CN107435080A - 一种检测猪瘟病毒的重组酶常温扩增核酸（rt‑rpa）试纸条试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种检测猪瘟病毒的重组酶常温扩增核酸(RT‑RPA)试纸条试剂盒及应用。该试剂盒包含核苷酸序列如权利要求1所示的引物组和核酸检测试纸条。该试剂盒的使用方法如下：首先配置RT‑RPA反应体系，进行常温恒温反应；恒温反应所得产物用核酸检测试纸条检测后直接进行判读：阳性结果为出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内；阴性结果仅在质控区一条红色条带，在检测区内无红色条带出现。本发明系首次采用RPA‑核酸试纸条技术建立快速检测猪CSFV的方法，具有操作简单，特异性高，且反应结果易于观察，安全无污染等特点，非常适用于临床现场检测。

Description

一种检测猪瘟病毒的重组酶常温扩增核酸(RT-RPA)试纸条试 剂盒及应用

技术领域

本发明涉及一种检测猪瘟病毒的试剂盒及其用途，特别涉及一种基于RPA 反应的用于快速检测猪瘟病毒的试纸条RPA试剂盒，还涉及在快速检测猪瘟病 毒中的用途，本发明属于预防兽医学检验领域。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是危害养殖业发展的一种猪的重大 烈性传染病，主要由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)感染引 起发病，以出血、高热、免疫抑制和淋巴细胞减少为主要特征,是世界卫生组织 (OIE)所列的疫病目录必须通报的传染病之一。猪感染CSFV后，根据其毒株毒 力的不同以及被感染的猪年龄、品种的不同，疾病可以表现为温和或是严重等 多种形式，其主要引起大量的白细胞减少和免疫抑制，造成广泛的出血点和上 皮损伤，表现为器官严重的淤血、出血。猪瘟病毒还可造成垂直感染的发生， 妊娠母猪感染后会出现“带毒母猪综合征”，发生流产、弱胎、死胎、木乃伊胎，新生仔猪死亡等，其次耐过的猪会终身带毒。

猪瘟的历史悠久，1833年首先出现于美国的俄亥俄洲，之后传播到世界各 大洲。目前仍广泛分布于欧洲、亚洲、南美洲的大部分养猪国家。该病一年四 季都可发生且发病的时间多于春夏多雨季节。虽然我国所研制出兔化弱毒疫苗， 能有效控制猪瘟在我国大规模的爆发流行，但近50年来，我国的大部分地区 猪瘟仍广泛存在，呈现散发流行，发病年龄偏小，发病表现温和，垂直传播严 重，持续感染与隐性感染共存，免疫耐受以及混合感染严重病情复杂等发病特 点，严重损害我国养猪业的发展，对畜产品造成巨大的损失。

目前用于猪瘟病毒的检测方法主要包括病原的分离鉴定，血清学方法、分 子生物学方法。病原学方法是最传统的检测方法，其特异性强，结果真实可靠， 但是实际操作时费时费力且敏感性低，因此在临床应用过程中有一定的局限性。 ELISA、中和试验、血凝抑制试验等血清学方法特异性差无法确诊，而RT-PCR、 荧光定量PCR等分子生物学方法需要昂贵的仪器设备且需要专业技术人员进行 操作，难以满足非实验室等基层现场环境下的检测要求。

重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplication)是在 重组酶聚合酶的介导下模拟生物体内DNA复制的过程，被称为可以替代PCR的 核酸检测技术。其扩增原理是，重组酶与引物结合形成复合物后，寻找匹配的 DNA同源序列，紧密结合发生重组，在单链DNA结合蛋白的作用下，模板DNA 开始解链，引物与模板DNA配对，在bsu DNA聚合酶的作用下复制延伸，对目 的片段进行指数级扩增(Forget et al.,2012)。RPA与PCR不同，整个过程仅需 要在37-42℃等温条件下反应15-20分钟即可得到扩增产物，不需要高温变性和 退火的过程，整个反应简单、快速、高效。对于RPA与侧向流动免疫层析技术 相结合(Recombinase Ploymerase Amplication-lateral flow dipstick,RPA-LFD),可以在水浴锅或者直接用人体温进行加热，将温度控制在 37-42℃之间，随后可直接通过侧向流动层析试纸条读取实验结果。在整个反应 体系中，需要生物素标记的反向引物和羧基荧光素(FAM)标记的特异探针，该探 针在距羧基荧光集团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer),该位点可被大 肠杆菌核酸外切酶nof进行识别并切割，产生自由的羟基末端，然后便在DNA 聚合酶的作用下延伸，形成具有生物素和羧基荧光集团双标记的RPA产物。将其滴加于试纸条上便会与胶体金标记的抗FAM的抗体结合，形成三元复合物， 通过层析膜扩散，被生物素配体捕获，形成具有颜色的检测线。此方法直观高 效，3-5分钟内就可通过肉眼判读。

本发明针对猪瘟病毒的NS5B基因，建立并评估了基于RT-RPA核酸试纸条 检测试剂盒。与常规PCR引物不同，RPA所需的引物长度为30-35bp，探针序列 的长度为46-52bp,引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长 度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的 结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件， 也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。

发明内容

针对RT-RPA-测流层析技术应用于CSFV检测领域的空白，本发明提供了一 种RT-RPA-LFD检测猪瘟病毒的引物、探针以及试剂盒，该试剂盒具有高灵敏度、 高特异性、可视化、操作方法简单等优点。

本发明的目的在于提供实现上述检测猪瘟病毒的RT-RPA核酸试纸条试剂盒 的应用。

本发明的目的是通过下述技术方案实现：一种检测猪瘟病毒的RT-RPA核酸 试纸条试剂盒，包含如下引物组、探针和核酸检测试纸条：

所述的引物组的核苷酸序列如下所示：

上游引物：5’-CCGACGGGGAAGTATACATAAGGAAAGGGC-3’；

下游引物：5’-Biotin-CCTTGCTCGCGAATTTCTCACCGAGAGCTC-3’；

探针：5’-(Fitc(FAM))CAAAGAGGCAGCGGACAACCTGACACAAGC

-(dSpace)-CAGGCAATAGCATGC-C3spacer-3’；

所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条；

所述的检测猪瘟病毒的RT-RPA核酸试纸条试剂盒优选包含上述引物组、探 针、TwistAmpTM nfo kit和全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置；

所述的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为杭州优思达生物技术有限公 司产品；该检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内 得到；

所述的TwistAmpTM nfo kit即重组酶聚合酶等温扩增技术，购自英国 TwistDX公司；试剂盒包括重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液Rehydration Buffer、280mM醋酸镁溶液。

所述的检测猪瘟病毒的RT-RPA核酸试纸条试剂盒的应用，包含以下步骤：

(1)配置RT-RPA反应体系，在RPA冻干颗粒中加入29.5μL Rehydra-tion Buffer，2.1μL 10μM Primer A，2.1μL 10μM Primer B，0.6μL 10μM探针，9.2μL 双蒸水，4μL病毒DNA模板，在反应管盖上加280mM醋酸镁溶液2.5μL，上下颠 倒反应管使之充分混匀后离心；恒温反应；

(2)反应：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测,2-5min观察 结果；

(3)结果判读：直接肉眼判读

①阴性：仅在质控区一条红色条带，在检测区内无红色条带出现，证明所 检测的样本没有猪瘟病毒感染；

②阳性：出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内， 证明所检测的样本为猪瘟病毒感染；

③无效：质控区和检测区内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

使用本发明所述的RT-RPA核酸试纸条试剂盒检测猪瘟病毒，优选的反应体 系如下：29.5μL水解缓冲液，3.75μL200nM上游引物，3.75μL 200nM下游引物， 1μL 250nM探针，9.2μL双蒸水，4μL病毒DNA模板，以及2.5μL的280mM醋酸 镁溶液。

扩增反应在温度设定为37-42℃的水浴锅中进行，反应时间15-30min，结 束后通过侧向流动层析试纸条对结果进行检测。

更优选的，扩增反应在温度设定为37℃的水浴锅中进行，反应时间为20min, 结束后通过侧向流动层析试纸条对结果进行检测。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益结果：

(1)本发明系首次采用RT-RPA核酸检测试纸条建立快速检测CSFV的方法， 并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为CSFV的现场检测提供了 一种灵敏、可靠的新方法。本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设 计多对引物进行优化、筛选才能得到。

(2)采用本发明的引物和探针组合，通过RPA技术对猪瘟病毒进行检测的方 法具有较高的灵敏度、特异性和重复性。

本发明选用的猪瘟病毒NS5B基因引物是经过大量试验筛选获得的，特异性 好，与猪的其他病毒包括猪细小病毒、猪2型圆环病毒、猪流行性乙型脑炎、 猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒无交叉反应。RPA 能够将痕量的核酸模板扩增到可以检测的水平；本发明所建立的检测方法可检 测到的102.5TCID50/mL CSFV病毒。

(3)本发明的RPA技术并结合核酸试纸条技术检测猪瘟病毒的方法，既具 有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简 便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和现场的猪瘟病毒的检测。

(4)检测速度快：与常规PCR相比，不用经过变性、退火、延伸三个步骤， RPA最适温度在37-42℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。

(5)不需要复杂的仪器设备，适用于现场检测，本发明所建立检测方法可以 在常温等温条件下扩增、试纸条可视化检测，不需要PCR仪、荧光定量PCR仪、 电泳仪、电泳槽等复杂的仪器设备，且RPA不需要复杂的样品处理，可以真正 实现便携式的现场快速核酸检测。

附图说明

图1为CSFV RT-RPA凝胶检测体系的建立及引物筛选结果图，其中：

A为筛选上游引物电泳亮度关系图，以R1为下游引物，上游引物为F1-F4， 泳道1～4依次对应上游引物F1、F2、F3、F4，得出F2为最佳上游。

B为筛选下游引物电泳亮度关系图，以F2为上游引物，下游引物为R1-R4， 泳道1～4依次对应下游引物R1、R2、R3、R4，得出R1为最佳下游。

图2为CSFV RT-RPA-LFD检测方法的建立以及反应检测条件优化结果图， 其中：

A为CSFV RT-RPA-LFD检测方法建立结果图，分别表示为1:ddH2O(空白 对照)；2:阴性细胞液(控制对照)；3:阴性血液(控制对照)；4:阴性扁桃 体(控制对照)；5:CSFV(阳性对照)。

B为CSFV RT-RPA-LFD检测条件温度优化结果图，分别表示为1:15℃； 2:20℃；3:25℃；4:30℃；5:35℃；6:37℃；7:40℃；8:45℃；9:50℃。

C为CSFV RT-RPA-LFD检测条件时间优化结果图，分别表示为1:1min； 2:5min；3:10min；4:20min；5:25min；6:30min；7:ddH2O(空白对照)。

D为CSFV RT-RPA-LFD检测条件引物及探针浓度优化结果图，分别表示为 1:引物浓度420nM，探针浓度150nM；2:引物浓度150nM，探针浓度50nM；3: 引物浓度120nM，探针浓度40nM；4:引物浓度90nM，探针浓度60nM；5:引物 浓度60nM，探针浓度20nM；6:引物浓度30nM，探针浓度10nM；7:引物浓度15nM， 探针浓度5nM；8:引物浓度3nM，探针浓度1nM。

图3为检测本发明试剂盒特异性的结果图，其中：

第一个检测装置是以ddH2O为模板的RT-RPA反应产物；第二个检测装置是 以CSFV(猪瘟病毒)石门株基因组为模板的RT-RPA反应产物；第三个检测装置 是以PEDV(猪流行性腹泻病毒)基因组为模板的RT-RPA反应产物；第四个检测装 置是以PPV(猪细小病毒)为模板的RT-RPA反应产物；第五个检测装置是以 PRV(伪狂犬病毒)为模板的RT-RPA反应产物；第六个检测装置是以PRRSV(猪繁 殖与呼吸综合征)为模板的RT-RPA反应产物；第七个检测装置是以PCV-II(猪圆 环病毒-Ⅱ型)为模板的RT-RPA反应产物；第八个检测装置是以JEV(日本乙型脑 炎病毒)为模板的RT-RPA反应产物；

图4为CSFV RT-RPA-LFD和CSFV RT-PCR的敏感性检测结果图，其中：

A为CSFV RT-RPA-LFD和CSFV RT-PCR电泳凝胶检测体系cDNA含量敏感 性结果图，图中均为：1的模板是ddH2O(空白对照)；2的模板是含量1ug的 CSFV cDNA；3的模板是含量为100ng的CSFV cDNA；4的模板是含量为10ng的 CSFV cDNA；5的模板是含量为1ng的CSFVcDNA；6的模板为含量为100pg的 CSFV cDNA；7的模板是含量为10pg的CSFV cDNA；8的模板是含量为1pg的CSFV cDNA；9的模板是含量为100fg的CSFV cDNA；10的模板是含量为10fg的CSFV cDNA。

B为CSFV RT-RPA-LFD和CSFV RT-PCR电泳凝胶检测体系毒株梯度稀释敏 感性结果图，图中均为：1的模板是ddH2O(空白对照)；2的模板是毒株浓度为 105.5TCID50/ml；3的模板是毒株浓度为104.5TCID50/ml；4的模板是毒株浓度 为103.5TCID50/ml；5的模板是毒株浓度为102.5TCID50/ml；6的模板是毒株 浓度为101.5TCID50/ml；7的模板是毒株浓度为100.5TCID50/ml。

C为CSFV RT-RPA-LFD和CSFV RT-PCR电泳凝胶检测体系扁桃体模型临床 模拟梯度稀释敏感性结果图，将TCID50/ml是105.5的CSFV/shimen株作为初 始毒株，用扁桃体稀释液对初始毒株进行10倍梯度进行稀释(100～10-5)，图 中均为：1的模板是阴性扁桃体研磨液(空白对照)；2的模板是稀释梯度100 即TCID50/ml为105.5；3的模板是稀释梯度10-1即TCID50/ml为104.5；4的 模板是稀释梯度10-2即TCID50/ml为103.5；5的模板是稀释梯度10-3即 TCID50/ml为102.5；6的模板是稀释梯度10-4即TCID50/ml为101.5；7的模 板是稀释梯度10-5即TCID50/ml为100.5。

D(1)为构建标准质粒胶回收产物电泳图；

(2)为CSFV RT-RPA-LFD和CSFV RT-PCR电泳凝胶检测体系重组质粒标准 品梯度稀释敏感性结果图，图中均为：1的模板是ddH2O(空白对照)；2的模板 是1010拷贝/μL；3的模板是109拷贝/μL；4的模板是108拷贝/μL；5的模 板是107拷贝/μL；6的模板是106拷贝/μL；7的模板是105拷贝/μL；8的模 板是104拷贝/μL；9的模板是103拷贝/μL；10的模板是102拷贝/μL；11的 模板是101拷贝/μL；12的模板是100拷贝/μL。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅 是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对发明技术方案的细节和形式进行修改或 者替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

TwistAmp nof Kits购自TwistDX公司；引物由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成；提取病毒DNA/RNA试剂盒购自OMEGA Bio-Tek公司；M-MLV反 转录酶，RNA酶抑制剂、2×Taq PCR Mix DNA聚合酶、随机引物、dNTP(2.5mM)、 琼脂糖购自Takara公司；全封闭式靶核酸扩增产物快速检测装置购自杭州优思 达生物技术有限公司(货号：20150703-31)。

实施例1快速检测猪瘟病毒的RT-RPA核酸试纸条试剂盒及检测方法的建立。

一、引物及探针序列的设计及制备

本发明发明人通过对来自于Genbank中的AY259122.1、NC_002657.1、AY382481.1、HQ380231.1、KP233071.1、KM3622426.1、AY775178.2、KT119352.1、 X87939.1、AF326963.1、KT716271.1、EU915211.1的NS5B基因同源序列进行比 对分析，确定了猪瘟病毒NS5B基因的保守区域，根据RPA引物设计原则，针对 该区域设计了引物和探针，以期能够检测到尽可能多的猪瘟病毒。RPA对引物长 度的要求是30-35bp，扩增产物在500bp之内，扩增效率较高。要建立一种快速、 敏感的检测方法，需要进行多次引物的筛选，引物个别碱基差异会对扩增效果 产生影响，所以，在保守基因区域，设计一系列梯度候选物，再根据RT-RPA凝 胶检测的结果，从中选择最佳引物。应用引物设计软件Prime Premier 5.0进 行RPA引物设计，同时应用生物软件Oligo7.0对引物进行筛选，以确保各引物 对之间产生的二聚体较少为原则。所有的引物和探针都由生工生物(上海，中 国)合成。本发明分别设计合成了四条上游引物和四条下游引物、一条探针， 如下表所示：

二、猪瘟病毒RT-RPA反应

1、病毒RNA的抽提：

取本实验室保藏CSFV石门株(Xiao-Ying Dong,Wen-Jun Liu,Ming-Qiu Zhao,Jia-Ying Wang,Jing-Jing Pei,Yong-Wen Luo,Chun-Mei Ju and Jin-DingChen.Classical swine fever virus triggers RIG-I and MDA5-dependent signalingpathway to IRF-3 and NF-KB activation to promote secretion of interferon andinfla-mmatory cytokines in porcine alveolar macrophages.Virology Journal,2013,10:286),使用OMEGA Viral RNA extraction Kit Ver.5.0抽提RNA，所用离心管等耗材均经0.1﹪DEPC处理， 确保无RNA酶污染，按照以下步骤进行抽提：

(1)配置QVL Buffer：每管(即每个样品)含有560μL QVLBuffer，添加 5.6μLCarrier RNA，10μLβ-巯基乙醇，现配现用；

(2)添加140μL样品，充分混匀30S；

(3)室温孵育5-10min；

(4)添加560μL无水乙醇，充分混匀30S；

(5)加650μL混合物至HiBind RNA,操作要仔细而迅速，10000g,30S弃滤 液；

(6)重复步骤(5)至所有的液体全部经过滤柱；

(7)换新的2mL收集管，加500μLRWA，10000g离心30S后，弃滤液；

(8)换新的2mL收集管，加500μLRWB,，10000g离心30S后，弃滤液；

(9)空管10000g离心3min后，弃滤液；

(10)换新的1.5mLEP管加30-50μLDEPC水，静置3-5min，10000g离心1min。

2、cDNA合成

以提取的RNA为模板，用MLV酶进行反转录反应，反应体系如下：

(1)配置RNA反转录反应预体系，将提取的RNA吸取5.75μL于新的1.5mLEP 管中，再加入1μL随机引物，70℃水浴10min后立即冰浴2min。

(2)配置RNA反转录反应体系，RNA引物混合液6.75μL，5×Buffer 2μL， dNTP MIX0.5μL，RNase inhibitor 0.25μL，M-MLV 0.5μL，充分混匀，然后30℃ 水浴10min，42℃水浴1h。

3、CSFV RT-RPA凝胶检测体系的建立及引物筛选：

我们以提取纯化的病毒DNA为模板进行扩增，并对设计引物进行筛选，筛 选出最优引物。实验步骤如：

①以R1为下游引物，筛选上游引物F1-F4。

(1)配置RT-RPA初始反应体系：29.5μL水解缓冲液(rehydration buffer,TwistAMP nof Kit)，9.2μL的ddH2O,2.4μL上游引物(10μM)，2.4μL 下游引物(10μM)，4μL的病毒DNA模板；

(2)RT-RPA凝胶检测反应步骤：将上述47.5μL缓冲液转移到含有冻干酶 粉的0.2mL的TwistAMP nof Kit反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解；

(3)加入2.5μL的280mM的醋酸镁溶液，混匀后反应即刻发生；

(4)将反应管放入37℃的金属恒温箱中，处理5min；

(5)反应5min后，取出反应管，再次混匀后继续放入37℃的金属恒温箱 中反应20min；

(6)反应结束后，用2％的琼脂糖电泳鉴定,得出F2为最佳上游。试验结 果如图1A所示；

②以F2为上游引物，筛选下游引物R1-R4，得出R1为最佳下游，试验结果 如图1B所示，结果确定CSFV RT-RPA凝胶反应体系最优引物。

4、CSFV RT-RPA试纸条检测体系的建立

①探针设计，探针5’端标记FAM基团，中间THF替代G或C(dSpacer)， 且dSpacer两侧尽量避免G、C，dSpacer与5’端至少30碱基，与3’端至少 15碱基，3’端C3-spacer修饰。

②在筛选出的最佳引物中，将探针相对应的引物的5’标记生物素(Biotin)。 RT-RPA-LFD反应体系引物与探针序列如下所示：

上游引物：5’-CCGACGGGGAAGTATACATAAGGAAAGGGC-3’；

下游引物：5’-Biotin-CCTTGCTCGCGAATTTCTCACCGAGAGCTC-3’；

探针：5’-(Fitc(FAM))CAAAGAGGCAGCGGACAACCTGACACAAGC

-(dSpace)-CAGGCAATAGCATGC-C3spacer-3’；

③具体实现步骤如下所示：

(1)以病毒cDNA为模板作为阳性对照，以ddH2O为阴性对照，以阴性细 胞液、阴性血液、阴性扁桃体为控制对照，；分别加入下列组分：29.5μL水解缓 冲液(rehydrationbuffer,TwistAMP nof Kit)，9.2μL的ddH2O，2.1μL上游 引物(10μM)，2.1μL下游引物(10μM)，0.6μL探针(10μM)，4μL模板；

(2)RT-RPA凝胶检测反应步骤：将上述47.5μL缓冲液转移到含有冻干酶 粉的0.2mL的TwistAMP nof Kit反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解；

(3)加入2.5μL的280mM的醋酸镁溶液，混匀后反应即刻发生；

(4)将反应管放入37℃的金属恒温箱中，处理5min；

(5)反应5min后，取出反应管，再次混匀后继续放入37℃的金属恒温箱 中反应20min；

(6)反应结束后，用核酸试纸条密闭反应装置进行检测，通过试纸条的显 色进行判读。试验结果如图2A所示。

5、CSFV RT-RPA-LFD检测条件的优化

①首先，我们确定RT-RPA-LFD方法的最佳反应温度，我们分别试验了15℃、 20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃不同反应温度，并且将孵 育时间设定为30min。试验结果如图2B所示，反应温度低于30℃时，在试纸条 上没有出现试纸条带，在30时出现较弱的试验条带，在35℃-45℃之间试验条 带没有可观察的差异，当温度大于50℃时没有出现试验条带，结果表明该试验 的最佳反应温度为35℃-45℃，我们选择37℃作为该方法的反应温度。

②其次，我们确定在37℃条件下，不同的孵育时间对于扩增结果的影响， 我们试验了0min、1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min的实验 结果，试验结果如图2C所示，在扩增10min的时候，试纸条上出现了微弱的条 带，当反应时间在15-30min之间时试纸条带上没有出现可观测的差异，我们选 择20min作为该实验的孵育时间。

③最后，我们在37℃恒温扩增20min的条件下，确定RT-RPA-LFD反应的最 佳引物和探针浓度。我们分别试验了引物在反应体系中的终浓度为420nM、150nM、 120nM、90nM、60nM、30nM、15nM、3nM，探针在反应体系中的终浓度为 120nM、50nM、40nM、30nM、20nM、10nM、5nM、1nM。试验结果如图2D 所示，当引物浓度低于15nM，探针浓度低于5nM时，试纸条上检测线上没有 出现试纸条带，在引物浓度为15nM，探针浓度为5nM时，检测线上出现了试 纸条带，在引物浓度引物浓度高于15nM，探针浓度高于5nM时，检测线上试 纸条带没有可观察的差异。结果表明该试验的引物最佳反应浓度为15nM-420nM， 探针最佳反应浓度为5nM-120nM。

检测结果的判定：样品在特定的条件下(37℃，20min)试纸条上质控线且 检测线都出现条带的为阳性样品；仅在质控线上出现条带的为阴性样品。

6、检测体系特异性、敏感性分析

使用猪瘟病毒(CSFV)石门株(Xiao-Ying Dong,Wen-Jun Liu,Ming-Qiu Zhao,Jia-Ying Wang,Jing-Jing Pei,Yong-Wen Luo,Chun-Mei Ju and Jin-DingChen.Classical swine fever virus triggers RIG-I and MDA5-dependent signalingpathway to IRF-3 and NF-KB activation to promote secretion of interferon andinfla-mmatory cytokines in porcine alveolar macrophages.Virology Journal,2013,10:286)、猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)GD08-2株(猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株ORF5和Nsp2基因的序列 分析.华南农业大学学报，2010,31(2)：108-112)、流行性乙型脑炎病毒 (JEV/sw/GD/2009株)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)株、猪细小病毒(PPV)株、 伪狂犬病毒(PRV)Ea株由华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学教研室保存， 伪狂犬病毒(PRV)(伪狂犬病毒活疫苗，上海海利生物科技有限公司)、猪圆环 病毒2型油乳剂灭活疫苗(猪圆环病毒2型(PCV-2)LG株购自哈尔滨维科生物 科技有限公司产品)。反应体系如具体步骤所示，反应条件为确定的优化条件， 使用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置以及浓度为质量体积比2％的琼脂糖 凝胶电泳对产物进行检测。使用全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置检测 (20min后看结果)，得到的结果为：以CSFV石门株基因组为模板的RT-RPA，出现两条红色条带，一条位于检测区(T)内，另一条位于质控区(C)内；以 PRRSV基因组、JEV基因组、PCV-2基因组、PRV基因组、PPV基因组、PEDV基 因组分别为模板的RT-RPA反应产物，仅在质控区(C)出现了一条红色条带， 在检测区(T)内无红色条带出现。实验结果如图3所示。结果显示检测体系特 异性良好，可特异的检测到猪瘟病毒，且用核酸检测试纸条检测，操作更方便、 省时。

CSFV RT-RPA-LFD方法的敏感性分析：

①CSFV RT-RPA-LFD方法的cDNA敏感性分析，抽提CSFV/shimen株的RNA 模板并反转录成cDNA，制备出CSFV的cDNA标准品(1μg/μL)作为初始模板， 将初始模板进行10倍梯度稀释(10-1～10-9)，反应产物分别用常规RT-PCR凝 胶电泳、RT-RPA-LFD方法进行检测。试验结果如图4A显示，常规RT-RCR琼脂 糖凝胶电泳法可以检测到的cDNA最低检测限为10pg,RT-RPA-LFD检测方法最 低检测限为1pg，结果表明RT-RPA-LFD具有高敏感性。

②CSFV RT-RPA-LFD方法的毒株浓度敏感性分析，将TCID50是105.5/mL 的CSFV/shimen株作为初始毒株浓度，将初始毒株浓度进行10倍梯度稀释 (100～10-5)，每个浓度分别进行RNA模板并反转录成cDNA，再用常规RT-PCR 凝胶电泳、RT-RPA-LFD方法进行检测。试验结果如图4B所示，常规RT-RCR琼 脂糖凝胶电泳法可以检测到的CSFV TCID50/mL最低检测限达102.5,RT-RPA-LFD 检测方法最低检测限也为102.5，两者敏感性一致。

③猪扁桃体模型CSFV RT-RPA-LFD方法的临床模拟试验敏感性分析，将 TCID50/mL是105.5的CSFV/shimen株作为初始毒株，用猪扁桃体稀释液对初 始毒株进行10倍梯度稀释(100～10-5)，制成不同浓度的临床CSFV猪扁桃体模 型，每个模型分别进行RNA模板并反转录成cDNA，再用常规RT-PCR凝胶电泳、 RT-RPA-LFD方法进行检测。试验结果如图4C所示，常规RT-RCR琼脂糖凝胶电 泳法可以检测到的CSFV TCID50/mL最低检测限达102.5,RT-RPA-LFD检测方法 最低检测限也为102.5，两者敏感性一致。

④根据CSFV NS5B基因保守区域，设计构建重组质粒标准品的上下游引 物，通过病毒RNA抽提，反转录，PCR反应，PCR产物胶回收，连接，转化 等步骤将目的片段克隆到pMD18-T载体形成重组质粒，按照OMEGA质粒抽提 试剂盒提取重组质粒。通过紫外分光光度计测定浓度计算出拷贝数，分别稀释 出浓度梯度为10¹⁰-10⁰拷贝/反应的共计11个梯度作为模板。扩增反应在温度 设定为37℃的水浴锅中进行，时间设定为20min，通过核酸检测试纸条检测扩 增结果。从该结果可以看出，该方法的敏感性为10³拷贝/反应。并且具有较广的检测范围，至少在10¹⁰-10³拷贝/反应范围内的样品均能被检测出来。

Claims (7)

1.一种用于快速检测猪瘟病毒的RT-RPA核酸试纸条试剂盒，其特征在于包含如下引物组和核酸检测试纸条：

所述的引物组的核苷酸序列如下所示：

上游引物：5’-CCGACGGGGAAGTATACATAAGGAAAGGGC-3’

下游引物：5’-Biotin-CCTTGCTCGCGAATTTCTCACCGAGAGCTC-3’

探针：5’-(Fitc(FAM))CAAAGAGGCAGCGGACAACCTGACACAAGC-(dSpace)-CAGGCAATAGCATGC-C3spacer-3’。

2.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒的RT-RPA核酸试纸条试剂盒，其特征在于：所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。

3.根据权利要求2所述的检测猪瘟病毒的RT-RPA核酸试纸条试剂盒，其特征在于：还包含全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置；全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为将通用型核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。

4.根据权利要求1所述的检测猪瘟病毒的RT-RPA核酸试纸条试剂盒，其特征在于：还包含TwistAmpTM nfo kit包括重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液Rehydration Buffer、280mM醋酸镁溶液。

5.根据权利要求1～4任一项所述的检测猪瘟病毒的RT-RPA核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于包含以下步骤：

(1)在RPA冻干颗粒中加入29.5μL Rehydration Buffer,2.1μL 10μM Primer A,2.1μL10μM Primer B,0.6μL 10μM探针,9.2μL双蒸水,4μL模板,在反应管盖上加280mM醋酸镁2.5μL，上下颠倒反应管使之充分混匀后离心；恒温反应；

(2)反应：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，2～5min观察结果；

(3)结果判读：直接肉眼判读

①阴性：仅在质控区一条红色条带，在检测区内无红色条带出现，证明所检测的样本没有猪瘟病毒感染；

②阳性：出现两条红色条带，一条位于检测区内，另一条位于质控区内，证明所检测的样本为猪瘟病毒感染；

③无效：质控区和检测区内均无红色条带出现，表明核酸试纸条失效。

6.根据权利要求5所述的检测猪瘟病毒的RT-RPA核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于：

步骤(1)中所述的上游引物的终浓度为420nM；

步骤(1)中所述的下游引物的终浓度为420nM；

步骤(1)中所述的探针的终浓度为120nM；

步骤(2)中所述的恒温反应在金属浴中进行，温度设定为37-42℃，时间为15min-30min，结束后使用侧流层析试纸条对结果进行检测。

7.根据权利要求5所述的检测猪瘟病毒的RT-RPA核酸试纸条试剂盒的应用，其特征在于：

步骤(2)中所述的恒温反应的条件为37℃反应20min。