CN103436633A - 一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒 - Google Patents
一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
一种用于检测猪瘟病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR试剂盒，包含OneStepRT-PCRbufferIII、ExTaqHS、PrimerScriptRTEnzymeMixII、阴性对照、阳性对照、以及序列SEQIDNO:1至SEQIDNO:2的扩增引物及SEQIDNO:3的探针引物的混合物。本发明将反转录和PCR扩增过程在一步反应中完成，使得检测时间缩短，有利于快速检测。本发明还使用了探针法，只有当探针引物特异的结合到扩增靶序列上时才会产生有效的结果，而且闭管操作的实时检测可以有效防止反应产物的污染，与普通PCR方法相比具有更高的准确性，有助于CSFV的防控和隐性带毒动物的剔除。
Description
技术领域
本发明涉及猪瘟病毒防治技术领域，具体说是一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR（探针法实时定量反转录-聚合酶链反应）试剂盒，本发明还包括该试剂盒的使用方法。
背景技术
古典猪瘟（Classical swine fever, CSF）简称猪瘟，是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起猪的急性、烈性、接触性传染病，我国是猪瘟严重的流行国家之一，每年因猪瘟造成的直接经济损失有数十亿元，严重威胁我国养猪业及其国际贸易的发展。以前采取接种猪瘟兔化弱毒疫苗的方法来预防和控制猪瘟的流行，成功的控制了猪瘟的大爆发。然而，猪瘟的流行特点却从大流行转变为地方性流行和散发，并且不分季节的随时发生。临床特点也从典型猪瘟转变为非典型性猪瘟，诊断和预防难度越来越大，因此猪瘟仍是威胁养猪户的头号传染病。目前，国外和国内均已建立了RT-PCR（反转录-聚合酶链反应）检测方法。国外应用PCR诊断CSFV已取得很大进展，许多学者根据CSFV序列，设计了不同引物，建立了检测CSFV核酸的普通RT-PCR方法、套式RT-PCR方法及复合式RT-PCR方法等。该方法直接从猪的脾脏、全血、淋巴结及肉品等中扩增出预期的片断，但是上述方法耗时长，扩增结束后还需要进行电泳才能观察结果，检测一份样品需耗时7小时左右。同时CSFV是一种高度传染性的病毒，其RNA（核糖核酸）特别容易发生变异，现有的检测方法不具有快速，敏感和准确的特点，需要研制并开发出快速，敏感、准确以及价格便宜的CSFV检测试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感和准确的检测需求，从而提供一种能够快速、敏感、准确地检测病毒的一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法。
为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：
一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，所述试剂盒包含PrimerScript RT Enzyme Mix II（反转录酶混合液）、One Step RT-PCR bufferIII（一步反转录-聚合酶链反应缓冲液）、Ex Taq HS（具有校正功能耐热脱氧核糖核酸聚合酶）、阴性对照、阳性对照、序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。
所述扩增引物序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2为：
SEQ ID NO:1：上游引物CTGGCCAAGAGGGGTGAGC，
SEQ ID NO:2：下游引物ACAGGCCGTCTTGGGTATTC。
所述探针引物序列为：
SEQ ID NO:3：AGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACCG。
所述扩增引物扩增出的条带序列为：
SEQ ID NO:4（274 bp）：
ctggccaagaggggtgagccaagaaccctgaagtggattagaaatttcaccgactgtccattgtgggttaccagttgctccgatgatggcgcgagtgggagtaaagagaagaagccagataggatcaacagaggcaaattaaaaatagccccaaaagagcatgagaaggacagcagaactaggccacctgacgctacgatcgtggtggaaggagtaaaataccaggtcaaaaagaaaggtaaagttaaaggaaagaatacccaagacggcctgt。
所述阴性对照为无RNA酶水。
所述阳性对照为含有CSFV基因序列的阳性质粒pMD-274；其构建方式如下：
a. CSFV基因组RNA的提取按QIAGEN RNeasy Mini Kit（凯杰公司核糖核酸提取试剂盒）说明书进行操作。以提取的病毒RNA为模版进行反转录合成cDNA（互补脱氧核糖核酸）。以SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2作为引物扩增，反应条件为94℃预变性3min；94℃变性50s, 57℃退火50s, 72℃延伸50s, 共30个循环；72℃再延伸10min, 4℃5min。PCR产物于10g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。
b. PCR产物的克隆及序列分析
PCR产物用TaKaRa（宝生物）公司的胶回收试剂盒回收，与pMD18-T克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞JM109，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基平板上，37℃培养12～16h。经蓝白斑筛选后，用质粒提取试剂盒提取质粒，将序列测定为阳性的质粒命名pMD-274。
本发明还提供了所述用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
a. 使用权利要求1所述的检测试剂盒进行RT-PCR扩增，条件如下：42℃反转录5min；94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度57℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。
b. 结果分析
根据扩增结果判定：在NTC（阴性对照）没有Ct（循环数）值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
本发明应用分子生物学技术研制和开发出了特异性、敏感性和准确性高及价格便宜的CSFV Taqman Real-time RT-PCR试剂盒一方面可以弥补我国对于CSFV检测的薄弱环节，同时有利于剔除阴性带毒动物。本发明在使用过程中将反转录和PCR扩增过程在一步反应中完成，使得检测时间由原来的4-5小时缩短到现在的1-2小时，从而有利于快速检测。同时本发明使用了探针法，只有当探针引物特异的结合到扩增的靶序列上时才会产生有效的结果，而且闭管操作的实时检测可以有效防止反应产物的污染，使该方法与普通PCR方法相比具有更高的准确性，有助于CSFV的防控和隐性带毒动物的剔除，避免造成大范围的传染。本发明适用于待测猪的脾脏、全血、淋巴结、肉品及血清等样品，所述方法适用于任何实验室和基层各级防控单位、兽医站及大中小型养殖场等。
附图说明
图1为本发明样本检测图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步详细叙述
实施例1
1、引物的设计和制备
参照GenBank（基因库）查找十株毒株，经序列比对寻找每个序列上均保守的区域，选取保守区域并设计一对扩增引物，一条探针引物，序列如下：
扩增引物序列为：
SEQ ID NO:1：上游引物CTGGCCAAGAGGGGTGAGC，
SEQ ID NO:2：下游引物ACAGGCCGTCTTGGGTATTC。
探针引物序列为：
SEQ ID NO:3：AGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACCG。
上述引物由大连宝生物工程有限公司合成并进行标记。
阳性对照：本发明试剂盒的阳性对照是由中国农业科学院兰州兽医研究所构建并保存。
2、制备试剂盒
本试剂盒由以下组分组成：
a. 2×One Step RT-PCR bufferIII：12.5μL
b. Ex Taq HS：0.5μL
c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 0.5μL
d.引物浓度均为10pmol/μl的三条引物混合液3μl，274bp上游引物1μl，274bp下游引物1μl，探针引物1μl。
e. 无RNA酶水6.5μL
f. 阳性对照pMD-274阳性质粒3μl
g. 阴性对照无RNA酶水3μl
3、用本发明试剂盒检测猪瘟病毒的使用方法
（1）PCR总体系为25 μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×One Step RT-PCR bufferIII：12.5μL；b. Ex Taq HS：0.5μL；c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 0.5μL；d. 三条引物共3 μl；f. 无RNA酶水6.5μl，加入到0.2 ml扩增管中;
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3 μl、从待检猪脾脏中提取的RNA模板3 μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：42℃反转录5min；94℃预变性2min； 94℃ 20s，退火温度57℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
4、结果分析
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
实施例2
步骤1-2 同实施例1
3、用本发明试剂盒检测猪瘟病毒的使用方法
（1）PCR总体系为25 μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×One Step RT-PCR bufferIII：12.5μL；b. Ex Taq HS：0.5μL；c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 0.5μL；d.三条引物共3 μl；f.无RNA酶水6.5μl，加入到0.2 ml扩增管中;
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3 μl、从待检猪全血中提取的RNA模板3 μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：42℃反转录5min；94℃预变性2min； 94℃ 20s，退火温度57℃ 20 s，72℃ 20 s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
4、结果分析
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
实施例3
步骤1-2 同实施例1
3、用本发明试剂盒检测猪瘟病毒的使用方法
（1）PCR总体系为25 μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×One Step RT-PCR bufferIII：12.5μL；b. Ex Taq HS：0.5μL；c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 0.5μL；d.三条引物共3 μl；f.无RNA酶水6.5μl，加入到0.2 ml扩增管中;
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3 μl、从待检猪淋巴结中提取的RNA模板3 μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：42℃反转录5min；94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度57℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
4、结果分析
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
实施例4
步骤1-2 同实施例1
3、用本发明试剂盒检测猪瘟病毒的使用方法
（1）PCR总体系为25 μl。分别将本发明试剂盒中a. 2×One Step RT-PCR bufferIII：12.5μL；b. Ex Taq HS：0.5μL；c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 0.5μL；d.三条引物共3 μl；f.无RNA酶水6.5μl，加入到0.2 ml扩增管中;
（2）分别向上述扩增管中加入阳性对照3 μl、从待检猪肉品中提取的RNA模板3 μl、阴性对照3μl，12000rpm离心5-30秒，将扩增管放入扩增仪中，在以下设定程序下扩增：42℃反转录5min；94℃预变性2min；94℃ 20s，退火温度57℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环。直接在实时定量扩增仪上观察扩增结果。
4、结果分析
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测。再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
序列表
Organization Applicant
----------------------
Street : 兰州市城关区盐场堡徐家坪1号
City : 兰州
State : 甘肃
Country : 中国
PostalCode : 730046
PhoneNumber : 0931-8343385
FaxNumber : 0931-8340977
EmailAddress : hnxiangtaohotmail.com；jingningcaixiong163.com
<110> OrganizationName : 中国农业科学院兰州兽医研究所
Application Project
-------------------
<120> Title : 一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒
<130> AppFileReference : Development of a triplex TaqMan real-time RT-PCR assay for differential detection of wild-type and HCLV vaccine strains of classical swine fever virus and bovine viral diarrhea virus 1
<140> CurrentAppNumber :
<141> CurrentFilingDate : ____-__-__
Sequence
--------
<213> OrganismName : Sus scrofa
<400> PreSequenceString :
ctggccaaga ggggtgagc 19
<212> Type : DNA
<211> Length : 19
SequenceName : SEQ ID NO.1
SequenceDescription :
Sequence
--------
<213> OrganismName : Sus scrofa
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acaggccgtc ttgggtattc 20
<212> Type : DNA
<211> Length : 20
SequenceName : SEQ ID NO.2
SequenceDescription :
Sequence
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<213> OrganismName : Sus scrofa
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agaaccctga agtggattag aaatttcacc g 31
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<211> Length : 31
SequenceName : SEQ ID NO.3
SequenceDescription :
Sequence
--------
<213> OrganismName : Sus scrofa
<400> PreSequenceString :
ctggccaaga ggggtgagcc aagaaccctg aagtggatta gaaatttcac cgactgtcca 60
ttgtgggtta ccagttgctc cgatgatggc gcgagtggga gtaaagagaa gaagccagat 120
aggatcaaca gaggcaaatt aaaaatagcc ccaaaagagc atgagaagga cagcagaact 180
aggccacctg acgctacgat cgtggtggaa ggagtaaaat accaggtcaa aaagaaaggt 240
aaagttaaag gaaagaatac ccaagacggc ctgt 274
<212> Type : DNA
<211> Length : 274
SequenceName : SEQ ID NO.4
SequenceDescription :
Organization Applicant
----------------------
Street : 兰州市城关区盐场堡徐家坪1号
City : 兰州
State : 甘肃
Country : 中国
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PhoneNumber : 0931-8343385
FaxNumber : 0931-8340977
EmailAddress : hnxiangtaohotmail.com；jingningcaixiong163.com
<110> OrganizationName : 中国农业科学院兰州兽医研究所
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-------------------
<120> Title : 一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time Rt-PCR试剂盒
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aggatcaaca gaggcaaatt aaaaatagcc ccaaaagagc atgagaagga cagcagaact 180
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<211> Length : 274
SequenceName : SEQ ID NO.4
SequenceDescription :
Claims (9)
1.一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，包含One Step RT-PCR bufferIII、Ex Taq HS、PrimerScript RT Enzyme Mix II、阴性对照，其特征在于：还包含有阳性对照、序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的Taqman
Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2为：
SEQ ID NO:1：上游引物CTGGCCAAGAGGGGTGAGC，
SEQ ID NO:2：下游引物ACAGGCCGTCTTGGGTATTC。
3.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的Taqman
Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述探针引物序列为：
SEQ ID NO:3：AGAACCCTGAAGTGGATTAGAAATTTCACCG。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物浓度均为10pmol/μL，扩增引物及探针引物配比为1:1:1。
5.根据权利要求1或2所述的一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述扩增引物扩增出的条带序列为：
序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的由5’端向3’端延长的序列；
SEQ ID NO:4（274 bp）：
ctggccaagaggggtgagccaagaaccctgaagtggattagaaatttcaccgactgtccattgtgggttaccagttgctccgatgatggcgcgagtgggagtaaagagaagaagccagataggatcaacagaggcaaattaaaaatagccccaaaagagcatgagaaggacagcagaactaggccacctgacgctacgatcgtggtggaaggagtaaaataccaggtcaaaaagaaaggtaaagttaaaggaaagaatacccaagacggcctgt。
6.根据权利要求1或3所述的一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述探针引物的5’端标记物为FAM报告荧光基团、3’端标记物为TAMRA淬灭荧光基团。
7.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述阳性对照为构建的pMD-274阳性质粒，该质粒是扩增引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所扩增的猪瘟病毒基因序列，长度274bp，克隆至pMD-18T克隆载体，命名为pMD-274。
8.根据权利要求1所述的一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒组分的配比为：
a. 2×One Step RT-PCR bufferIII：25份；
b. Ex Taq HS：1份；
c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 1份；
d.引物浓度均为10pmol/μl的三条引物混合液6份，274bp上游引物2份，274bp下游引物2份，探针引物2份；
e. 无RNA酶水13份；
f. 阳性对照pMD-274阳性质粒6份；
g. 阴性对照无RNA酶水6份。
9.一种如权利要求1所述用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
a．使用权利要求1所述的检测试剂盒进行RT-PCR扩增，条件如下：42℃反转录5min；94℃预变性2min； 94℃ 20s，退火温度57℃ 30 s，72℃ 20 s，40个循环；
b. 结果分析；
根据扩增结果判定：在NTC没有Ct值的情况下，Ct值<35判为阳性；Ct值介于35-40为可疑，需重复检测；再次测定时该样品Ct值<35为阳性，Ct值≥35为阴性。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013102699497A CN103436633A (zh) | 2013-06-29 | 2013-06-29 | 一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2013102699497A CN103436633A (zh) | 2013-06-29 | 2013-06-29 | 一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103436633A true CN103436633A (zh) | 2013-12-11 |
Family
ID=49690346
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2013102699497A Pending CN103436633A (zh) | 2013-06-29 | 2013-06-29 | 一种用于检测猪瘟病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103436633A (zh) |
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- 2013-06-29 CN CN2013102699497A patent/CN103436633A/zh active Pending
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |