CN109055610A - 一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重pcr检测方法 - Google Patents

一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于PCR检测领域，具体涉及一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重PCR检测方法，S1、根据番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的基因保守序列，分别设计3对特异性扩增引物；S2、提取番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型DNA；S3、将S2中获取的所有的DNA混合后进行PCR扩增；S4、通过电泳检测S3中的PCR产物。本发明建立的三重PCR检测方法，能同时检测番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型，三种病毒核酸模板的最低检测量分别为2pg/μL、20pg/μL和2pg/μL。

Description

一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重PCR检 测方法
技术领域
本发明属于PCR检测领域，具体涉及一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重PCR检测方法。
背景技术
番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovlrus，MDPV)和鹅细小病毒病(Gooseparvovirus,GPV)都是细小病毒科、细小病毒亚科、依赖病毒属成员。MDPV可引起的雏番鸭的细小病毒病又称番鸭3周病。该病具有高度的传染性，主要导致雏番鸭消化道、肠道等部位的病变。病鸭常表现为喘气，消瘦、拒食、软脚和稀便等症状，且发病率和死亡率较高。小鹅瘟是一种烈性传染病，主要由GPV引起。鹅细小病毒病是一种急性或亚急性败血性传染病，传播速度快。该病以肠道的病变为主要特征，主要侵害20日龄以下雏鹅，也可感染雏番鸭，发病率，死亡率可高达100％。禽腺病毒(Fowl Adenovirus,FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，是鸡、鸭、鹅等禽类体内常见的传染性病源。血清4型I群禽腺病毒(Fowl Adenovirusserotype 4，FAdV-4)可引起以心包积液，以及包涵体肝炎为特征的心包积水-肝炎综合征，病禽主要表现在精神沉郁，扭头等神经症状，死亡率可达20％-30％。
GPV与MDPV基因组具有高度的同源性，抗原性高度相似，FAdV可分为5个种，12个血清型，其中以血清4型为主，种类繁多，用常规的血清学检测方法很难区分，给三种病毒的鉴别诊断造成了困难。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重PCR检测方法，该方法可同时检测三种病毒，操作更为简便、具有敏感性高、特异性强和重复性好等优点。
本发明提供了如下的技术方案：
一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重PCR检测方法，包括如下步骤：
S1、根据番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的基因保守序列，分别设计3对特异性扩增引物；
番鸭细小病毒正向引物序列：5′-AACTGAGAGATGACATGAAT-3′，番鸭细小病毒反向引物序列：5′-ACTTGCTTCTCCTCCACTAT-3′
鹅细小病毒正向引物序列：5′-GTCCGGGTAGACCAGAAA-3′，鹅细小病毒反向引物序列：5′-CTCAGGAGTCACAGGAAT-3′
禽腺病毒4型正向引物序列：5′-AACTACATCGGGTTCAGG-3′，禽腺病毒4型反向引物序列：5′-AGTCCACGAAGGTCTGAT-3′；
S2、提取番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型DNA；
S3、将S2中获取的所有的DNA混合后进行PCR扩增；
S4、通过电泳检测S3中的PCR产物。
优选的，所述S1中，通过Primer Premier 5.0软件设计3对特异性扩增引物。
优选的，所述S1中，合成3对特异性扩增引物时的退火温度均为48℃。
优选的，所述S3中，PCR扩增体系：混合后总的DNA 1μL、S1中设计的3对特异性引物各20pmol、Premix Taq DNA聚合酶14μL、灭菌双蒸水补足至25μL；
PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸3min，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
优选的，所述S4中，通过质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
本发明的有益效果是：
现有技术中检测番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型，需要进行3次PCR扩增，本发明将其整合为一次的3重PCR扩增，大大提高了番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型检测效率；同时利用该3重PCR反应体系进行检测，可以大大节约PCR和电泳试剂、实验耗材、减少电泳检测时间及成本。
本发明建立的三重PCR检测方法，能同时检测MDPV、GPV和FAdV-4三种病毒,且对鸭黄病毒(DFV)、鸭I型肝炎病毒(DHV-Ⅰ)和禽呼肠孤病毒(ARV)的检测为阴性；MDPV、GPV和FAdV-4核酸模板的最低检测量分别为2pg/μL、20pg/μL和2pg/μL；对多份阳性临床病料进行检测，结果MDPV、GPV和FAdV-4的检出率均为100％。这说明该三重PCR具有较高特异性、敏感性和可重复性，可为鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒鉴别诊断提供准确的结果，对三种疫病传播控制具有重要意义。
附图说明
图1是实施例1的三重PCR扩增产物电泳图，其中M为DL 2000 DNA Marker，1-4分别为MDPV、GPV和FAdV-4混合模板，MDPV模板，GPV模板，FAdV-4模板；
图2是实施例2的三重PCR扩增产物电泳图，其中，M为DL 2000 DNA Marker，1-7分别为MDPV、GPV和FAdV-4混合模板，MDPV模板，GPV模板，FAdV-4模板，DFV模板，DHV-Ⅰ模板和ARV模板；
图3是实施例3的三重PCR扩增产物电泳图，其中，M为DL 2000 DNA Marker，1-7均为MDPV、GPV和FAdV-4混合模板，1-7分别为浓度20ng/μL，2ng/μL，200pg/μL，20pg/μL，2pg/μL，200fg/μL；
图4是实施例4的三重PCR扩增产物电泳图，其中M为DL 2000 DNA Marker，1-8均为MDPV、GPV和FAdV-4混合模板。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做具体说明。
主要仪器与试剂DL2000 DNA Marker、Premix Taq DNA聚合酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；RNA/DNA快速提取试剂盒、反转录试剂盒、琼脂糖(电泳纯)等均购自生工生物工程科技(上海)股份有限公司。梯度PCR仪购自德国Biometra公司；BioPhotometerD30核酸蛋白测定仪购自德国Eppendorf公司。
病毒株小鹅瘟病毒、番鸭细小病毒和禽腺病毒4型均由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所实验室分离、鉴定并保存。对照毒株鸭黄病毒(DuckFlavivirus,DFV)、鸭I型肝炎病毒(Duck hepatitis virus typeⅠ,DHV-Ⅰ)和禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)的cDNA模板由安徽省农业科学院畜牧兽医研究所实验室保存。
实施例1
一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重PCR检测方法，包括如下步骤：
S1、通过Primer Premier 5.0软件设计3对特异性扩增引物；依据引物设计原则，在病毒基因组保守区域选取特异性引物，引物之间避免形成二聚体或发夹结构，引物与模板间避免产生错配，同时3对引物退火温度保持一致，以最大程度提高PCR的效率。
番鸭细小病毒正向引物序列：5′-AACTGAGAGATGACATGAAT-3′，番鸭细小病毒反向引物序列：5′-ACTTGCTTCTCCTCCACTAT-3′，退火温度为48℃，扩增后片段长度为628bp；
鹅细小病毒正向引物序列：5′-GTCCGGGTAGACCAGAAA-3′，鹅细小病毒反向引物序列：5′-CTCAGGAGTCACAGGAAT-3′，退火温度为48℃，扩增后片段长度为432bp；
禽腺病毒4型正向引物序列：5′-AACTACATCGGGTTCAGG-3′，禽腺病毒4型反向引物序列：5′-AGTCCACGAAGGTCTGAT-3′，退火温度为48℃，扩增后片段长度为979bp。
S2、根据病毒DNA快速提取试剂盒说明书，提取番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的DNA。通过核酸蛋白测定仪测定上述所有提取的核酸浓度和纯度，取纯度和浓度均较高的核酸，优选取A260/A280值在1.8～2.0之间的核酸，于-20℃保存备用；
S3、将S2中获取的所有的DNA混合后进行PCR扩增；
PCR扩增体系：混合后总的DNA 1μL、S1中设计的3对特异性引物各20pmol、PremixTaq DNA聚合酶14μL、灭菌双蒸水补足至25μL；
PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸3min，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；
S4、通过质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
结果如图1所示，采用该方法对番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的检测，均能扩增出与试验设计大小相符的628bp，432bp，979bp的条带。
实施例2
三重PCR特异性实验
制备7个样品，第一个为番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型混合模板，第2-7个分别为番鸭细小病毒、鹅细小病毒、禽腺病毒4型、鸭黄病毒、鸭I型肝炎病毒和禽呼肠孤病毒模板，将上述8个样品分别进行三重PCR扩增，PCR扩增体系和扩增条件同实施例1，通过质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
结果如图2所示，采用该方法对番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的检测，均能扩增出与试验设计大小相符的628bp，432bp，979bp的条带，而鸭黄病毒、鸭I型肝炎病毒和禽呼肠孤病毒在相同位置却无特异性扩增条带。
实施例3
三重PCR敏感性实验
制备总浓度为20ng/μL的番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型混合核酸模板，采用10倍递进梯度稀释至200fg/μL，分别对上述不同浓度的核酸核酸模板进行三重PCR扩增，PCR扩增体系和扩增条件同实施例1，通过质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
结果如图3所示，该三重PCR最低能同时检测到2pg/μL的番鸭细小病毒和禽腺病毒核酸模板，20pg/μL的鹅细小病毒模板。
实施例4
三重PCR重复性实验
在相同条件下，对收集的8份已鉴定的患有番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型疾病的病料进行基因组提取和三种PCR扩增，PCR扩增体系和扩增条件同实施例1，通过质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
结果如图4所示，利用建立的三重PCR检测方法，对收集的病料进行检测，PCR产物经质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳显示，8次提取的基因组混合模板的PCR扩增结果均出现了三条清晰明亮的目的条带。结果表明，建立的番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型三重PCR检测方法具有良好的重复性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、根据番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的基因保守序列，分别设计3对特异性扩增引物；
番鸭细小病毒正向引物序列：5′-AACTGAGAGATGACATGAAT-3′，番鸭细小病毒反向引物序列：5′-ACTTGCTTCTCCTCCACTAT-3′
鹅细小病毒正向引物序列：5′-GTCCGGGTAGACCAGAAA-3′，鹅细小病毒反向引物序列：5′-CTCAGGAGTCACAGGAAT-3′
禽腺病毒4型正向引物序列：5′-AACTACATCGGGTTCAGG-3′，禽腺病毒4型反向引物序列：5′-AGTCCACGAAGGTCTGAT-3′；
S2、提取番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型DNA；
S3、将S2中获取的所有的DNA混合后进行PCR扩增；
S4、通过电泳检测S3中的PCR产物。
2.根据权利要求1所述的一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重PCR检测方法，其特征在于，所述S1中，通过Primer Premier 5.0软件设计3对特异性扩增引物。
3.根据权利要求1所述的一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重PCR检测方法，其特征在于，所述S1中，合成3对特异性扩增引物时的退火温度均为48℃。
4.根据权利要求1所述的一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重PCR检测方法，其特征在于，所述S3中，PCR扩增体系：混合后总的DNA 1μL、S1中设计的3对特异性引物各20pmol、Premix Taq DNA聚合酶14μL、灭菌双蒸水补足至25μL；
PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸3min，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。
5.根据权利要求1所述的一种番鸭细小病毒、鹅细小病毒和禽腺病毒4型的三重PCR检测方法，其特征在于，所述S4中，通过质量浓度为2.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
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