CN104388594A - 一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒 - Google Patents
一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种用于检测猪伪狂犬病毒的TaqmanReal-timePCR试剂盒，包含扩增预混液、阴性对照、阳性对照以及序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的扩增引物及SEQIDNO:3的探针引物的混合物。本发明利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，计算待检样品拷贝数，结果更为准确直观，省时省力，成本较低，时间由原来的3～4小时缩短到1～2小时；并且比普通PCR的灵敏度高，可用于检测低微含量的猪伪狂犬病毒样品；适用于科研单位定量分析；而且适合于各级防控单位，基层兽医站，大中型养殖场等的病原检测分析，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及猪伪狂犬病毒防治技术领域，具体说是一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR（探针法实时-定量聚合酶链反应）试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。
背景技术
伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）是一种可感染多种家畜和野生动物的疱疹病毒，猪是该病毒贮存宿主和传染源，该病毒可引起母猪繁殖障碍及初生仔猪大批死亡；成年猪则出现隐性感染，长期带毒排毒，严重影响种猪场生产及优良品种的推广，给养猪业造成极大的损失。国内对猪伪狂犬病的诊断方法主要包括病毒分离鉴定和血清学诊断方法等，病毒分离鉴定由于费时费力而不适于临床检测；由于病毒感染特异性抗体出现较晚，血清学方法也难以用于早期诊断。常规的PCR不仅无法对病料样本中的病毒进行定量检测，而且扩增反应后需要电泳检测，一方面耗时较长，不但不适于大批量样本的快速检测，而且容易因操作污染导致假阳性结果；另一方面因核酸电泳时溴化乙锭染色剂的使用对工作人员及环境造成一定的危害。与病毒分离、免疫荧光等传统方法相比，实时定量PCR方法更加省时，且操作简单，还可以利用标准曲线计算待检样品拷贝数。另外，核酸探针具有特定的序列，只能与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段进行结合，也就只能用于样品中特定基因片段的检测，因此更加特异。该技术具有敏感性高，特异性强，用时短等优点，而且可以通过荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，结果更为准确直观，已成为病原体检测的重要方法。
本发明通过反复试验以及引物浓度和探针浓度的优化，制作标准曲线的相关系数R2大于0.98；斜率位于-3～-3.5之间；PCR扩增效率E位于0.9～1.2之间，符合线性关系、扩增效率要求。其快速、灵敏、特异、定性、定量、低污染率等特点均优于普通PCR方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感和准确及定量的检测需求，从而提供一种能够快速、敏感、准确以及定量地检测病毒的一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法。
为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：
一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，所述试剂盒包含扩增预混液、阴性对照、阳性对照、序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。
所述扩增引物序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2为：
SEQ ID NO:1：上游引物CCCTGGGCGCCTCCTTCGTCA，
SEQ ID NO:2：下游引物TGTTGTAGCGCCGCCGGTAGATGG。
所述探针引物序列为：
SEQ ID NO:3：CGACGTCACGCAGCTCGACCTGCAGCG。
所述扩增引物扩增出的条带序列为：
SEQ ID NO:4（123 bp）：
ccctgggcgcctccttcgtcagcgacgtcacgcagctcgacctgcagcgcgtgcacctgggcgactgcgtcctccgcgaggcctcggaggccatcgacgccatctaccggcggcgctacaaca。
所述阴性对照为无DNA/RNA酶水。
所述阳性对照为含有猪伪狂犬病毒基因序列的阳性质粒pGM-123以及制作的标准曲线；其构建方式如下：
a. PRV基因组DNA的提取按QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit（凯杰公司脱氧核糖核酸提取试剂盒）说明书进行操作。以提取PRV灭活疫苗基因组DNA为模板；以SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2作为引物扩增，反应条件为94℃预变性2min；94℃变性50s, 60℃退火50s, 72℃延伸50s, 共30个循环；72℃再延伸10min, 4℃ 5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
b. PCR产物的克隆及序列分析：
PCR产物用AXYGEN（爱思进）公司的胶回收试剂盒回收，与pGMD-T-Easy克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12～16h。经蓝白斑筛选后，用AXYGEN质粒提取试剂盒提取质粒，将序列测定为阳性的质粒命名pGM-123。
其标准曲线制作如下：
对pGM-123阳性质粒进行10倍倍比稀释，使其为：10-1～10-15，每个梯度重复三次进行定量PCR。
根据扩增情况从中选取5～6个点制作适合标准曲线要求的标准曲线。如图1所示。
本发明还提供了所述用于检测PRV的Taqman Real-time PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
a. 使用权利要求1所述的检测试剂盒进行PCR扩增，条件如下：94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度60℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。
b. 结果分析
根据扩增结果判定：在NTC（阴性对照）没有Ct（循环数）值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
本发明应用分子生物学技术研制和开发出了特异性高、敏感性强、能准确定量和计算待检样品拷贝数及价格便宜的PRV Taqman Real-time PCR试剂盒,一方面可以弥补我国对于PRV检测的薄弱环节，同时有利于剔除阴性带毒动物。
本发明在使用过程中无需电泳技术检测，使得检测时间由原来的3～4小时缩短到现在的1～2小时，并且避免了接触溴化乙锭的危险，有利于检测人员的健康。同时本发明使用了探针法，只有当探针引物特异的结合到扩增的靶序列并能被Taq酶降解时才会检测到荧光信号，而且闭管操作的实时检测可以有效防止反应产物的污染，使该方法与普通PCR方法相比具有更高的准确性，有助于PRV的防控和隐性带毒动物的剔除，避免造成大范围的传染。本发明适用于待测猪的脑、脾脏、淋巴结、全血、肉品及血清等样品，所述方法适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的其中一个实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 为本发明制作标准曲线；
图2为本发明样本检测图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的其中一个实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、引物的设计和制备：
参照GenBank（基因库）查找十株毒株，经序列比对寻找每个序列上均保守的区域，选取保守区域并设计一对扩增引物，一条探针引物，序列如下：
扩增引物序列为：
SEQ ID NO:1：上游引物CCCTGGGCGCCTCCTTCGTCA，
SEQ ID NO:2：下游引物TGTTGTAGCGCCGCCGGTAGATGG。
探针引物序列为：
SEQ ID NO:3：CGACGTCACGCAGCTCGACCTGCAGCG。
上述引物由大连宝生物工程有限公司合成并进行标记。
阳性对照：本发明试剂盒的阳性对照及其标准曲线是由中国农业科学院兰州兽医研究所构建并保存。
2、制备试剂盒：
本试剂盒由以下组分组成：
a. 2×扩增预混液：12.5μL；
b. 引物浓度均为10pmol/μl的三条引物混合液3μl，123bp上游引物1μl，123bp下游引物1μl，探针引物1μl ；
c. 无DNA/RNA酶水6.5μL；
d. 阳性对照pGM-123阳性质粒3μl；
e. 阴性对照无DNA/RNA酶水3μl；
3、用本发明试剂盒检测PRV的使用方法：
（1）PCR总体系为25μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×扩增预混液12.5μL；b. 三条引物共3μl；c. 无DNA/RNA酶水6.5μl加入到0.2 ml扩增管中；
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3μl、从待检猪脑中提取的DNA模板3μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5～30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增： 94℃预变性2min； 94℃ 20s，退火温度60℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
4、结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
实施例2
步骤1～2 同实施例1；
3、用本发明试剂盒检测PRV的使用方法：
（1）PCR总体系为25μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×扩增预混液12.5μL；b. 三条引物共3μl；c. 无DNA/RNA酶水6.5μl加入到0.2 ml扩增管中；
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3μl、从待检猪脾脏中提取的DNA模板3μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5～30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：94℃预变性2min； 94℃ 20s，退火温度60℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
4、结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
实施例3
步骤1～2 同实施例1；
3、用本发明试剂盒检测PRV的使用方法：
（1）PCR总体系为25μl。分别将本发明试剂盒中a.2×扩增预混液12.5μL；b.三条引物共3μl；c.无DNA/RNA酶水6.5μl加入到0.2 ml扩增管中；
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3μl、从待检猪淋巴结中提取的DNA模板3μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5～30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度60℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环；直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果；
4、结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测；再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性；
实施例4
步骤1～2 同实施例1；
3、用本发明试剂盒检测PRV的使用方法：
（1）PCR总体系为25μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×扩增预混液12.5μL；b. 三条引物共3μl；c. 无DNA/RNA酶水6.5μl加入到0.2 ml扩增管中；
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3μl、从待检猪血液中提取的DNA/RNA模板3μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5～30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增: 94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度60℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环；直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果；
4、结果分析：
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
Organization Applicant
----------------------
Street : 兰州市城关区盐场堡徐家坪1号
City : 兰州
State : 甘肃
Country : 中国
PostalCode : 730046
PhoneNumber : 0931-8343385
FaxNumber : 0931-8340977
EmailAddress : hnxiangtaohotmail.com；jingningcaixiong163.com
<110> OrganizationName : 中国农业科学院兰州兽医研究所
Application Project
-------------------
<120> Title : 一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒
<130> AppFileReference : Detection of porcine parvovirus using a taqman-based real-time pcr with primers and probe designed for the NS1 gene
<140> CurrentAppNumber :
<141> CurrentFilingDate : ____-__-__
Sequence
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<213> OrganismName : Sus scrofa
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ccctgggcgc ctccttcgtc a 21
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<211> Length : 21
SequenceName : SEQ ID NO.1
SequenceDescription :
Sequence
--------
<213> OrganismName : Sus scrofa
<400> PreSequenceString :
tgttgtagcg ccgccggtag atgg 24
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<211> Length : 24
SequenceName : SEQ ID NO.2
SequenceDescription :
Sequence
--------
<213> OrganismName : Sus scrofa
<400> PreSequenceString :
cgacgtcacg cagctcgacc tgcagcg 27
<212> Type : DNA
<211> Length : 27
SequenceName : SEQ ID NO.3
SequenceDescription :
Sequence
--------
<213> OrganismName : Sus scrofa
<400> PreSequenceString :
ccctgggcgc ctccttcgtc agcgacgtca cgcagctcga cctgcagcgc gtgcacctgg 60
gcgactgcgt cctccgcgag gcctcggagg ccatcgacgc catctaccgg cggcgctaca 120
aca 123
<212> Type : DNA
<211> Length : 123
SequenceName : SEQ ID NO.4
SequenceDescription :
Claims (8)
1.一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，包含扩增预混液、阴性对照，其特征在于：还包含阳性对照、序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，其特征在于所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2为：
SEQ ID NO.1：上游引物CCCTGGGCGCCTCCTTCGTCA，
SEQ ID NO.2：下游引物TGTTGTAGCGCCGCCGGTAGATGG。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，其特征在于所述探针引物序列为：
SEQ ID NO.3：CGACGTCACGCAGCTCGACCTGCAGCG。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，其特征在于所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物浓度均为10pmol/μL，扩增引物及探针引物配比为1:1:1。
5.根据权利要求1或2所述的一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，其特征在于所述扩增引物扩增出的条带序列为：
序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的由5’端向3’端延长的序列；
SEQ ID NO.4（123 bp）：
ccctgggcgcctccttcgtcagcgacgtcacgcagctcgacctgcagcgcgtgcacctgggcgactgcgtcctccgcgaggcctcggaggccatcgacgccatctaccggcggcgctacaaca。
6.根据权利要求1所述的一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，其特征在于所述阳性对照为构建的pGM-123阳性质粒以及利用其制作的标准曲线，该质粒是扩增引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所扩增的猪伪狂犬病毒基因序列，长度123bp，克隆至pGEM-T Easy克隆载体，筛选为阳性的命名为pGM-123，即阳性对照，利用阳性对照制作标准曲线。
7.根据权利要求1所述的一种用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒组分的配比为：
a. 2×扩增预混液：25份；
b. 引物浓度均为10pmol/μl的三条引物混合液6份，123bp上游引物2份，123bp下游引物2份，探针引物2份；
c. 无DNA/RNA酶水13份；
d. 阳性对照pGM-123阳性质粒6份；
e. 阴性对照无DNA/RNA酶水6份。
8.一种如权利要求1所述用于检测猪伪狂犬病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
a．使用权利要求1所述的检测试剂盒进行PCR扩增，条件如下：94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度60℃ 30s，72℃ 20s，40个循环；
b. 结果分析；
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35～40为可疑，需重复检测；再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
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