CN110241265A - 猪德尔塔冠状病毒lfd-rpa快速检测引物探针组及试剂盒 - Google Patents

猪德尔塔冠状病毒lfd-rpa快速检测引物探针组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及猪德尔塔冠状病毒LFD‑RPA快速检测引物探针组及试剂盒，属于生物技术领域。本发明提供的引物探针组，包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物为在SEQ ID NO.2所示核苷酸序列5’端修饰生物素的物质，所述探针为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的3’端修饰C3Spacer，5’端修饰荧光素、5’端起第30位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。本发明所述引物探针组能够快速检测猪德尔塔冠状病毒，简单、灵敏性高、和特异性强，能够提高当前控制PDCoV方案的有效性。

Description

猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测引物探针组及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测引物探针组及试剂盒。
背景技术
猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)是一种新出现的冠状病毒，于2012年在中国香港首次被发现。此后，在世界各地相继报道出现PDCoV，其感染可引起猪腹泻、呕吐、脱水、体重下降等临床症状，严重者可导致新生仔猪死亡。当前，PDCoV常常与其它病毒性腹泻致病菌混合感染，临床症状也非常的相似，从而给PDCoV的诊断增加了难度，目前对于PDCOV的检测，并没有一个简单、可靠的诊断用试剂盒，这对养猪业而言是一个严峻的挑战。
发明内容
本发明的目的在于猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测引物探针组及试剂盒。本发明所述引物探针组能够快速检测猪德尔塔冠状病毒，简单、灵敏性高、和特异性强，能够提高当前控制PDCoV方案的有效性。
本发明提供了猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测引物探针组，所述引物探针组包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物为在SEQ ID NO.2所示核苷酸序列5’端修饰生物素的物质，所述探针为在SEQ IDNO.3所示核苷酸序列的3’端修饰C3Spacer，5’端修饰荧光素、5’端起第30位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。
优选的是，所述荧光素包括FAM或FITC。
本发明还提供了猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物探针组。
优选的是，所述试剂盒还包括再水化缓冲液和水。
优选的是，所述试剂盒的反应温度为15～37℃。
优选的是，所述试剂盒的反应时间为10min。
本发明提供了猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测引物探针组。本发明所述引物探针组能够快速检测猪德尔塔冠状病毒，简单、灵敏性高、和特异性强，能够提高当前控制PDCoV方案的有效性。试验结果表明，利用本发明引物探针组进行LFD-RPA检测，不同浓度标准质粒DNA均能出现明显的控制线和检测线，重复性良好；最低能够检测到1×102copies/μL标准质粒，灵敏性是RT-PCR的10倍；只有检测PDCoV时同时出现明显控制线和检测线条带，而其它相关病毒均只出现控制线条带，特异性高；LFD-RPA检测临床腹泻样品中PDCoV阳性率为35％(7/20)，其阳性率与传统的RT-PCR检测相同。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的不同LFD-RPA反应温度检测结果；
图2为本发明实施例1提供的不同LFD-RPA反应时间检测结果；
图3为本发明实施例1提供的LFD-RPA重复性分析结果；
图4为本发明实施例1提供的LFD-RPA灵敏性分析结果；
图5为本发明实施例1提供的LFD-RPA特异性分析结果；
图6为本发明实施例1提供的LFD-RPA和RT-PCR临床样品检测结果。
具体实施方式
本发明提供了猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测引物探针组，所述引物探针组包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物为在SEQ ID NO.2所示核苷酸序列5’端修饰生物素的物质，所述探针为在SEQ IDNO.3所示核苷酸序列的3’端修饰C3Spacer，5’端修饰荧光素、5’端起第30位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。本发明所述引物探针组是针对保守性高的N基因设计的。
在本发明中，所述引物探针组的具体序列优选如表1所示，其中，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列为针对RT-PCR设计的对应的引物。
表1猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测引物及探针序列
在本发明中，所述荧光素包括FAM或FITC。
本发明还提供了猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物探针组。在本发明中，所述试剂盒还包括再水化缓冲液和水。本发明对所述再水化缓冲液的来源没有任何限定，本发明所述试剂盒的反应体系优选参照TwistAmp nfo Kit试剂盒。在本发明中，所述试剂盒优选还包括重组质粒标准品pUC-20T-N，本发明所述重组质粒优选为将N基因连接到pUC-20T载体上构建得到。本发明所述引物探针组在试剂盒的使用过程中不需要设备，检测时间短，操作简便，结果直观，肉眼就可以观察，反应在常温下就可以进行。
在本发明中，所述试剂盒的反应温度为15～37℃，更优选为25℃或30℃。
在本发明中，所述试剂盒的反应时间为10min。
下面结合具体实施例对本发明所述的猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测引物探针组及试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
病料、载体、细胞和临床样品
PDCoV、PEDV、TGEV、PKoV、FMDV和PRRSV为中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫防控技术创新团队实验室提供并保存；pUC-20T载体购自宝生物工程(大连)有限公司的产品；大肠杆菌感受态细胞DH-5α购自北京全式金生物有限公司的产品。2016-2017年，20份临床腹泻样品(含10份粪便拭子和10份肠道样品)采自于中国6个省份(甘肃、湖南、河南、海南、陕西、新疆)，并保存于-80℃中。应用real-time PCR和PCR方法对病毒进行相应的阳性对照检测。
病毒RNA提取及cDNA的合成
临床腹泻样品用含1％青霉素-链霉素(10000IU/mL青霉素，10000μg/mL链霉素，Gibco，美国)的MEM培养(Invitrogen，美国)进行10倍稀释，4℃3500rmp/min离心30min。吸取350μL上清按照RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit(Qiagen，德国)说明书提取病毒RNA。进而将提取的RNA按照AMV逆转录酶试剂盒(Promega，美国)说明书进行cDNA的合成，并于-20℃保存备用。
重组质粒标准品pUC-20T-N构建
将保守性高的N基因其作为LFD-RPA检测的靶基因。通过PCR技术扩增PDCoVN基因，扩增体积为50μL，反应体系为GXL聚合酶(Takara，大连)2μL，5×GXL缓冲液10μL，dNTP 4μL，引物N-F/R 2μL(表1)，3μL DNA模板和27μL ddH2O。PCR反应程序为：98℃3min；98℃10s，60℃15s，68℃20s，35个循环；68℃3min。将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶电泳中进行分析，同时应用DNA纯化回收试剂(Invitrogen，美国)说明书进行纯化后连接到pUC-20T上，并转化到大肠杆菌DH5α细胞(Takara，大连)。提取pUC-20T-N阳性质粒，经Thermo ScientificNanoDrop 2000Spectrophotometers(Thermo，美国)测定其质粒浓度。质粒拷贝数按照以下公式计算：DNA拷贝数(copies/μL)＝(M×6.02×1023×10-9)/(n×660)，M:分子量；n：在260nm处测定质粒的浓度。
引物与探针设计
参照GenBank中已公布的PDCoVN基因序列(NC_KJ481931.1)设计特异性引物和探针。用于RT-PCR和LFD-RPA检测PDCoV目的基因的扩增。在探针3′端上采用阻断聚合酶扩增C3Spacer基团修饰，5'端上进行羧基荧光素(FAM)标记，并于探针中加入四氢呋喃脱碱基位点(THF)修饰。同时，在反向引物5'端中应用生物素进行标记(表1)。
LFD-RPA检测PDCoV反应体系
LFD-RPA反应体系及条件是按照TwistAmp nfo Kit试剂盒说明书进行的。具体步骤如下：每个RPA反应的总体积为50μL，反应体系为：再水化缓冲液29.5μL，ddH2O 11μL，引物LFD-F/R 2.4μL，LFD-Probe 1.2μL和质粒pUC-20T-N 1μL，充分混匀后每个反应管及时加入280mM醋酸镁溶液启动反应。同时，迅速混匀反应液，置于37℃恒温金属浴中，300rmp/min作用20min。在冰上作用2min停止反应，取扩增产物用反应缓冲液进行10倍稀释后200μL稀释液加入到LFD末端，并迅速将LFD转移至含有200μL反应缓冲液1.5mL离心管中，室温孵育10min，肉眼观察结果。如果LFD上同时出现控制线和检测线时，即表示检测样品为阳性。如果LFD上只出现控制线时而无检测线时，即表示检测样品为阴性。当LFD上无控制线时，即表示反应不成立。
LFD-RPA反应温度
反应温度和反应时间是LFD-RPA检测方法两个关键的参数，参数的选取对提高LFD-RPA检测PDCoV效率至关重要。以1×107copies/μL DNA标准质粒为模板，测定LFD-RPA在4、10、15、20、25、30、35、37和42℃不同温度条件下作用20min。检测结果用肉眼观察到试纸条上明显的检测线和控制线，如图1所示，LFD-RPA可以在10～37℃温度范围内进行扩增，当温度在42℃或者4℃是均无检测线出现，而温度在15～37℃范围内扩增效果较佳。
LFD-RPA反应时间
以1×107copies/μL DNA标准质粒为模板。当反应温度为37℃时，测定LFD-RPA在0、5、10、15、20、25和30min不同反应时间条件下的检测情况。结果表明LFD-RPA可以在37℃5min内完成扩增(LFD-RPA不同反应时间下检测结果图2)。然而为了保证检测方法的效率及准确性，故选择37℃10min作为优化后LFD-RPA最佳的反应温度和时间。
LFD-RPA重复性试验
以1×107、1×106和1×105copies/μL不同浓度DNA标准质粒为模板，在LFD-RPA反应温度和时间分别为37℃和10min条件下，每个模板在不同时间段进行3次重复试验，观察结果。重复性实验结果显示，使用不同浓度标准质粒DNA，LFD-RPA检测方法均出现明显的控制线和检测线，证实其具有良好的重复性(图3)。
LFD-RPA敏感性试验
为了测定LFD-RPA检测方法的敏感性，用去离子水将DNA标准质粒连续10倍稀释至1×109到1×101copies/μL。以稀释后的DNA标准质粒为模板，测定LFD-RPA检测方法的敏感性。同时，RT-PCR同样使用稀释后的DNA标准质粒为模板，并设置阴性对照，比较二者之间敏感性差异。结果如图4所示，LFD-RPA检测方法最低能够检测到1×102copies/μL标准质粒(图4a)，而RT-PCR检测方法最低能够检测到1×103copies/μL标准质粒(图4b)，表明LFD-RPA检测方法的灵敏性是RT-PCR的10倍。
LFD-RPA特异性试验
通过测定PDCoV、PEDV、TGEV、PKoV、FMDV和PRRSV来评价LFD-RPA检测方法的灵敏性，将上述6种猪相关病毒作为模板，进行LFD-RPA检测，观察结果。结果如图5，只有检测PDCoV时同时出现明显控制线和检测线条带，而其它相关病毒均只出现控制线条带，表明LFD-RPA检测方法具有良好的特异性。
LFD-RPA临床样品检测
20份临床腹泻样品(含10份粪便拭子和10份肠道样品)经MEM培养基10倍稀释，4℃3500rmp/min离心30min。取上清提取RNA作为模板，应用LFD-RPA和RT-PCR两种检测方法在临床样品中检测PDCoV，验证LFD-RPA检测方法的有效性。
结果如图6显示(其中，图6-a为利用LFD-RPA检测方法对20份临床腹泻样品的进行检测，图6-b为利用RT-PCR两种检测方法对20份临床腹泻样品的进行检测)，LFD-RPA检测临床腹泻样品中PDCoV阳性率为35％(7/20)，其阳性率与传统的RT-PCR检测相同(图6)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测引物探针组及试剂盒
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtcgtaaga cccagcatca agctcccaag cggac 35
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactgtgatt gagtaggaga aggtaagggt aattg 35
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtcggctctg gagacactga gaagacgggt atggctgatc ctcgcatca 49
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtcgtaaga cccagcatca agctcccaag cggac 35
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gattatgctg taccctcgat cgt 23

Claims (6)

1.猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物为在SEQ ID NO.2所示核苷酸序列5’端修饰生物素的物质；
所述探针为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的3’端修饰C3 Spacer，5’端修饰荧光素、5’端起第30位碱基修饰四氢呋喃残基的物质。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光素包括FAM或FITC。
3.猪德尔塔冠状病毒LFD-RPA快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物探针组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括再水化缓冲液和水。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应温度为15～37℃。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应时间为10min。
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