CN103320452A - 一种猪流行性腹泻病毒变异株n基因全序列的扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的扩增方法，包括如下具体步骤：1.提取猪流行性腹泻病毒变异株RNA；2.依据猪流行性腹泻病毒变异株的N基因全序列设计引物，并用RT-PCR的方法扩增猪流行性腹泻病毒变异株的N基因；3.PCR产物的克隆与测序分析：将PCR产物纯化并连接pMD18-T载体，转化trans5a感受态细胞，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序分析。可以通过该方法扩增获取病料中猪流行性腹泻病毒变异株的N基因、并可以捕获猪流行性腹泻病毒变异株在细胞培养传代过程中N基因序列的变化。也可以作为一种检测病料中PEDV的方法，并为PEDV的N基因相关研究奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及猪流行性腹泻病毒变异株N基因序列的扩增。属于生物检测技术领域。
背景技术
猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）引起的一种急性、高度接触性的传染病，常以急性肠炎和伴有脱水的水样腹泻为特征，各种年龄的猪均易感和对哺
乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。本病于1971年首先发现于英国，1978 年在英国和比利时首次报道，此后，欧洲和亚洲各国也报道了该病的暴发。我国在1973年分离到PEDV（经典毒株）。
2010年冬季至2011年春季全国各地猪场的猪群中先后发生严重的传染性腹泻疾病，发病突然，传播较快，流行范围广，流行时间长，应用各种抗生素防治无效，其发病率与死亡率很高，造成重大的经济损失。经研究表明，猪流行性腹泻病毒变异株是此次疫情的元凶（Jianfei Chen等Complete Genome Sequence of a Porcine Epidemic Diarrhea Virus Variant. J. Virol, 2012, 86: 3408）。
PEDV的N基因高度保守，例如，CV777和Brl/87两个分离株N基因序列仅有2个碱基的差异，LJB/03株与其他毒株的同源性也均在95%以上。N蛋白是由441个氨基酸组成、分子质量为55-58 ku、磷酸化的核衣壳蛋白，与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA合成过程中发挥重要作用。且N蛋白在PEDV的结构蛋白中所占比例最大，在感染的细胞中能得到大量表达。猪在感染PEDV的早期, 体内就能产生抗N蛋白的高水平抗体，所以利用N蛋白来建立PEDV诊断技术具有很好的应用前景。
由于N基因编码的N蛋白为衣壳蛋白，因此可以通过基因序列的变化来分析PEDV病毒的变异，为进一步分析我国PEDV变异株的遗传变异规律奠定基础。因此，本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的扩增方法，该方法能够扩增PEDV变异株N基因的全长，特别是在Vero细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的N基因全长。通过该方法可以捕获到PEDV变异株在细胞培养传代过程中N基因全序列的变化，从而通过N基因的遗传变异分析了解其与PEDV毒力或者免疫力的相关性。该方法扩增的目的片段长1326 bp，包含PEDV变异株全长N基因。
发明内容
技术问题
本发明目的在于提供一种用于扩增猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的方法。
技术方案
本发明通过分析GenBank中公开的猪流行性腹泻病毒变异株的N基因序列，设计引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如下：
PEDV-NF：5’-ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGAT-3’
PEDV-NR：5’-TTAATTTCCTGTGTCGAAGATCTCGTTG-3’。 该引物从感染猪流行性腹泻病毒变异株的病料中可扩增出1326 bp DNA片段。
具体地，本发明中扩增猪流行性腹泻病毒变异株N基因的方法是以样品总RNA为模板，进行RT-PCR反应，扩增出目的基因，纯化后即可获得猪流行性腹泻病毒N基因片段。
具体步骤如下：
1、提取病毒RNA：
取猪腹泻猪的粪便、肠道病料或各代次病毒培养液200μL移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入800μL的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；室温下保持5 min，加0.2ml氯仿，颠转混匀，然后在冰盒上放置10 min后，4℃,12000 g离心10 min；将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20 min；4℃,12000 g离心20 min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀； 弃上清液，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4℃,7500 g离心5 min，弃去乙醇；沉淀于室温下充分风干后，溶于15至20μL DEPC水中，-20℃保存备用。
2、RT-PCR扩增：
根据GenBank中公开的猪流行性腹泻病毒变异株N基因序列，设计RT-PCR引物，引物序列如下：
PEDV-NF：5’-ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGAT-3’
PEDV-NR：5’-TTAATTTCCTGTGTCGAAGATCTCGTTG-3’
以步骤1所得的病毒总RNA为模板，用上述引物，使用TransGen Biotech的One-step RT-PCR SuperMix试剂盒扩增PEDV变异株的N基因。PCR的反应参数是：45℃，30min；94℃,5min；94℃ 30s，58℃ 30s,72℃ 2min，共35个循环；72℃延伸10min。
3、PCR产物的克隆及测序分析：
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取1326 bp的N基因目的条带，使用AXYGEN DNA凝胶回收试剂盒回收。回收纯化的PCR产物连接pMD18-T载体，转化trans5a感受态细胞，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序分析。
有益效果
本发明所述猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的扩增方法，该方法能够扩增PEDV变异株N基因的全长，特别是在Vero细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的N基因全长。通过该方法可以捕获到PEDV变异株在细胞培养传代过程中N基因全序列的变化，从而通过N基因的遗传变异分析了解其与PEDV毒力或者免疫力的相关性。该方法扩增的目的片段长1326 bp，包含PEDV变异株全长N基因。
附图说明
图1是猪流行性腹泻病毒N基因的RT-PCR扩增结果，其中M为DS2000 DNA Marker；0：阴性对照；1-4：猪流行性腹泻病毒变异株样品。
图2为Vero细胞上不同PEDV代次的病毒序列用DNAstar软件进行序列比对的结果（序列前部分）。
图3为Vero细胞上不同PEDV代次的病毒序列用DNAstar软件进行序列比对的结果（序列后部分）。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明所述猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的扩增方法进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
引物的设计和合成
根据GenBank中公开的的猪流行性腹泻病毒变异株N基因的核苷酸序列，采用Primer 5.0设计引物，经过大量筛选得到如下序列的引物序列：
正向引物（PEDV-NF）的序列为：
5’-ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGAT-3’；
反向引物（PEDV-NR）序列为：
5’-TTAATTTCCTGTGTCGAAGATCTCGTTG-3’
根据上述核苷酸序列信息合成正向引物PEDV-NF和反向引物 PEDV-NR。将上述引物分别配置成浓度为20μmol/L的溶液，备用。
病毒总RNA的提取
（1）取流行性腹泻病毒（PEDV）感染猪腹泻的粪便、肠道病料或各代次病毒培养液200μL移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入800μL的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；
（2）室温下保持5 min，加0.2ml氯仿，颠转混匀，然后在冰盒上放置10 min后，4℃,12000 g离心10 min；
（3）将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20 min；4℃,12000 g离心20 min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；
（4）弃上清液，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4℃,7500 g离心5 min，弃去乙醇；
（5）沉淀于室温下充分风干后，溶于15至20μL DEPC水中，-20℃保存备用。
扩增
根据GenBank中公开的的猪流行性腹泻病毒（PEDV）N基因序列，设计RT-PCR引物，引物序列如下：
PEDV-NF：5’-TTTGGATCCATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGAT-3’
PEDV-NR：5’-ATAGTCGACATTTCCTGTGTCGAAGATCTCGTTG-3’
以步骤1所得的病毒总RNA为模板，用上述引物，使用TransGen Biotech的One-step RT-PCR SuperMix试剂盒扩增猪流行性腹泻病毒（PEDV）的N基因。PCR的反应参数是：45℃，30min；94℃,5min；94℃ 30s，58℃ 30s,72℃ 2min，共35个循环；72℃延伸10min。
目的基因的纯化与测序
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取1326 bp的N基因目的条带，使用AXYGEN DNA凝胶回收试剂盒回收。
回收纯化的PCR产物连接pMD18-T载体，转化trans5a感受态细胞，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序分析。
实验结果
按照本发明中的扩增方法，利用引物PEDV-NF和PEDV-NR可从感染猪流行性腹泻病毒变异株的病料提取的总RNA中扩增出1326 bp的DNA片段，并回收纯化得到PEDV N基因片段，连接T载体测序后可以得知病毒N基因片段序列。结果表明，该方法可以有效从病料、细胞毒中检测PEDV或获得PEDV的N基因片段，并测得其序列。
PEDV原病料病毒（即第1代），及其在Vero细胞传代第10、20、30、35、40代N基因片段，采用以上方法扩增后，测序结果：
第1代病毒N基因片段序列如下：
ATGGCTTCTGTCAGCTTTCAGGATCGTGGCCGCAAACGGGTGCCATTATCCCTCTATGCCCCTCTTAGGGTTACTAATGACAAACCCCTTTCTAAGGTACTCGCAAACAACGCTGTACCCACTAATAAGGGGAATAAGGACCAGCAAATTGGATACTGGAATGAGCAAATTCGCTGGCGCATGCGCCGTGGTGAGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTAACCTGGGTGTCAGAAAGGCGTCTGAAAAGCCAATTATTCCAAAATTCTCTCAACAGCTCCCCAGTGTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTGCTTCACGTACAAATTCGCGTAGCAGGAGTCGTGGCAATGGCAACAACAGGTCCAGATCTCCGAGTAACAACAGAGGCAACAACCAGTCCCGTGGTAATTCACAGAATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAGCTTCTCAGAATAGAGGAGGCAATAATAATAACAATAACAAGTCTCGTAACCAGTCCAAGAACAGGAACCAGTCAAATGACCGTGGTGGAATGACATCACGCGATGATCTGGTGGCTGCTGTCAAGGATGCCCTTAAATCTTTGGGTATTGGAGAAAATCCTGACAGGCATAAGCAACAGCAGAAGCCTAAGCAGGAAAAGTCTGACAACAGCGGAAAAAATACACCTAAGAAGAACAAATCCAGGGCCACTTCGAAGGAACGTGACCTCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCAGGGGGGGCTTCAAAAATTTTGGAGATGCGGAATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCGTCAGGCTATGCTCAGATCGCCAGTTTGGCACCAAATGTTGCAGCATTGCTCTTTGGTGGTAATGTGGCTGTTCGTGAGCTAGCGGACTCTTACGAGATTACATATAACTATAAAATGACTGTGCCAAAGTCTGATCCAAATGTTGAGCTTCTTGTTTCACAGGTGGATGCATTTAAAACTGGGAATGCAATACCCCAGAGAAAGAAGGAAAAGAAGAACAAGCGTGAAACCACGCAGCAGCAGAATGAAGAGGCCATCTACGATGATGTGGGTGTGCCATCTGATGTGACCCATGCCAATCTGGAATGGGACACAGCTGTTGATGGTGGTGACACGGCCGTTGAAATTATCAACGAGATCTTCGACACAGGAAATtaa
第10代病毒N基因片段序列如下：
ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGATCGTGGCCGCAAACGGGTGCCATTATCCCTCTATGCCCCTCTTAGGGTTACTGATGACAAACCCCTTTCTAAGGTACTTGCAAATAATGCTGTACCCACTAATAAAGGAAATAAGGACCAGCAAATTGGATACTGGAATGAGCAAATTCGCTGGCGCATGCGCCGTGGTGAGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGACCCCCGCTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTAACCTGGGTGTCAGAAAGGCGTCTGAAAAGCCTATCATTCCAAATTTCTCTCAACAGCTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTACTTCACGTGCAAATTCACGTAGCAGGAGTCGTGGTAACGGCAACAACAGGTCCAGATCTCCAAGTAACAACAGAGGCAACAACCAGTCCCGCGGTAATTCACAGAATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAGCTTCTCAGAACAGAGGAGGCAATAATAATAATAATAACAAGTCTCGTAACCAGTCCAAGAACAGAAACCAGTCAAATGACCGTGGTGGTGTAACATCACGCGATGATCTGGTGGCTGCTGTCAAGGATGCCCTTAAATCTTTGGGTATTGGCGAAAACCCTGACAAGCTTAAGCAACAGCAGAAGCCCAAACAGGAAAGGTCTGACAGCAGCGGCAAAAATACACCTAAGAAGAACAAATCCAGAGCCACTTCGAAAGAACGTGACCTCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCAGGGGAGGCTTCAAAAATTTTGGAGATGCGGAATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCCTCAGGCTATGCTCAGATCGCCAGTTTAGCACCAAATGTTGCGGCATTGCTCTTTGGTGGTAATGTGGCTGTTCGTGAGCTAGCGGACTCTTACGAGATTACATATAATTATAAAATGACTGTGCCAAAGTCTGATCCAAATGTAGAGCTTCTTGTTTCACAGGTGGATGCATTTAAAACTGGGAATGCAAAACCCCAGAGAAAGAAGGAAAAGAAGAACAAGCGTGAAACCACGCAGCAGCTGAATGAAGAGGCCATCTACGATGATGTGGGTGTGCCATCTGATGTGACTCATGCCAATTTGGAATGGGACACAGCTGTTGATGGTGGTGACACGGCCGTTGAAATTATCAACGAGATCTTCGACACAGGAAATtaa
第20代病毒N基因片段序列如下：
ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGATCGTGGCCGCAAACGGGTGCCATTATCCCTCTATGCCCCTCTTAGGGTTACTGATGACAAACCCCTTTCTAAGGTACTTGCAAATAATGCTGTACCCACTAATAAAGGAAATAAGGACCAGCAAATTGGATACTGGAATGAGCAAATTCGCTGGCGCATGCGCCGTGGTGAGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGACCCCCGCTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTAACCTGGGTGTCAGAAAGGCGTCTGAAAAGCCTATCATTCCGAATTTCTCTCAACAGCTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTACTTCACGTGCAAATTCACGTAGCAGGAGTCGTGGTAATGGCAACAACAGGTCCAGATCTCCAAGTGACAACAGAGGCAACAACCAGTCCCGCGGTAATTCACAGAATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAGCTTCTCAGAACAGAGGAGGCAATAATAATAACAATAACAAGTCTCGTAACCAGTCCAAGAACAGAAACCAGTCAAATGACCGTGGTGGTGTAACATCACGCGATGATCTGGTGGCTGCTGTCAAGGATGCCCTTAAATCTTTGGGTATTGGCGAAAACCCTGACAAGCTTAAGCAACAGCAGAAGCCCAAACAGGAAAGGTCTGACAGCAGCGGCAAAAATACACCTAAGAAGAACAAATCCAGAGCCACTTCGAAAGAACGTGACCTCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCAGGGGAGGCTTCAAAAATTTTGGAGATGCGGAATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCCTCAGGCTATGCTCAGATCGCCAGTTTAGCACCAAATGTTGCGGCATTGCTCTTTGGTGGTAATGTGGCTGTTCGTGAGCTAGCGGACTCTTACGAGATTACATATAATTATAAAATGACTGTGCCAAAGTCTGATCCAAATGTAGAGCTTCTTGTTTCACAGGTGGATGCATTTAAAACTGGGAATGCAAAACCCCAGAGAAAGAAGGAAAAGAAGAACAAGCGTGAAACCACGCAGCAGCTGAATGAAGAGGCCATCTACGATGATGTGGGTGTGCCATCTGATGTGACTCATGCCAATTTGGAATGGGACACAGCTGTTGATGGTGGTGACACGGCCGTTGAAATTATCAACGAGATCTTCGACACAGGAAATtaa
第30代病毒N基因片段序列如下：
ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGATCGTGGCCGCAAACGGGTGCCATTATCCCTCTATGCCCCTCTTAGGGTTACTAATGACAAACCCCTTTCTAAGGTACTCGCAAACAACGCTGTACCCACTAATAAGGGGAATAAGGACCAGCAAATTGGATACTGGAATGAGCAAATTCGCTGGCGCATGCGCCGTGGTGAGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTAACTTGGGTGTCAGAAAGGCGTCTGAAAAGCCAATTATTCCAAAATTCTCTCAACAGCTCCCCAGTGTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTGCTTCACGTACAAATTCGCGTAGCAGGAGTCGTGGCAATGGCAACAACAGGTCCAGATCTCCGAGTAACAACAGAGGCAACAACCAGTCCCGTGGTAATTCACAGAATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAGCTTCTCAGAACAGAGGAGGCAATAATAATAACAATAACAGGTCTCGTAACCAGTCCAAGAACAGGAACCAGTCAAATGACCGTGGTGGAATGACATCACGCGATGATCTGGTGGCTGCTGTCAAGGATGCCCTTAAATCTTTGGGTATTGGAGAAAATCCTGACAGGCATAAGCAACAGCAGAAGCCTAAGCAGGAAAAGTCTGACAACAGCGGAAAAAATACACCTAAGAAGAACAAATCCAGGGCCACTTCGAAGGAACGTGACCTCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCAGGGGGGGCTTCAAAAATTTTGGAGATGCGGAATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCGTCAGGCTATGCTCAGATCGCCAGTTTGGCACCAAATGTTGCAGCATTGCTCTTTGGTGGTAATGTGGCTGTTCGTGAGCTAGCGGACTCTTACGAGATTACATATAACTATAAAATGACTGTGCCAAAGTCTGATCCAAATGTTGAGCTTCTTGTTTCACAGGTGGATGCATTTAAAACTGGGAATGCAATACCCCAGAGAAAGAAGGAAAAGAAGAACAAGCGTGAAACCGCGCAGCAGCAGAATGAAGAGGCCATCTACGGTGATGTGGGTGTGCCATCTGATGTGACCCATGCCAATCTGGAATGGGACACAGCTGTTGATGGTGGTGACACGGCCGTTGAAATTATCAACGAGATCTTCGACACAGGGAATtaa
第35代病毒N基因片段序列如下：
ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGATCGTGGCCGCAAACGGGTGCCATTATCCCTCTATGCCCCTCTTAGGGTTACTAATGACAAACCCCTTTCTAAGGTACTCGCAAACAACGCTGTACCCACTAATAAGGGGAATAAGGACCAGCAAATTGGATACTGGAATGAGCAAATTCGCTGGCGCATGCGCCGTGGTGAGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTAACTTGGGTGTCAGAAAGGCGTCTGAAAAGCCAATTATTCCAAAATTCTCTCAACAGCTCCCCAGTGTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTGCTTCACGTACAAATTCGCGTAGCAGGAGTCGTGGCAATGGCAACAACAGGTCCAGATCTCCGAGTAACAACAGAGGCAACAACCAGTCCCGTGGTAATTCACAGAATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAGCTTCTCAGGACAGAGGAGGCAATAATAATAACAACAACAGGTCTCGTAACCAGTCCAAGAACAGGAACCAGTCAAATGACCGTGGTGGAATGACATCACGCGATGATCTGGTGGCTGCTGTCAAGGATGCCCTTAAATCTTTGGGTATTGGAGAAAATCCTGACAGGCATAAGCAACAGCAGAAGCCTAAGCAGGAAAAGTCTGACAACAGCGGAAAAAATACACCTAAGAAGAACAAATCCAGGGCCACTTCGAAGGAACGTGACCTCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCAGGGGGGGCTTCAAAAATTTTGGAGATGCGGAATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCGTCAGGCTATGCTCAGATCGCCAGTTTGGCACCAAATGTTGCAGCATTGCTCTTTGGTGGTAATGTGGCTGTTCGTGAGCTAGCGGACTCTTACGAGATTACATATAACTATAAAATGACTGTGCCAAAGTCTGATCCAAATGTTGAGCTTCTTGTTTCACAGGTGGATGCATTTAAAACTGGGAATGCAATACCCCAGAGAAAGAAGGAAAAGAAGAACAAGCGTGAAACCACGCAGCAGCAGAATGAAGAGGCCATCTACGATGATGTGGGTGTGCCATCTGATGTGACCCATGCCAATCTGGAATGGGACACAGCTGTTGATGGTGGTGACACGGCCGTTGAAATTATCAACGAGATCTTCGACACAGGAAATtaa
第40代病毒N基因片段序列如下：
ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGATCGTGGCCGCAAACGGGTGCCATTATCCCTCTATGCCCCTCTTAGGGTTACTAATGACAAACCCCTTTCTAAGGTACTCGCAAACAACGCTGTACCCACTAATAAGGGGAATAAGGACCAGCAAATTGGATACTGGAATGAGCAAATTCGCTGGCGCATGCGCCGTGGTGAGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGCCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGCGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTAACTTGGGTGTCAGAAAGGCGTCTGAAAAGCCAATTATTCCAAAATTCTCTCAACAGCTCCCCAGTGTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTGCTTCACGTACAAATTCGCGTAGCAGGAGTCGTGGCAATGGCAACAACAGGTCCAGATCTCCGAGTAACAACAGAGGCAACAACCAGTCCCGTGGTAATTCACAGAATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAGCTTCTCAGAACAGAGGAGGCAATAATAATAACAACAACAGGTCTCGTAACCAGTCCAAGAACAGGAACCAGTCAAATGACCGTGGTGGAATGACATCACGCGATGATCTGGTGGCTGCTGTCAAGGATGCCCTTAAATCTTTGGGTATTGGAGAAAATCCTGACAGGCATAAGCAACAGCAGAAGCCTAAGCAGGAAAAGTCTGACAACAGCGGAAAAAATACACCTAAGAAGAACAAATCCAGGGCCACTTCGAAGGAACGTGACCTCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCAGGGGGGGCTTCAAAAATTTTGGAGATGCGGAATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCGTCAGGCTATGCTCAGATCGCCAGTTTGGCACCAAATGTTGCAGCATTGCTCTTTGGTGGTAATGTGGCTGTTCGTGAGCTAGCGGACTCTTACGAGATTACATATAACTATAAAATGACTGTGCCAAAGTCTGATCCAAATGTTGAGCTTCTTGTTTCACAGGTGGATGCATTTAAAACTGGGAATGCAATACCCCAGAGAAAGAAGGAAAAGAAGAACAAGCGTGAAACCACGCAGCAGCAGAATGAAGAGGCCATCTACGATGATGTGGGTGTGCCATCTGATGTGACCCATGCCAATCTGGAATGGGACACAGCTGTTGATGGTGGTGACACGGCCGTTGAAATTATCAACGAGATCTTCGACACAGGAAATtaa
用NDAstar软件分析各代病毒N基因序列，序列比对结果如图2和图3所示。
由比较结果可知：PEDV在细胞传代第20代之前存在一些特异性突变，30代之后遗传特征比较稳定，可能导致病毒毒力和免疫原性的变化。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其构架形式能够灵活多变，可以派生系列产品。只是做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的扩增方法
<130> 0
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> PEDV-NF
<222> (1)..(24)
<223>
<400> 1
atggcttctg tcagttttca ggat 24
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> PEDV-NR
<222> (1)..(28)
<223>
<400> 2
ttaatttcct gtgtcgaaga tctcgttg 28
Claims (1)
1.一种猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）提取病毒RNA：
（1）取猪腹泻的粪便、肠道病料或各代次病毒培养液200μL移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入800μL的Trizol试剂，剧烈震荡摇匀；
（2）室温下保持5 min，加0.2ml氯仿，颠转混匀，然后在冰盒上放置10 min后，4℃,12000 g离心10 min；
（3）将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20 min；4℃,12000 g离心20 min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；
（4）弃上清液，加入75%的乙醇洗涤沉淀，然后4℃,7500 g离心5 min，弃去乙醇；
（5）沉淀于室温下充分风干后，溶于15至20μL DEPC水中，-20℃保存备用；
2） RT-PCR扩增：
根据GenBank公开的猪流行性腹泻病毒变异株N基因序列，设计RT-PCR引物，引物序列如下：
PEDV-NF：5’-ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGAT-3’
PEDV-NR：5’-TTAATTTCCTGTGTCGAAGATCTCGTTG-3’
以步骤1所得的病毒总RNA为模板，用上述引物，使用TransGen Biotech的One-step RT-PCR SuperMix试剂盒扩增猪流行性腹泻病毒PEDV的N基因，PCR的反应参数是：45℃，30min；94℃,5min；94℃ 30s，58℃ 30s,72℃ 2min，共35个循环；72℃延伸10min；
3） PCR产物的克隆及测序分析：
（1）PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切取1400bp的N基因目的条带，使用Axygen DNA凝胶回收试剂盒回收；
（2）回收纯化的PCR产物连接pMD18-T载体，转化trans5a感受态细胞，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序分析。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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