CN104561371A - 用于检测猪流行性腹泻病毒的pcr引物、试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents
用于检测猪流行性腹泻病毒的pcr引物、试剂盒及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104561371A CN104561371A CN201410755471.3A CN201410755471A CN104561371A CN 104561371 A CN104561371 A CN 104561371A CN 201410755471 A CN201410755471 A CN 201410755471A CN 104561371 A CN104561371 A CN 104561371A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pedv
- epidemic diarrhea
- diarrhea virus
- primer
- porcine epidemic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了用于检测猪流行性腹泻病毒的PCR引物、试剂盒及其制备方法和应用，所述检测方法以总RNA？为模板，利用上述引物进行反转录和荧光PCR扩增，反应结束后根据Ct值的大小判定结果。本发明的引物特异性好，准确性高，敏感性好，检测方法快速简单，为猪流行性腹泻病毒的检测提供了保证。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及用于检测猪流行性腹泻病毒的PCR引物、试剂盒及其制备方法和应用。
背景技术
猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是一种以猪腹泻、呕吐和脱水为主要特征的急性高度接触性肠道传染病，此病多发于冬季12月至来年2月寒冬季节，在夏季也可发生，尤其哺乳仔猪受害最严重。新生仔猪PED潜伏期为24-36小时。病猪表现呕吐、腹泻和脱水，年龄越小，症状越重，其病原是猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）。
该病毒最早分离于比利时表现腹泻的猪群，并命名为类冠状病毒CV777株，而后英国、匈牙利、西德、加拿大、日本、韩国等国相继报道有本病的发生。我国自上世纪80年代初开始陆续有猪流行性腹泻的发生，特别是最近3年以来，猪流行性腹泻已成为最重要的猪群疫病，不仅感染面广，而且发病率和死亡率都居高不下，给养猪业带来了巨大的经济损失。鉴于猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎在临床上很难区别，而且PEDV又难以在细胞上增殖和培养，所以，早期诊断对本病的防治具有极其重要的意义，此前，我国尚无PEDV毒株的特异性荧光RT-PCR检测技术，因此建立一种快速，高灵敏度的诊断方法势在必行。
发明内容
本发明目的在于提供用于检测猪流行性腹泻病毒的PCR引物、试剂盒及其制备方法和应用，用于猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
用于检测猪流行性腹泻病毒的PCR引物，其特征在于它包括引物SEQ ID No:1- SEQ ID No:3：
正向引物PEDV-NF：5’-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT -3’；
反向引物PEDV-NR：5’-TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT -3’；
荧光探针引物PEDV-NP：5’-TGTTGCCATTACCACGACTCCTGC -3’。
这3条引物可以从感染猪流行性腹泻的样品中扩增到122bp的特异性条带，通过荧光PCR仪器可以检测得到。
本发明与现有技术相比有许多优点和积极效果：本发明通过分析猪流行性腹泻病毒保守的N基因序列，经过一系列比较分析，最终确定了3条特异性引物，可以用于猪流行性腹泻病毒的荧光RT-PCR检测。本发明经过大量实验证实，利用这三条特异性引物建立的荧光定量RT-PCR能够准确定量、高度敏感和特异性地检测猪流行性腹泻病毒的感染，该技术可用于猪流行性腹泻病毒的流行病学调查、诊断和监测等，在猪流行性腹泻感染早期发挥巨大作用。
附图说明
图1 是本发明所述3条引物用于猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR 的特异性检测结果，呈现“S”形荧光曲线的样品为猪流行性腹泻病毒；其余呈现平滑曲线的样品是猪传染性胃肠炎病毒（TGVE）、猪轮状病毒（PRoV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）以及阴性对照。
图2 是本发明检测方法的灵敏度实验结果。将阳性质粒10倍梯度稀释，从10-1到10-9，以此为模板用本发明中提供的3条特异性引物进行荧光定量PCR，结果表明即使稀释至2.6*101，仍然可以看到典型的“S”形扩增曲线，表明仍可检出PEDV。
具体实施方式
下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1. 引物设计和合成
本发明所述猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，病毒粒子核酸为线性正股单链RNA，整个基因组长约28.6kb。PEDV粒子有4种结构蛋白，为S蛋白（spike protein）、sM蛋白（small membrane protein）、M蛋白（membrane protein）和N蛋白（nucleoprotein），其中N基因为核蛋白，特性比较保守和稳定，因此本发明利用N基因作为检测PEDV的候选基因，针对PEDV比较保守的N基因区域，采用DNAstar和Primer 5.0软件设计引物，设计了一个TaqMan探针和2条特异性型引物。
经过大量筛选得到如下序列的引物序列：
正向引物PEDV-NF（ NO.1）5’-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT -3’；
反向引物PEDV-NR（NO.2）：5’-TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT -3’；
荧光探针引物序列：PEDV-NP(NO.3) 5’-TGTTGCCATTACCACGACTCCTGC -3’。
这些引物合成后，分别用DEPC水稀释溶解，其中PEDV-NF和PEDV-NR的浓度为20μmol/L，PEDV-NP的浓度为10μmol/L，备用。
2. 本发明还提供了检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，按以下组分组装（20 份/ 盒）：
每份成分的含量为：
阴性对照 1 管
阳性对照 1 管
无菌DEPC 水 1 管
RT 反应液 1 管
PCR 反应液 1 管
检测引物（正向引物、反向引物和荧光引物） 各1 管
使用说明书1 份。
所述阴性对照为：-20℃冰箱保存的灭菌的DEPC 水；
所述阳性对照为：
3. 本发明所述检测PEDV的荧光RT-PCR检测方法，包括以下步骤：
1）样品处理：
按照猪粪便待检测样品与缓冲液重量比为1：5的比例加入PBS缓冲液，5000rpm 4℃离心10min，然后吸出上清液用于提取RNA。
2）提取病毒RNA：RNA的提取根据相关试剂盒的说明书进行，即取粪便悬液250μL于1.5mL的离心管中，加入750μLTRIzol，混匀，室温放置5min；再加入200μL氯仿，振荡混匀，室温放置10min；12000r/min、4℃离心15min，取上清500μL，加等体积-20℃预冷的异丙醇室温静置10min或-20℃静置30min，12000r/min、4℃离心10min；弃上清，加入75%冰冷乙醇（DEPC处理水配制），8000～9000g离心5min；弃上清，倒置风干，用20μLDEPC处理水溶解，-20℃冻存备用。
3）反应体系：按照上述体系进行反应体系的配制，包含以下试剂：
2×1 step Buffer 12.5 μL
20μmol/L PEDV-NF 1 μL
20μmol/L PEDV-NR 1 μL
10μmol/L PEDV-NP 0.5 μL
步骤2）提取的RNA作为模板 3 μL
酶混合物 1 μL （所述酶混合物含200U/μL 反转录酶、5U/μL ExTaq 聚合酶和100U的RNA抑制剂）
DEPC 水 6 μL
4）反应程序：
循环条件设置（初步设置，需要根据实验结果进行调整）
第一阶段，反转录42℃，30min；
第二阶段，预变性94℃，3min；
第三阶段，94℃/15s，45℃/30s，72℃/1min，5个循环；
第四阶段，94℃/15s，60℃/30s，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光；试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。
5）结果判定方法
直接读取检测结果，Ct值小于等于30.0，且出现典型的“S”形状扩增曲线，表示样品中存在猪流行性腹泻病毒，且阴性对照无Ct值，并且无典型的扩增曲线，一直为水平线；阳性对照的Ct值应小于28，并出现典型的扩增曲线。
6）实际应用
利用本发明合成的3条引物，对地方猪场送检的43份粪便病料进行了荧光定量RT-PCR检测，同时与常规RT-PCR方法相比较，结果表明：在43份待检病料中，荧光定量RT-PCR方法检出28份为阳性，常规RT-PCR 方法检出12份为阳性，这表明荧光定量RT-PCR检测的敏感性明显高于常规RT-PCR方法。其中，河北、贵州等多省份送检的病料中均可以检测到PEDV，也进一步说明PEDV的感染面已经非常广泛。
图1 是本发明所述3条引物用于猪流行性腹泻病毒荧光RT-PCR 的特异性检测结果，呈现“S”形荧光曲线的样品为猪流行性腹泻病毒；其余呈现平滑曲线的样品是猪传染性胃肠炎病毒（TGVE）、猪轮状病毒（PRoV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）以及阴性对照。
图2 是本发明检测方法的灵敏度实验结果。将阳性质粒10倍梯度稀释，从10-1到10-9，以此为模板用本发明中提供的3条特异性引物进行荧光定量PCR，结果表明即使稀释至2.6*101，仍然可以看到典型的“S”形扩增曲线，表明仍可检出PEDV。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (6)
1. 用于检测猪流行性腹泻病毒的PCR引物，其特征在于，它包括如下引物SEQ ID No:1- SEQ ID No:3：
正向引物PEDV-NF：5’-CTTCCCAGCGTAGTTGAGATTGT -3’；
反向引物PEDV-NR：5’-TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT -3’；
荧光探针引物PEDV-NP：5’-TGTTGCCATTACCACGACTCCTGC -3’。
2.含有权利要求1所述的PCR引物的用于检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，它包括：
（1）阴性对照： -20℃冰箱保存的灭菌的DEPC 水；
（2）阳性对照2份：1份为用引物PEDV-NF和PEDV-NR扩增得到的PCR产物制备的重组质粒；
（3）总体积为25 μL的检测体系，包含以下试剂：
2×1 step Buffer 12.5 μL
20μmol/L PEDV-NF 1 μL
20μmol/L PEDV-NR 1 μL
10μmol/L PEDV-NP 0.5 μL
RNA模板 3 μL
酶混合物 1 μL DEPC 水 6 μL
混匀后，于-20℃保存。
3.根据权利要求2所述的用于检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于，所述酶混合物含200U/μL 反转录酶和5U/μL ExTaq 聚合酶以及RNA抑制剂100U。
4.利用权利要求2所述的用于检测猪流行性腹泻病毒的试剂盒的荧光PCR检测方法，其特征在于它包括以下步骤：
1）样品处理：
每一份猪粪便待检测样品按照重量比1：5的比例加入PBS缓冲液，离心取上清液用于提取RNA和接种细胞；
2）提取病毒RNA；
3）反应体系：总体积为25μL，包括如下成分：
2×1 step Buffer 12.5 μL
20μmol/L PEDV-NF 1 μL
20μmol/L PEDV-NR 1 μL
10μmol/L PEDV-NP 0.5 μL
RNA模板 3 μL
酶混合物 1 μL
DEPC 水 6 μL
4）反应程序：
第一阶段，反转录42℃，30min；
第二阶段，预变性94℃，3min；
第三阶段，94℃/15s，45℃/30s，72℃/1min，5个循环；
第四阶段，94℃/15s，60℃/30s，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光；试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果；
5）结果判定
直接读取检测结果，Ct值小于等于30.0，且出现典型的“S”形状扩增曲线，表示样品中存在猪流行性腹泻病毒，且阴性对照无Ct值，并且无典型的扩增曲线，一直为水平线；阳性对照的Ct值应小于28，并出现典型的扩增曲线。
5.权利要求2所述的检测试剂盒在制备用于检测猪流行性腹泻病毒的试剂中的应用，其特征在于所述检测引物从感染猪流行性腹泻病毒的检测样品的总RNA 中扩增出122bp DNA片段。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒在制备用于检测猪流行性腹泻病毒的试剂中的应用，其特征在于，所述122bp的序列如SEQ ID No:4所示：
SEQ ID No:4
cttccgagtgtagttgagattgttgaacctaacacacctcctacttcacgttcaaattcacgtagcaggagccgtggcaatggcaacagcaggtccagatccccgagtaacaacagaggcaa。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410755471.3A CN104561371A (zh) | 2014-12-11 | 2014-12-11 | 用于检测猪流行性腹泻病毒的pcr引物、试剂盒及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410755471.3A CN104561371A (zh) | 2014-12-11 | 2014-12-11 | 用于检测猪流行性腹泻病毒的pcr引物、试剂盒及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104561371A true CN104561371A (zh) | 2015-04-29 |
Family
ID=53078445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410755471.3A Pending CN104561371A (zh) | 2014-12-11 | 2014-12-11 | 用于检测猪流行性腹泻病毒的pcr引物、试剂盒及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104561371A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105567874A (zh) * | 2016-02-19 | 2016-05-11 | 北京亿森宝生物科技有限公司 | 猪德尔塔冠状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及非诊断性检测方法 |
| CN106222299A (zh) * | 2016-08-02 | 2016-12-14 | 四川农业大学 | 一种检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量pcr试剂盒及其用途 |
| CN112011536A (zh) * | 2020-09-16 | 2020-12-01 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种用于检测猪流行性腹泻病的nasba-elisa检测引物及探针 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103320452A (zh) * | 2013-07-08 | 2013-09-25 | 江苏省农业科学院 | 一种猪流行性腹泻病毒变异株n基因全序列的扩增方法 |
-
2014
- 2014-12-11 CN CN201410755471.3A patent/CN104561371A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103320452A (zh) * | 2013-07-08 | 2013-09-25 | 江苏省农业科学院 | 一种猪流行性腹泻病毒变异株n基因全序列的扩增方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 李彬等: "猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立与应用", 《江苏农业学报》 * |
| 范京惠等: "猪流行性腹泻病毒的基因结构及其诊断技术", 《世界华人消化杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105567874A (zh) * | 2016-02-19 | 2016-05-11 | 北京亿森宝生物科技有限公司 | 猪德尔塔冠状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及非诊断性检测方法 |
| CN106222299A (zh) * | 2016-08-02 | 2016-12-14 | 四川农业大学 | 一种检测猪流行性腹泻病毒的荧光定量pcr试剂盒及其用途 |
| CN112011536A (zh) * | 2020-09-16 | 2020-12-01 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种用于检测猪流行性腹泻病的nasba-elisa检测引物及探针 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103397107B (zh) | 牛病毒性腹泻病毒荧光定量rt-pcr检测试剂盒 | |
| CN103602757B (zh) | 口蹄疫、水泡性口炎和猪水泡病多重荧光rt-pcr检测方法的建立及其应用 | |
| CN102277454A (zh) | 猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒检测用引物、探针及检测试剂盒 | |
| CN100451129C (zh) | 猪瘟病毒荧光定量rt-pcr诊断试剂盒 | |
| CN103866050B (zh) | 猪流行性腹泻病毒荧光定量pcr检测方法及其引物 | |
| CN104263853A (zh) | 荧光定量pcr检测猪主要病毒的试剂盒 | |
| CN108060269A (zh) | 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用 | |
| CN103031386B (zh) | 一种检测人杯状病毒的三重荧光定量rt-pcr试剂盒 | |
| Paixão et al. | Diagnosis of foot-and mouth disease by real time reverse transcription polymerase chain reaction under field conditions in Brazil | |
| CN106676197A (zh) | 猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒双重荧光RT‑PCR检测方法及其应用 | |
| Guan et al. | Epidemiological investigation of feline infectious peritonitis in cats living in Harbin, Northeast China from 2017 to 2019 using a combination of an EvaGreen-based real-time RT-PCR and serum chemistry assays | |
| CN105112558B (zh) | 口蹄疫病毒O、A和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT‑PCR检测试剂盒 | |
| CN102206713B (zh) | 三重荧光定量rt-pcr检测试剂盒及用途 | |
| CN101660001B (zh) | 一种轮状病毒核酸检测试剂盒 | |
| CN101550452A (zh) | 人博卡病毒实时荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN105907890A (zh) | 一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法 | |
| CN108531651A (zh) | 一种用于检测并鉴别FAdV-4和FAdV-8b的特异性引物及其应用 | |
| CN104561371A (zh) | 用于检测猪流行性腹泻病毒的pcr引物、试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN102071256A (zh) | 猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法 | |
| CN105886663A (zh) | 一种锁核酸增敏的猪伪狂犬病毒野毒株荧光定量pcr的检测试剂盒 | |
| CN105483290A (zh) | 猪德尔塔冠状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测引物及检测方法 | |
| CN101812539A (zh) | 猪瘟病毒TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR鉴别检测试剂盒及其生产方法 | |
| CN105506186A (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒的检测引物和荧光定量rt-pcr检测方法 | |
| CN102367488A (zh) | 肠道病毒三联实时荧光定量rt-pcr检测试剂盒 | |
| CN102154512B (zh) | 兔出血症病毒荧光定量rt-pcr检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150429 |