CN103255229B - 一管pcr式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种一管PCR式鉴别诊断鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ ID NOs：1-3。本发明的试剂盒适合鉴定鹅或番鸭动物的肝、脾和肾脏组织样品、泄殖腔棉拭子、鸭或鹅胚尿囊液以及细胞培养物样品中的GPV和MDPV。所述试剂盒在使用时包括下述步骤：(1)从待检鹅或番鸭动物获取待检样品，并对待检样品提取基因组DNA；(2)将步骤(1)获得的待检样品的基因组DNA与三种引物SEQ ID NOs：1-3一起以适量放置在一个PCR管中，进行PCR反应；和(3)电泳检测PCR产物，并根据PCR产物大小鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒，其中约700bp的特异性DNA条带表示存在鹅细小病毒，约300bp的特异性DNA条带表示存在番鸭细小病毒，同时存在约700bp和约300bp的条带表示同时存在鹅细小病毒和番鸭细小病毒。

Description

一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ ID NOs：1-3。本发明还提供SEQ ID NOs：1-3所示的引物在制备一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒中的应用。

背景技术

鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)可引起雏鹅急性或亚急性败血性传染病^[1]，它不仅侵害雏鹅和4-8周龄小鹅，也感染雏番鸭^[2]，危害极为严重；番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)引起并且以雏番鸭为易感群体的一种急性传染性病毒病，临床表现为腹泻、呼吸困难、脚软、渗出性肠炎等，死亡率和发病率都很高^[3]。GPV和MDPV在理化特性、形态结构包括基因组结构以及免疫学特性等方面非常接近，但二者在致病性上却有较大差异：MDPV只能感染番鸭及番鸭源细胞，GPV既能感染鹅又可以感染番鸭及其体外培养细胞。二者均属于细小病毒科细小病毒属，在形态上难以鉴别，同时在血清学上又有交叉反应^[4]，目前急需一种特异性强、快速灵敏且能够区分这两种疾病的诊断方法。NS蛋白为病毒的非结构蛋白，在进化过程中较为保守，主要参与DNA的复制和转录的调节^[5]。

根据GenBank中GPV和MDPV NS基因序列保守区设计1个通用上游引物，在根据GPV和MDPV毒株序列各自特异性保守区设计两个下游引物；获得扩增片段为部分NS2蛋白的基因序列，根据扩增片断长短不同进而达到快速鉴别感染病毒GPV和MDPV的目的。

发明内容

本发明的目的是通过一管PCR来鉴别鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)。

为实现上述目的，本发明提供一种一管PCR式鉴别诊断鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明。

本研究在引物设计过程中充分考虑了引物的普适性，包括了GenBank中所有的国家和地区的代表性毒株。例如，GPV病毒包括了匈牙利、德国、中国和台湾地区，病毒分离株时间跨度为30余年(1960s年代至-2009年)。由于GenBank MDPV病毒只有中国和匈牙利报道过3个毒株，时间跨度为1988年至1996年间的代表性毒株。GPV和MDPV的NS基因具有细小病毒普遍存在的高度保守区，和针对不同型病毒特异性保守区；根据GenBank收录的GPV和MDPV的NS基因保守区(见图1、图2、图3)，设计合成了3个特异性引物。其中上游引物依据GPV和MDPV高度保守区设计了GPV  和MDPV  的通用引物pGDP：5’CTATTGCCCATGCTGTACCCTTCTATGGCTG3’(图1，SEQ ID NO：1)，pGDP引物序列对于GPV和MDPV都高度保守，表明该引物序列可用于GPV和MDPV毒株的PCR扩增；另外根据GPV和MDPV各自毒株序列的特异性分别合成了各自的下游特异性引物：MDPV的下游引物为pDPR：5’CCTTCCAGCTTATGGGAAAGA3’(图2，SEQ ID NO：2)，引物序列对于MDPV毒株高度保守，但对于GPV则差异性较大，因此该引物序列只适用于MDPV的PCR扩增；GPV的下游引物为pGPR：5’ACATCCATAGAATTGTCATAAG3’(图3，SEQ ID NO：3)，引物序列对于GPV毒株高度保守，而对于MDPV则差异性较大，表明该引物只适用于GPV毒株的PCR扩增检测，不能扩增或检测MDPV毒株。因此，该3对引物可以用于GPV和MDPV的鉴别诊断。

表1.引物设计所用番鸭和鹅细小病毒信息

在本发明的试剂盒中，所用的引物是利用GPV和MDPV的NS基因(见图1、图2和图3，SEQ ID NO：4-16提供了一些MDPV毒株和一些GPV毒株的NS基因序列)进行设计的，其上游引物对GPV和MDPV是通用的，下游引物是针对不同类型的毒株本身的特异性保守区进行设计的。引物设计参考的GenBank毒株如下：

具体的，本发明的试剂盒共包含三条引物：上游通用引物SEQ ID NO：1，对番鸭细小病毒特异性的下游引物SEQ ID NO：2和对鹅细小病毒特异性的下游引物SEQ ID NO：3。

在本发明的试剂盒中，所用的处理待检样品的试剂主要是基因组DNA提取试剂。一般地，待检样品可以为待检鹅或番鸭动物的肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鹅尿囊液以及细胞培养物。本领域技术人员可以根据所用的待检样品选择适当的基因组DNA提取试剂和基因组DNA提取方法，这是在本领域技术人员的能力范围之内的。例如，常用的基因组DNA提取方法是蛋白酶K提取方法[6]，其主要使用蛋白酶K，苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为1∶1∶1)混合液，醋酸钠和乙醇等。

在本发明的试剂盒中，所述PCR试剂包括PCR酶，例如，Taq，dNTP储液等，这些PCR试剂均为市售试剂，对其没有特别的要求。

使用本发明的试剂盒检测待检样品时，首先利用基因组DNA提取试剂对待检样品提取DNA，将提取的基因组DNA与试剂盒中的3个引物放在同一个PCR管中，加入适量的PCR试剂，通过一次PCR，最后将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色显现PCR产物。根据PCR产物的大小即可判断是否为水禽细小病毒感染，并区分感染的类型是GPV还是MDPV。具体地，没有300bp和700bp的特异性扩增条带结果表示没有GPV和MDPV的感染；扩增产物为300bp表示是番鸭细小病毒感染，扩增产物为700bp表示是GPV感染；扩增产物300bp和700bp都有表示是GPV和MDPV共感染。

表2.一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒中的引物序列

相应地，本发明还提供一种一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒感染的方法，所述方法包括下述步骤：

(1)从待检鹅或番鸭动物获取待检样品，并对待检样品提取基因组DNA；

(2)将步骤(1)获得的待检样品的基因组DNA与三种引物SEQ IDNOs：1-3一起以适量放置在一个PCR管中，进行PCR反应；和

(3)电泳检测PCR产物，并根据PCR产物鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒。

其中，步骤(1)的待检样品取自鹅或番鸭动物的肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鹅胚尿囊液以及细胞培养物。

步骤(2)的PCR扩增条件可以为94℃，2min；94℃40s，55℃30s，72℃1min，25个循环；最后72℃，7min。

优选地，步骤(2)的PCR扩增条件为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s；72℃延伸1min，25个循环；最后72℃延伸7min。

步骤(3)所述的PCR鉴别方法具体可为：进行一次PCR反应，反应结束后进行PCR样品凝胶电泳，紫外灯下观察电泳胶的特异DNA条带。GPV阳性对照在约700bp处有一条特异的DNA条带；MDPV阳性对照在约300bp处有一条特异的DNA条带，阴性对照则无相应的特异条带出现。

本领域技术人员应该理解，上述取样方法、PCR程序的选择以及鉴定PCR产物的方法均为本领域的常规技术，本领域技术人员可以进行适当的调整。

本发明还提供SEQ ID NOs：1-3所示的引物在制备一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒的应用。

由此可见，本发明的优点是：提供了一种一管PCR式鉴别鹅和番鸭细小病毒的试剂盒和方法，该试剂盒和方法具有快速、灵敏、特异、经济和适用范围广的特点。具体地，一方面，只需合成3个引物，上游引物为通用引物；另一方面，只需一管一次PCR反应，2-3小时后，即可判定是否为GPV或MDPV感染，无需多次重复PCR反应，据有经济和节省时间的优点。再一方面，可从肝脏、脾脏、肾、棉拭子、鹅或鸭胚尿囊液以及细胞培养物中鉴定GPV和MDPV，范围广。

附图说明

从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

图1显示MDPV和GPV毒株NS基因共有序列分析，阴影部分为MDPV和GPV通用性引物pGDP序列选择区。

图2显示MDPV和GPV毒株NS基因序列分析。阴影部分为MDPV特异性引物pDPR序列选择区。

图3显示MDPV和GPV毒株NS基因序列分析。阴影部分为GPV特异性引物pGPR序列选择区。

图4显示鹅细小病毒和番鸭细小病毒一管PCR扩增结果，其中，泳道1：DNA分子量标准(DL2000)；泳道2：鹅细小病毒D3LV株扩增产物；泳道3：鹅细小病毒广东株扩增产物；泳道4：番鸭细小病毒HLJ-5扩增产物；泳道5：番鸭细小病毒WDPV3扩增产物；泳道6：番鸭细小病毒Guangdong-2扩增产物；泳道7：番鸭细小病毒HE扩增产物；8：DNA分子量标准(DL2000)；9：阴性对照。

具体实施方式

以下通过具体实施例描述本发明，然而，本领域技术人员应该理解，所述实施例仅是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围。

除非另外说明，下述实施例中用到的试剂均为市售试剂。

实施例1：一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒

1.获取被检样品

以本领域的常规取样方式选用鹅或鸭的肝脏、脾脏、肾、棉拭子、鹅或鸭胚尿囊液以及细胞培养物，被检样品应新鲜，或-20℃保存。

样品的预处理：

取3g肝脏、脾脏或肾样品加入3倍体积的PBS溶液研磨成悬浮液，-20℃冻融3次，常温下1000g离心10分钟，取上清用于DNA的提取；棉拭子反复捻动后去拭子，样品1000g离心10分钟，取上清用于DNA的提取；鹅或鸭胚尿囊液以及细胞培养物直接用于DNA的提取。

阴性样品：选取鸭胚或鹅胚尿囊液。阳性样品：GPV和MDPV接种鹅胚或鸭胚后收取的尿囊液。

2.样品DNA的提取：

采用蛋白酶K的方法[6]提取病毒基因组DNA，方法如下：取上述经过预处理的上清样品200μL，加入蛋白酶K(购自Merck生物技术有限公司)并使蛋白酶K终浓度为100μg/mL，混匀后置50℃水浴1h后，将样品用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比1∶1∶1)抽提2次，充分振摇，12000rpm离心10min，取上清液并用1/3体积醋酸钠和2倍体积无水乙醇混匀，置-20℃冰箱30min；后在12000rpm离心10min，弃上清，室温干燥，加入20～30μL ddH₂O溶解沉淀，-20℃保存备用。

3.一管PCR反应鉴定GPV和MDPV

PCR  反应所需引物：上游通用引物pGDP：5’CTATTGCCCATGCTGTACCCTTCTATGGCTG3’(SEQ ID NO：1)，MIDPV特异性下游引物pDPR：5’CCTTCCAGCTTATGGGAAAGA3’(SEQ ID NO：2)。(所用的引物均由哈尔滨博士生物技术公司合成)。GPV特异性下游引物pGPR：5’ACATCCATAGAATTGTCATAAG 3’(SEQ ID NO：3)，

PCR反应体系：在0.5ml PCR管(购自弘博生物技术有限公司)中一次加入双蒸水15.8μL，提取的待检样品基因组DNA 3μL，10×PCR缓冲液2μL，dNTPs 1μL，引物pGDP、pGPR和pDPR各1μL，Ex-Taq酶0.2μL。PCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s；72℃延伸1min，25个循环；最后72℃延伸7min。

PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测(图1)，同时加入2kb DNA标准分子量作为参照(泳道1和8)，取凝胶置于紫外灯下观察。

结果判定：GPV和MDPV阳性对照分别在约700bp和300bp处各有一条特异的DNA条带，阴性对照则无相应的特异条带出现，待检样品在700bp相应位置出现特异条带则判定分别为GPV感染(泳道2，3)，待检样品在300bp相应的位置出现特异性条带则判定为MDPV感染(泳道4，5，6，7)；如果待检样品在700bp和300bp没有相应的条带则证明无GPV和MDPV感染(泳道9)。

进一步验证：将获得的样品700bp和300bp PCR产物进行胶回收(使用购自上海华舜生物技术有限公司的胶回收试剂盒)后进行测序，将序列提交GenBank进行BLAST比较分析。BLAST结果显示：700bp和300bpPCR产物序列分别与GenBank中的GPV和MDPV序列的同源性最高，进一步验证检测结果的正确性。

应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

参考文献

[1]方定一.小鹅瘟的介绍[J].中国兽医杂志，1962，8：19-20.

[2]殷震，刘景华主编.动物病毒学[M].第二版.北京：科学出版社，1997：1165-1168.

[3]甘孟侯主编.中国禽病学[M].北京：中国农业出版社，1999：132-135.

[4]侯学新.番鸭细小病毒生物学特性的研究进展[J].中国家禽，2003，25(4)：37-38.

[5]Naeger L K，Cater J，Pintel D J.The small nonstructural protein(NS2)ofthe parvovirus minute virus of mice is required for efficient DNAreplication and infections virus production in a cell-type specific manner.J Virol，1990，64：6166-6175.

[6]J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南[M].第三版.北京：科学出版社，2002.

Claims (10)

1.一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒，所述试剂盒包括引物、处理待检样品的试剂、PCR试剂和使用说明，其中所述引物为SEQ ID NOs：1-3。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述待检样品为待检鹅或番鸭动物的肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鹅胚尿囊液以及细胞培养物。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述处理待检样品的试剂是基因组DNA提取试剂。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中SEQ ID NO：1为关于鹅细小病毒和番鸭细小病毒通用的上游引物，SEQ ID NO：2为对番鸭细小病毒特异性的下游引物，SEQ ID NO：3为对鹅细小病毒特异性的下游引物。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中在使用时包括下述步骤：

(1)从待检鹅或番鸭动物肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鹅胚尿囊液以及细胞培养物获取待检样品，并对待检样品提取基因组DNA；

(2)将步骤(1)获得的待检样品的基因组DNA与三种引物SEQ IDNOs：1-3一起以适量放置在一个PCR管中，进行PCR反应；和

(3)电泳检测PCR产物，并根据PCR产物鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒，

其中约700bp的特异性DNA条带表示存在鹅细小病毒，约300bp的特异性DNA条带表示存在番鸭细小病毒，同时存在约700bp和约300bp的条带表示同时存在鹅细小病毒和番鸭细小病毒。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；最后72℃延伸7min。

7.SEQ ID NOs：1-3所示的引物在制备一管PCR式鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒的试剂盒中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其中所述试剂盒通过下述步骤进行鉴别：

(1)从待检鹅或番鸭动物获取待检样品，并对待检样品提取基因组DNA；

(2)将步骤(1)获得的待检样品的基因组DNA与三种引物SEQ IDNOs：1-3一起以适量放置在一个PCR管中，进行PCR反应；和

(3)电泳检测PCR产物，并根据PCR产物鉴别鹅细小病毒和番鸭细小病毒，

其中约700bp的特异性DNA条带表示存在鹅细小病毒，约300bp的特异性DNA条带表示存在番鸭细小病毒，同时存在约700bp和约300bp的条带表示同时存在鹅细小病毒和番鸭细小病毒。

9.根据权利要求8所述的应用，其中所述待检样品取自鹅或番鸭动物的肝脏、脾脏、棉拭子、鸭或鹅胚尿囊液以及细胞培养物。

10.根据权利要求8所述的应用，其中PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，25个循环；最后72℃延伸7min。