CN105483290A - 猪德尔塔冠状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测引物及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪德尔塔冠状病毒SYBRGreenI荧光定量RT-PCR检测引物，猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：上游引物：5＇-TTAGTCGGGTCCTTTGCG-3＇，下游引物：5＇-ACTCTCGTTGAAAGTCCG-3＇，扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段260bp。本发明根据GenBank中登录的PDCoV（KJ567050.1）Illinois121株的N基因序列的保守区设计一对特异性引物，经过对反应条件进行优化，建立了检测PDCoV的SYBRGreen

Description

猪德尔塔冠状病毒SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测引物及检测方法

技术领域

本发明涉及一种病毒的检测方法，具体涉及猪德尔塔冠状病毒SYBRGreenI荧光定量RT-PCR引物及检测方法。

背景技术

猪德尔塔冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus，PDCoV)属于冠状病毒科冠状病毒属成员之一。该病毒在临床上主要引起仔猪腹泻、呕吐等肠道症状，和同为冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的临床症状相似，2014年初，美国俄亥俄州首次检测报道一种新的猪肠道冠状病毒PDCoV，截止2014年底美国发现PDCoV感染病例的州达17个。随后在加拿和韩国也报道检测到了PDCoV，其阳性检出率高达25％，而且PDCoV和PEDV共同感染的阳性率也较高。通过序列比较发现，PDCoV和PEDV、TGEV等不属于一个冠状病毒属，反而和δ冠状病毒属中的一些的禽类冠状病毒亲缘关系较近，因此将PDCoV归属于δ冠状病毒属。2012年，Woo等发表的文章中就有PDCoV的报道：他们对广东和香港等地采集的哺乳动物和禽类病料进行δ冠状病毒检测，其中在猪粪便样品(169份)中检测到近10％的PDCoV。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪德尔塔冠状病毒SYBRGreenI荧光定量RT-PCR引物及检测方法。

本发明的技术方案是：猪德尔塔冠状病毒SYBRGreenI荧光定量RT-PCR检测引物，

猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：

上游引物：5＇-TTAGTCGGGTCCTTTGCG-3＇

下游引物：5＇-ACTCTCGTTGAAAGTCCG-3＇

扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段260bp。

利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒SYBRGreenI荧光定量RT-PCR检测方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，所述SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR反应体系，在20μl体系中加入以下成份：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，质粒模板1μL，SYBRPremixExTaqⅠ10μL，ddH₂O8μL；

所述反应条件为：扩增参数为95℃3min；95℃10s、53℃30s、72℃30s，循环35次。

本发明的有益效果是：本发明根据GenBank中登录的PDCoV(KJ567050.1)Illinois121株的N基因序列的保守区设计一对特异性引物，经过对反应条件进行优化，建立了检测PDCoV的SYBRGreenI荧光定量PCR方法。该方法对常见的病毒均检测不到荧光信号，仅对PDCoV检测为阳性，其灵敏度为54拷贝/μL；组内和组间变异系数均小于1％。本试验建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于临床PDCoV的检测。

附图说明

图1为PCR产物琼脂糖凝胶电泳，M:DL2000Maker；1:RT-PCRproductofPDCoVNgene；2:阴性对照；

图2为PDCoV荧光定量PCR扩增标准曲线；

图3为PDCoV荧光定量RT-PCR扩增特异性试验，1.阴性对照；2.TGEV；3.PPV；4.PCV2；5.PEDV；6.PRV；7.PEDV；

图4为荧光定量RT-PCR(A)与常规PCR(B)敏感性试验，1-7:5.4×10⁷～5.4×10¹copies/μL；8:Negativecontrol；9:阴性对照。

具体实施方式

本发明根据GenBank登录的PDCoV的Illinois121株的N基因序列，通过序列分析获得其高度保守的特异性序列，并根据该特异性保守序列设计了一对特异性引物。在此基础上建立了PDCoVSYBRGreenI荧光定量RT-PCR检测方法，并对该方法进行了评价分析，为兽医临床的诊断和防制提供技术支持。

猪德尔塔冠状病毒SYBRGreenI荧光定量RT-PCR检测引物，

猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：

上游引物：5＇-TTAGTCGGGTCCTTTGCG-3＇

下游引物：5＇-ACTCTCGTTGAAAGTCCG-3＇

扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段260bp。

利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒SYBRGreenI荧光定量RT-PCR检测方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，所述SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR反应体系，在20μl体系中加入以下成份：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，质粒模板1μL，SYBRPremixExTaqⅠ10μL，ddH₂O8μL；

所述反应条件为：扩增参数为95℃3min；95℃10s、53℃30s、72℃30s，循环35次。

本发明具体操作如下：

1材料和方法

1.1病毒株及临床样品

猪Deltacoronavirus(PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒II型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪伪狂犬病毒(PRV)均由河南农业大学河南省动物性食品安全重点实验室保存。PDCoV的临床样品来自河南各地市及其周边地市养殖场的10日龄以内腹泻仔猪的肠道内容物。

1.2主要试剂

pMD18-T载体、反转录试剂盒、PCR相关试剂、DNAMarker、DNA凝胶回收试剂盒及SYBRPremixExTaqI聚合酶均购自TaKaRa公司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司。

1.3引物的设计及合成

应用PrimerPremier5.0基因分析软件，参照Genbank中登录的Illinois121株PDCoVN基因序列设计一对引物，扩增PDCoVN基因部分片段260bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

上游引物：5＇-TTAGTCGGGTCCTTTGCG-3＇

下游引物：5＇-ACTCTCGTTGAAAGTCCG-3＇

1.4重组质粒标准品的制备

按照TRIzol总RNA提取试剂盒说明书方法提取RNA，参照Thermo反转录试剂盒说明书进行反转录，将反转录所得cDNA进行常规PCR扩增，PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒回收目的产物，将回收的目的片段与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞，用质粒提取试剂盒提取质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将测序正确的阳性质粒作为DNA标准品，用分光光度仪测定浓度后进行10倍系列稀释，用于构建标准曲线。并根据标准质粒的浓度进行分析，根据公式计算出每微升质粒液体中含有的质粒拷贝数。

1.5荧光定量PCR方法的优化

采用SYBRPremixExTaq推荐的反应体系，以出现最高荧光值、出现最小的样本阈值循环数(Cq值)以及在融解曲线分析中不出现非特异性峰为指标，对退火温度、循环条件和循环次数等进行优化。

1.6标准曲线的绘制

将计算出拷贝数的质粒做10倍梯度稀释，在稀释好的标准质粒中选取7个适宜的稀释度，以这7个稀释度的质粒液体作为标准阳性模板进行RT-PCR扩增反应，每个稀释度做3个重复试验。对扩增结果进行分析，绘制标准曲线。

1.7特异性试验

用建立好的扩增方法对TGEV、PPV、PCV2、PEDV、PRV等病毒株基因为模板进行扩增，并选取PDCoV阳性质粒作阳性对照，灭菌水作阴性对照，检验所建立方法的特异性。

1.8敏感性试验

分别以5.4×10⁷拷贝/μL～5.4×10¹拷贝/μL质粒标准品为模板，以进行荧光定量RT-PCR扩增。确定能得出阳性结果的最低稀释度的拷贝数，同时用常规PCR进行检测，比较两种方法的敏感性，同时设阴性对照。

1.9重复性试验

采用构建好的阳性质粒模板，选取7个稀释度，分别作为模板在同等条件下进行扩增，每个稀释度做3个平行试验，计算Cq值的变异系数；同时，将上述所用样品保存，每周检查1次，连续检测2周，计算不同批次间Cq值的变异系数。

1.10临床样品检测

对来自河南省及其周边地区的57份腹泻仔猪的小肠内容物，按照实验室常规方法处理后分别用建立的荧光定量RT-PCR方法和常规PCR方法进行检测，比较两种方法的阳性检出率和符合率，并用统计学方法进行结果分析。

2结果

2.1阳性标准品的制备

利用设计的PDCoVN基因引物进行常规PCR扩增，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示：从肠道内容物中扩增出约260bp大小的预期片段(图1)。回收PCR产物与pMD18-T连接，转化感受态细胞，提取重组质粒进行PCR扩增，结果扩增出目的片段。对重组质粒进行序列测定，BLAST比对结果显示其与参考序列的同源性为100％，表明构建了PDCoVN基因片段的重组质粒。经核酸蛋白分析仪测定，阳性质粒的OD_260nm/OD_280nm＝1.95，计算出质粒浓度为176.1ng/μL，即5.4×10¹⁰拷贝/μL。

2.2RT-PCR标准曲线的建立及反应条件的优化

通过反应条件的优化，在20μL反应体系中，各组分含量为：上下游引物各0.5μL，质粒模板1μL，SYBRPremixExTaqⅠ10μL，ddH₂O8μL，扩增参数为95℃3min；95℃10s、53℃30s、72℃30s，循环35次。PDCoV荧光定量PCR扩增标准曲线如图2，溶解温度平均值为86.043℃，标准差为0.137，变异系数为0.160；统计分析结果显示，各个溶解温度之间变异极小，引物特异性强，扩增效率最高。

经测定计算得出重组质粒拷贝数为5.4×10¹⁰拷贝/μL。经10倍系列稀释后，选取浓度为5.4×10⁷拷贝/μL至5.4×10¹拷贝/μL的质粒作为标准品按照优化好的条件进行荧光定量PCR扩增，得到的标准曲线(图2)，纵坐标为Cq值，横坐标为拷贝数的对数；建立函数关系，得到二者的线性关系，斜率为-2.9514，截距为32.67，相关系数R²为0.99。结果显示良好的线性关系。

2.3特异性试验

建立的RT-PCR分别对TGEV，PPV，PCV2，PRV，PEDV等阳性模板进行检测。扩增结果显示，只有PDCoV扩增为阳性，其他常见毒株与阴性对照扩增结果相似，均无特异性扩增(图3)。由图可知，只有猪PDCoV的模板在优化条件下可以扩增出特异性曲线，其它病毒无扩增曲线，试验表明该方法具有较强的特异性。

2.4敏感性试验

以10倍倍比稀释的质粒标准品(5.4×10⁷拷贝/μL～5.4×10¹拷贝/μL)作为模板，进行RT-PCR和常规PCR扩增。扩增结果显示RT-PCR的最低检测量为5.4×10¹拷贝/μL，常规PCR的最低检测量为5.4×10²拷贝/μL(图4)。检测结果表明，RT-PCR的敏感性是常规PCR的10倍。

2.5重复性试验

为了验证RT-PCR检测结果的可重复性，选取模板浓度分别为5.4×10⁷拷贝/μL～5.4×10¹拷贝/μL的重组质粒为样本，用建立好的RT-PCR扩增方法分别重复扩增3次，结果表明各试验组组内组间变异系数均小于1％(表1)，表明该RT-PCR检测方法具有较高的可重复性。

表1SYBRGreenⅠRT-PCR的组内和组间重复性试验结果

2.6临床样品检测结果

对57份腹泻样品进行检测，RT-PCR法和常规PCR法检测双阳性病料样品5份，双阴性病料样品45份，荧光定量法检测出单阳性病料样品7份。二者的符合率为87.72％，RT-PCR方法的阳性检出率比普通方法高12.28％。用统计学的方法进行分析，采取样品与总体百分数t检验，得到2种方法的p<0.01，差异极显著，表明所建立的荧光定量检测方法敏感性显著高于普通方法。

3讨论

PDCoV是有囊膜的单股正链RNA，属冠状病毒科冠状病毒属。据报道，它的美国株基因序列有25422个核酸，且和香港株基因序列相似。美国株和香港株的序列同源性也高达98％-99％。它的主要结构蛋白包括：纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和小膜蛋白(E)。这和冠状病毒PEDV一样。

N蛋白为冠状病毒的主要结构蛋白之一，由377个至455个氨基酸组成，以具有高等电点、高丝氨酸含量为特征，是一种多功能的磷酸化蛋白，与病毒基因组RNA相互缠绕形成核衣壳，有6～7个潜在的磷酸化位点，3个相对保守的结构域，位于中间的一个结构域能够与病毒的RNA前导序列结合，在病毒RNA合成过程中发挥着重要的作用。在感染病毒细胞中，N蛋白是表达量最高的病毒蛋白之一。

本发明成功构建了PDCoVN基因片段的标准质粒，基于SYBRGreenI建立了定量检测PDCoV的RT-PCR方法。研究数据显示，所建立的RT-PCR方法的熔解曲线产物峰单一整齐，无引物二聚体峰，熔解温度为86.043℃，与其他猪源病毒无交叉反应；质粒浓度在5.4×10¹～5.4×10⁷拷贝/μL范围内的标准曲线的决定系数为0.99，显示出优良的线性关系；组间与组内试验的变异系数均小于1％。表明我们建立的方法具有很好的特异性、重复性及灵敏性。用建立的RT-PCR对57份腹泻仔猪临床病料进行了检测，结果有12份呈阳性，而常规PCR只检出5份为阳性。而常规PCR检测结果为阳性时，RT-PCR检测结果均为阳性，由此表明，RT-PCR比常规PCR检测不仅灵敏度高，而且可以进行定量分析。RT-PCR方法对临床样品中PDCoV的检出率显著高于常规PCR，且符合率为87.72％。

综合分析表明，本发明具有良好的特异性、敏感性及可重复性，不但可以应用与PDCoV的流行性病学调查，也为PDCoV的定量检测及其早期感染的快速诊断奠定了重要基础。

Claims (2)

1.猪德尔塔冠状病毒SYBRGreenI荧光定量RT-PCR检测引物，其特征在于：

猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：

上游引物：5＇-TTAGTCGGGTCCTTTGCG-3＇

下游引物：5＇-ACTCTCGTTGAAAGTCCG-3＇

扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段260bp。

2.利用权利要求1所述引物检测猪德尔塔冠状病毒SYBRGreenI荧光定量RT-PCR检测方法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR反应体系和反应条件对病毒进行检测，其特征在于：

所述SYBRGreenⅠ荧光定量RT-PCR反应体系，在20μl体系中加入以下成份：上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，质粒模板1μL，SYBRPremixExTaqⅠ10μL，ddH₂O8μL；

所述反应条件为：扩增参数为95℃3min；95℃10s、53℃30s、72℃30s，循环35次。