条件为：SYBR^® Premix Ex Taq^TM (Tli RNaseHPlus) 10 μL、MDPV上/下游引物10 μM各0.5 μL、GPV上/下游引物10 μM各0.5 μL、MDPV/GPV模板分别为1 μL、补充灭菌去离子水至终体积20 μL；反应条件为：95 ℃，5 min 预变性；95℃ 15 s、60 ℃10 s、72 ℃ 15 s，共40个循环；反应结束后，做出熔解曲线。

本发明的优点在于：本发明根据NCBI中的番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）基因组序列，建立检测MDPV和GPV的双重实时荧光定量PCR方法，该方法敏感性高、特异性强、重复性好，可同时鉴别检测MDPV和GPV，特别是能将包括GPV新基因亚型在内的GPV各种型别较好地与MDPV进行区分，为研究MDPV和GPV共感染提供可靠的检测手段。

附图说明

图1 MDPV标准曲线的建立。

图2 GPV标准曲线的建立。

图3 熔解曲线的建立。

图4 实时荧光定量PCR特异性试验。

图5 MDPV和GPV的鉴别检测，其中A为本发明方法检测结果，B为现有双重荧光定量PCR方法的检测结果。

具体实施方式

1.1 材料

1.1.1 病毒株

番鸭细小病毒（MDPV）、鹅细小病毒包括经典GPV-SG株（GPV1）、MDGPV PT株(GPV2)和SBDS-GPV M15株（GPV3）、新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭瘟病毒(DPV)和鹅副粘病毒(PMV)，均由本研究室分离鉴定并保存；减蛋综合症病毒(EDSV)购自中国兽药监察所；病毒DNA按常规方法提取。

1.1.2 主要仪器和试剂

SYBR^® Premix Ex Taq^TM (Tli RNaseH Plus)、pMD19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司、DNase/RNase-Free去离子水(RT121)购自天根生化科技（北京）有限公司；Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；荧光定量PCR八连排透明PCR薄壁管购自Axygen。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成

参考GenBank中登录的MDPV和GPV基因组特征，利用DNAMAN Version 8软件进行同源性分析比较，选出保守且特异的核苷酸区域，利用引物设计软件Primer Premier Version 5设计引物（引物序列见表1），采用BLAST工具进行检索，验证其特异性，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 MDPV和GPV实时荧光定量引物

1.2.2 阳性标准品的制备

1.2.1中选取的核苷酸序列送生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成并连接至pMD19-T载体，重组质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。

测序结果表明该阳性重组质粒符合预期，即做为MDPV和GPV实时荧光定量PCR的阳性标准品Mp1和Gda1，根据核酸浓度和分子量分别计算标准品拷贝数。

1.2.3 MDPV和GPV双重荧光定量PCR检测方法的建立

1.2.3.1 反应条件的优化

采用SYBR® Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)推荐的20μL反应体系，以出现最高的荧光值（△Rn）、最小的Ct值以及在熔解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，对退火温度（52～65℃）进行优化。循环结束后，绘制熔解曲线。

1.2.3.2 标准曲线的建立

将阳性标准品Mp1和Gda1利用DNase/RNase-Free去离子水进行连续10倍系列稀释（10^-1～10^-7），以1.2.3.1的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。

1.2.3.3 敏感性检测

将阳性标准品Mp1和Gda1利用DNase/RNase-Free去离子水进行连续10倍系列稀释至1×10¹拷贝/μL，以1.2.3.1的条件进行扩增，评价其敏感性。

1.2.3.3 特异性检测

用1.2.3.1优化的条件分别检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭瘟病毒(DPV)、鹅副粘病毒(PMV)和减蛋综合症病毒(EDSV)，对其特异性进行评价。

1.2.3.4 重复性评估

对同一阳性标准品设4个重复管，用1.2.3.1的条件进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数；将该标准阳性样本置于-20 ℃冰箱保存，分别于第1周、第2周、第3周和第4周重检，计算其组间变异系数。

1.2.4 MDPV和GPV三种型别的鉴别检测

用1.2.3的双重荧光定量PCR方法对MDPV、GPV1、GPV2和GPV3进行检测，检验其是否可以完全区分MDPV和GPV（三种型别）。将现有的双重荧光定量PCR方法用于检测同样的四份样品，比较两者的结果。

1.2.5 临床样品检测应用

用1.2.3的双重荧光定量PCR方法对65份人工感染样品和15份临床样品进行检测，结果同IFA检测的结果进行比较，评价该方法在临床检测MDPV和GPV样品上的准确度。

2 结果

2.2 优化实时荧光定量PCR条件

优化出的20 μL最佳反应体系为体系：SYBR^® Premix Ex Taq^TM (Tli RNaseH Plus)10 μL、MDPV上/下游引物10 μM各0.5 μL、GPV上/下游引物10 μM各0.5 μL、MDPV/GPV模板分别为1 μL、补充灭菌去离子水至终体积20 μL；反应条件为：95 ℃，5 min 预变性；95 ℃ 15s、60 ℃10 s、72 ℃ 15 s，共40个循环；反应结束后，做出熔解曲线。

2.3 标准曲线

对阳性标准品的扩增曲线和标准曲线显示，MDPV基因在1×10¹~1×10⁸拷贝/反应范围内有很好的线性关系，相关系数为0.992，扩增效率为109%，标准曲线见图1。

对阳性标准品的扩增曲线和标准曲线显示，GPV基因在1×10¹~1×10⁸拷贝/反应范围内有很好的线性关系，相关系数为0.993，扩增效率为100%，标准曲线见图2。

2.3 熔解曲线分析

从熔解曲线分析可见：MDPV在Tm=（85.4±0.23）℃出现单一的特异性峰，无引物二聚体及非特异性产物；GPV在Tm=（87.3±0.26）℃出现单一的特异性峰，无引物二聚体及非特异性产物（见图3）。MDPV和GPV同时作为模板时，在Tm=（84.7±0.28）℃（MDPV）和Tm=（87.7±0.24）℃（GPV）出现清晰明显的特异性双峰，无引物二聚体及非特异性产物。

2.4 敏感性检测

对阳性标准品的敏感性检测结果显示，MDPV基因的最低检测限为1×10¹拷贝/反应。

对阳性标准品的敏感性检测结果显示，GPV基因的最低检测限为1×10¹拷贝/反应。

2.5 特异性检测

对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭副粘病毒(PMV)和减蛋综合症病毒(EDSV)检测均为阴性（图4）。

2.6 重复性

MDPV检测标准阳性样品的组内变异系数为0.44～2.21%，组间变异系数1.29～1.73%。GPV检测标准阳性样品的组内变异系数为0.83～3.31%，组间变异系数2.24～3.60%。

2.7 MDPV和GPV三种型别的鉴别检测

对MDPV和GPV的三种型别（GPV1、GPV2和GPV3）的检测结果显示，MDPV样品的溶解曲线在Tm=85.0℃出现单一的特异性峰，GPV三种型别（GPV1、GPV2和GPV3）样品在Tm=87.4℃、87.6℃和87.4℃分别出现单一的特异性峰。从溶解曲线的Tm值上完全可以明显地区分MDPV和GPV（包含现有的三种型别）（见图5A）。而目前的双重荧光定量PCR方法对同样四份样品检测结果显示，MDPV和GPV2样品在Tm=85.0℃和84.6℃出现单一的特异性峰，而GPV的其它两种型别（GPV1和GPV3）样品在Tm=86.1℃和86.2℃出现单一的特异性峰，未能将GPV的所有型别完全与MDPV区分开来，其中GPV2会被误判为MDPV（见图5B）。说明本发明的方法比较之前已公布的同类型检测方法，在对MDPV和GPV的鉴别上结果更加准确可靠。

2.8 对人工感染样品和临床样品检测应用

对24份人工感染MDPV、8份人工感染MDGPV、23份人工感染SBDS-GPV、10份人工感染GPV样品和15份临床送检番鸭病料的检测结果显示，其中24份人工感染MDPV样品的溶解曲线Tm=（85.2±0.26）℃，8份样品人工感染MDGPV样品的Tm=（87.3±0.32）℃，23份人工感染SBDS-GPV样品的Tm=（87.3±0.31）℃，10份人工感染GPV样品的Tm=（87.1±0.29）℃，与预期结果一致。15份临床送检番鸭病料中有2份是MDPV和GPV均阳性、2份是MDPV阳性、9份是GPV阳性、2份阴性，该结果与单抗IFA方法的检测结果一致，证明该方法在对MDPV和GPV的鉴别上准确性高，可用于临床样品的检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量PCR检测引物

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

taatggtggc aggaatgcac agttc 25

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 2

tgttaccatg atgtctgaaa t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 3

gaggtagaca gcaacagaaa 20

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 4

gctcgtccgt gaccata 17

Claims

1.番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于：所述引物包含两对引物，其中，MDPV引物序列如下：上游引物P1：TAATGGTGGCAGGAATGCACAGTTC，下游引物P2：TGTTACCATGATGTCTGAAAT；

GPV引物序列如下：上游引物P3：GAGGTAGACAGCAACAGAAA，

下游引物P4：GCTCGTCCGTGACCATA。

2.如权利要求1所述的引物用于番鸭细小病毒和鹅细小病毒实时荧光定量PCR方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增条件为：SYBR^® Premix Ex Taq^TM 10 μL、MDPV上/下游引物10 μM各0.5 μL、GPV上/下游引物10 μM各0.5 μL、MDPV/GPV模板分别为1 μL、补充灭菌去离子水至终体积20 μL；反应条件为：95 ℃，5 min预变性；95 ℃ 15 s、60 ℃10 s、72 ℃15 s，共40个循环；反应结束后，做出熔解曲线。