CN104745731A - 非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂及其制备方法与用途 - Google Patents

非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光rt-pcr检测试剂及其制备方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途，设计合成了三套分别针对非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’-UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的特异性引物及Taqman探针和阳性对照，并利用这三套引物及探针建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的三重荧光RT-PCR检测体系，可在3～4小时内从被检样本中快速、准确、特异、安全、简便地同时检出非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸，可用于家猪及其相关样本中微量非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸的同时检测。

Description

非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途。
背景技术
非洲猪瘟(african swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病。其特征为病程短、病死率高、临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟,表现高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血。猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，根据流行毒株的毒力强弱和猪免疫状况不同呈现急性型、亚急性型、温和型等临床症状。猪呼吸与繁殖综合征是由猪呼吸与繁殖综合征病毒引起猪的一种以断奶前仔猪高死亡率、育成猪呼吸道症状和母猪繁殖障碍为主要症状的高度接触性传染病。由于非洲猪瘟、猪瘟和猪呼吸与繁殖综合征这三种疫病在临床上有相似表现，仅凭临床症状不易区分，因此对临床疑似发病猪进行非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴别检测，能够为及早发现和控制这三种动物疫病提供病原学依据。多重荧光RT-PCR方法可同时检测多种病原核酸，具有一次RT-PCR反应就能简便、经济、快速地鉴别和检测多种病原的优点。目前检测单一的非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的荧光PCR和荧光RT-PCR方法和公开专利均有报道，而能够同时检测非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与应用，还罕见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途，具体涉及一种分别以非洲猪瘟病毒CP530R、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2为扩增靶序列而研制的检测试剂，该检测试剂包括三对引物、三条标记探针和三个阳性对照。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是通过以下步骤实现的：一种非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂，包括用于分别检测非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’-UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的三对特异性引物、三条特异性探针和三个阳性对照，扩增目标长度分别为73bp、77bp和和95bp，引物和探针序列为：
非洲猪瘟病毒
上游引物：CP530R-F:5’-GTGTCAATAATCCCTATCTTGCCA-3’     SEQ ID NO.1
下游引物：CP530R-R：5’-AACTCGGTGGGATGGTTGAG-3’        SEQ ID NO.2
探针：CP530R-P:5’-FAM-TCCTTGCTGTCTTTCTTGTC-3’-MGB           SEQ ID NO.3
阳性对照：ACTGGTGTAGTGTCAATAATCCCTATCTTGCCAAATCAGTTTCCTTGCTGTCTTTCTTGTCGCTCAACCATCCCACCGAGTTTATTAAGGTACTGCCGCTTATAGAC；                      SEQ ID NO.4
猪瘟病毒
上游引物：CSFV-5’UTR-F:5’-GTTCGACGTGAGCAGAAGCC-3’          SEQ ID NO.9
下游引物：CSFV-5’UTR-R:5’-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTC-3’         SEQ ID NO.10探针：CSFV-5’UTR-P:5’-VIC-ACCACCATAGCAATGAGCAAGG-MGB-3’           SEQ ID NO.11阳性对照：CSFV-5’UTR:CTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACCTTAACCCTAGCGG
                                                              SEQ ID NO.12
猪繁殖与呼吸综合征病毒
上游引物：PRRSV-NSP2-F:5’-CTCACAGACGGAATATGAGGC-3’          SEQ ID NO.17下游引物：PRRSV-NSP2-R:5’-CACTCAGGACTTCCTCAGCTTC-3’                SEQ ID NO.18探针：PRRSV-NSP2-P:5’-NED-CACCATCGCAGAAC-MGB-3’                    SEQ ID NO.19阳性对照：PRRSV-NSP2:GATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGGGGGCAAGAAGCTGAGGAAGTCCTGAGTGAAATCTC
                                                              SEQ ID NO.20。
上述的非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)选择非洲猪瘟病毒CP530R基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，为：
ACTGGTGTAGTGTCAATAATCCCTATCTTGCCAAATCAGTTTCCTTGCTGTCTTTCTTGTCGCTCAACCATCCCACCGAGTTTATTAAGGTACTGCCGCTTATAGAC；
(2)选择猪瘟病毒5’UTR基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，为：
CTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACCTTAACCCTAGCGG；
(3)选择猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，为：
GATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGGGGGCAAGAAGCTGAGGAAGTCCTGAGTGAAATCTC；
(4)设计4条引物，以之PCR扩增和制备CP530R基因阳性对照，引物序列SEQ IDNO.5-SEQ ID NO.8如下：
CP530RF1：5’-TCTTGCCAAGTCGGTCTCCTTGCTGTCTTTCTTGTCGCCTCAACCATCCCACCGAGTT-3’
CP530RR1：5’-AACTCGGTGGGATGGTTGAGGCGACAAGAAAGACAGCAAGGAGACCGACTTGGCAAGA-3’
CP530RF2：5’-ACTGGTGTAGTGTCAATAATCCCTATCTTGCCAAGTCGGTCTCCTTGCTG-3’
CP530RR2：5’-GTCTATAAGCGGCAGTACCTTAATAACTCGGTGGGATGGTTGAGGCGA-3’
(5)设计4条引物，以之PCR扩增和制备猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.16，如下：
CSFV-F1:5’-CTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGC-3’
CSFV-F2:5’-GTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCA-3’
CSFV-F1:5’-TGCCCTCGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGCTTCTGCTCACGTCGAACTACTGACGAC-3’
CSFV-R2:5’-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTGGGCATGCCCTCGTCCACATAGCATC-3’
(6)设计4条引物，以之PCR扩增和制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.24，如下：
PRRSV-NSP2-F1:5’-GGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGG-3’
PRRSV-NSP2-R1:5’-CCCCGCCTCCAGGATGCCCATGTTCTGCGATGGTGCTAGGGGGAAAGCCTCATATTCC-3’
PRRSV-NSP2-F2:5’-GATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTTCCCCCTA-3’
PRRSV-NSP2-R2:5’-GAGATTTCACTCAGGACTTCCTCAGCTTCTTGCCCCCCCGCCTCCAGGATGCCCATG-3’
(7)根据非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照序列、猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照序列，设计多对引物和多条探针,经过大量的对比筛选试验，确定最适的引物对和标记探针组合：
非洲猪瘟病毒
上游引物：CP530R-F:5’-GTGTCAATAATCCCTATCTTGCCA-3’          SEQ ID NO.1
下游引物：CP530R-R：5’-AACTCGGTGGGATGGTTGAG-3’             SEQ ID NO.2
探针：CP530R-P:5’-FAM-TCCTTGCTGTCTTTCTTGTC-3’-MGB          SEQ ID NO.3
猪瘟病毒
上游引物：CSFV-5’UTR-F:5’-GTTCGACGTGAGCAGAAGCC-3’         SEQ ID NO.9
下游引物：CSFV-5’UTR-R:5’-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTC-3’        SEQ ID NO.10
探针：CSFV-5’UTR-P:5’-VIC-ACCACCATAGCAATGAGCAAGG-MGB-3’   SEQ ID NO.11
猪繁殖与呼吸综合征病毒
上游引物：PRRSV-NSP2-F:5’-CTCACAGACGGAATATGAGGC-3’         SEQ ID NO.17
下游引物：PRRSV-NSP2-R:5’-CACTCAGGACTTCCTCAGCTTC-3’        SEQ ID NO.18
探针：PRRSV-NSP2-P:5’-NED-CACCATCGCAGAAC-MGB-3’            SEQ ID NO.19
(8)检测非洲猪瘟病毒CP530R基因的探针的5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；检测猪瘟病毒5’UTR基因的探针的5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的探针的5’端标记的荧光报告基团是NED，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；
(9)经过大量的对比试验和反应条件优选，确定三重荧光RT-PCR最适的反应条件、引物及探针的特异性和灵敏度。
所述(9)中的最适的反应条件为检测非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的上、下游引物使用浓度均为12pmol/μL，探针的使用浓度均为5.0pmol/μL，在50μL体系中均加入1.0μL的引物及探针；引物及探针的特异性使其区别于猪源其它病毒，检测非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的灵敏度分别达到610个拷贝、110个拷贝和410个拷贝。
所述的非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂在生产标准化试剂盒中的应用。
所述的非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂在绘制非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测标准曲线的用途。
本发明的有益效果是：(1)具有特异、敏感、准确、快速和经济的特点，尤其适用于从少量家猪及其相关样本中同时检测微量非洲猪瘟病毒核酸、猪瘟病毒核酸和猪繁殖与呼吸综合征病毒的核酸。(2)本发明中的非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照制备方法，既不涉及非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒及其基因组核酸的使用，也不需要人工合成较长的非洲猪瘟病毒CP530R基因DNA片段、猪瘟病毒5’UTR基因RNA片段和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因RNA片段，具有简便、安全和经济的优势。
附图说明
图1为最适引物对与标记探针对非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照的实时荧光RT-PCR扩增曲线。
图2为最适引物对与标记探针对非洲猪瘟病毒CP530R基因的荧光特异性扩增曲线。
图3为对6.1×108～6.1×102copies/μL浓度范围内的非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照的荧光定量RT-PCR扩增动力学曲线。
图4为非洲猪瘟病毒CP530R基因的荧光定量RT-PCR标准曲线。
图5为最适引物对与标记探针对猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照的荧光RT-PCR扩增曲线。
图6为最适引物对与标记探针对猪瘟病毒5’UTR基因的荧光RT-PCR特异性扩增曲线。
图7为对1.1×108～1.1×102copies/μL浓度范围内的猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照的荧光定量RT-PCR扩增动力学曲线。
图8为猪瘟病毒5’UTR基因的荧光定量RT-PCR标准曲线。
图9为最适引物对与标记探针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照的实时荧光RT-PCR扩增曲线。
图10为最适引物对与标记探针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的荧光RT-PCR特异性扩增曲线。
图11为对4.1×108～4.1×102copies/μL浓度范围内的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照的荧光定量RT-PCR扩增动力学曲线。
图12为猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的荧光定量RT-PCR标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细描述。
本发明的非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂及其制备方法与用途，包括以下步骤。
第一步骤是制备非洲猪瘟病毒CP530R基因的阳性对照物质，过程包括：
(1)在NCBI网站中，对非洲猪瘟病毒CP530R基因序列进行BLAST比对，选择一段保守序列用于非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照制备，如SEQ ID NO.4所示。
(2)基于SEQ ID NO.4序列设计合成4条引物，引物序列如下：
CP530RF15’-TCTTGCCAAGTCGGTCTCCTTGCTGTCTTTCTTGTCGCCTCAACCATCCCACCGAGTT-3’
CP530RR15’-AACTCGGTGGGATGGTTGAGGCGACAAGAAAGACAGCAAGGAGACCGACTTGGCAAGA-3’
CP530RF2：5’-ACTGGTGTAGTGTCAATAATCCCTATCTTGCCAAGTCGGTCTCCTTGCTG-3’
CP530RR2：5’-GTCTATAAGCGGCAGTACCTTAATAACTCGGTGGGATGGTTGAGGCGA-3’；
(3)以两条互补引物作为扩增模板，另外二条与用作模板的引物序列部分重叠的引物作为扩增引物进行常规PCR扩增；
(4)回收、纯化含有SEQ ID NO.1序列的PCR扩增产物，与PCR2.1克隆载体连接，转化至DH5α大肠杆菌基因工程菌，挑取、提取阳性克隆质粒；
(5)用DNA分析仪进行质量测定，按公式换算成拷贝数，即得已知拷贝数浓度的非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照(质粒)。
第二步骤是制备猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照，过程包括：
(1)在NCBI网站中，对猪瘟病毒5’UTR基因序列进行BLAST比对，选择一段保守序列用于猪瘟病毒5’UTR阳性对照(RNA)制备，如SEQ ID NO.8所示。
(2)基于SEQ ID NO.12序列设计合成4条引物，引物序列如下：
CSFV-F1:5’-CTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGC-3’
CSFV-F2:5’-GTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCA-3’
CSFV-F1:5’-TGCCCTCGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGCTTCTGCTCACGTCGAACTACTGACGAC-3’
CSFV-R2:5’-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTGGGCATGCCCTCGTCCACATAGCATC-3’
(3)以两条互补引物作为扩增模板，另外二条与用作模板的引物序列部分重叠的引物作为扩增引物进行常规PCR扩增；
(4)回收、纯化含有SEQ ID NO.8序列的PCR扩增产物，与PCR2.1克隆载体连接，转化至DH5α大肠杆菌基因工程菌，挑取、提取阳性克隆质粒；
(5)对上述纯化的阳性克隆质粒用Bam HⅠ酶切，回收酶切产物，以线性化的阳性克隆质粒DNA为模板，使用DNA体外转录试剂盒进行体外转录，用DNA酶消化DNA模板，提取RNA。
(6)用核酸分析仪进行质量测定，按公式换算成拷贝数，即得已知拷贝数浓度的猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照(RNA)。
第三步骤是是制备猪繁殖与呼吸综合症病毒基因阳性对照，过程包括：
(1)在NCBI网站中，对猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因序列进行BLAST比对，选择一段保守序列用于猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照制备，如SEQ ID NO.8所示。
(2)基于SEQ ID NO.4序列设计合成4条引物，引物序列如下：
PRRSV-NSP2-F1:5’-GGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGG-3’
PRRSV-NSP2-R1:5’-CCCCGCCTCCAGGATGCCCATGTTCTGCGATGGTGCTAGGGGGAAAGCCTCATATTCC-3’
PRRSV-NSP2-F2:5’-GATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTTCCCCCTA-3’
PRRSV-NSP2-R2:5’-GAGATTTCACTCAGGACTTCCTCAGCTTCTTGCCCCCCCGCCTCCAGGATGCCCATG-3’；
(3)以两条互补引物作为扩增模板，另外二条与用作模板的引物序列部分重叠的引物作为扩增引物进行常规PCR扩增；
(4)回收、纯化含有SEQ ID NO.8序列的PCR扩增产物，与PCR2.1克隆载体连接，转化至DH5α大肠杆菌基因工程菌，挑取、提取阳性克隆质粒；
(5)对上述纯化的阳性克隆质粒用Bam HⅠ酶切，回收酶切产物，以线性化的阳性克隆质粒DNA为模板，使用DNA体外转录试剂盒进行体外转录，用DNA酶消化DNA模板，提取RNA。
(6)用DNA/RNA分析仪进行质量测定，按公式换算成拷贝数，即得已知拷贝数浓度的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照(RNA)。
第四步骤是设计合成与筛选检测非洲猪瘟病毒CP530R基因的引物、探针，过程包括：
(1)基于SEQ ID NO.1所示序列，设计合成多对引物和多个标记探针；
(2)以第一步骤制备的1000倍稀释的非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照质粒为模板，采用One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂及推荐的反应扩增条件，扩增试剂及推荐的反应扩增条件，在ABI Applied7500荧光PCR仪对所设计合成的多对引物和标记探针进行筛选试验；
(3)在相同荧光PCR反应扩增试剂及推荐的反应扩增条件下,以出现最小的Ct值、最高荧光强度增加值(ΔRn)以及典型的S型扩增曲线的综合判定标准，扩增曲线分别见图1，最终确定的检测非洲猪瘟病毒CP530R基因的最适引物和标记探针序列分别为：
上游引物：CP530R-F:5’-GTGTCAATAATCCCTATCTTGCCA-3’
下游引物：CP530R-R：5’-AACTCGGTGGGATGGTTGAG-3’
探针：CP530R-P:5’-FAM-TCCTTGCTGTCTTTCTTGTC-3’-MGB。
第五步骤是设计合成与筛选检测猪瘟病毒5’UTR基因的引物、探针，过程包括：
(1)基于SEQ ID NO.4所示序列，设计合成多对引物和多个标记探针；
(2)以第一步骤制备的1000倍稀释的猪瘟病毒5’UTR基因的阳性对照(RNA)为模板，采用One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂及推荐的反应扩增条件，在ABI Applied7500荧光PCR仪对所设计合成的多对引物和标记探针进行筛选试验；
(3)以出现最小的Ct值、最高的荧光强度增加值(ΔRn)以及典型的S型扩增曲线的综合判定标准，见图5,最终确定的检测猪瘟病毒5’UTR基因的最适引物对和标记探针序列分别为：
上游引物：CSFV-5’UTR-F:5’-GTTCGACGTGAGCAGAAGCC-3’        SEQ ID NO.9
下游引物：CSFV-5’UTR-R:5’-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTC-3’       SEQ ID NO.10
探针：CSFV-5’UTR-P:5’-VIC-ACCACCATAGCAATGAGCAAGG-MGB-3’  SEQ ID NO.11
第六步骤是设计合成与筛选检测猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的引物、探针，过程包括：
(1)基于SEQ ID NO.4所示序列，设计合成多对引物和多个标记探针；
(2)以第一步骤制备的1000倍稀释的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的阳性对照(RNA)为模板，采用One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂及推荐的反应扩增条件，在ABI Applied7500荧光PCR仪对所设计合成的多对引物和标记探针进行筛选试验；
(3)以出现最小的Ct值、最高的荧光强度增加值(ΔRn)以及典型的S型扩增曲线的综合判定标准，扩增曲线分别见图8，最终确定的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的最适引物对和标记探针序列分别为：
上游引物：PRRSV-NSP2-F:5’-CTCACAGACGGAATATGAGGC-3’    SEQ ID NO.9
下游引物：PRRSV-NSP2-R:5’-CACTCAGGACTTCCTCAGCTTC-3’   SEQ ID NO.10
探针：PRRSV-NSP2-P:5’-VIC-CACCATCGCAGAAC-MGB-3’       SEQ ID NO.11
第七步骤是优化检测非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的三重荧光RT-PCR反应体系与扩增条件，过程包括：
(1)对第四步骤、第五步骤和第六步骤确定的引物和标记探针，用无菌水分别配制成10pmol/μL、8pmol/μL、6pmol/μL、4pmol/μL、2pmol/μL的工作浓度，将探针用无菌水分别配制成3.5pmol/μL、3pmol/μL、2.5pmol/μL、2.0pmol/μL、1.5pmol/μL的工作浓度；
(2)采用One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)试剂及推荐的反应扩增条件，在ABI Applied7500荧光PCR仪上对不同使用浓度组合的引物和标记探针进行荧光RT-PCR方阵筛选试验；
(3)以获得最小Ct值、较高的荧光强度增加值(ΔRn)以及典型的S型扩增曲线为综合判定依据，最终确定的检测非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的最适上、下游引物的使用浓度均为12pmol/μL，最适探针的使用浓度均为5pmol/μL，在50μL体系中加入1.0μL引物及探针；
(4)在最适引物和标记探针浓度以及通用荧光RT-PCR反应扩增试剂条件下，对退火延伸温度在61℃～56℃范围内进行筛选试验，最终确定的最适荧光RT-PCR扩增条件为：42℃反应5min；94℃预变性10s；94℃变性10s，60℃延伸34s，共40个循环。
第八步骤是基于第四步骤、第五步骤、第六步骤和第七步骤确定的引物和标记探针的三重荧光RT-PCR方法，分别建立检测非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的荧光RT-PCR扩增标准曲线和确定最低检测限，过程包括：
(1)对非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照进行10倍系列稀释，以第四步骤、第五步骤、第六步骤和第七步骤确定的最适反应体系与扩增条件进行荧光RT-PCR扩增,荧光RT-PCR扩增的动力学曲线见见图3；
(2)以扩增曲线的Ct值为横坐标，以非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照的拷贝数浓度的对数为纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为Y＝-3.453X+38.76，相关系数(r)为0.999，见图4，表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到610个拷贝的非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照DNA分子，可用于微量非洲猪瘟病毒CP530R基因的定量检测，具有很高的检测敏感性。
(3)对猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照进行10倍系列稀释，以第四步骤、第五步骤、第六步骤和第七步骤确定的最适反应体系与扩增条件进行荧光RT-PCR扩增,荧光RT-PCR扩增的动力学曲线见见图7；
(4)以扩增曲线的Ct值为横坐标，以猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照拷贝数浓度的对数为纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为Y＝-3.408X+38.49，相关系数(r)为0.999，见图8,表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到至少110个拷贝的RNA分子，可用于猪瘟病毒5’UTR基因的定量检测，具有很高的检测敏感性。
(5)对猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照进行10倍系列稀释，以第四步骤、第五步骤、第六步骤和第七步骤确定的最适反应体系与扩增条件进行荧光RT-PCR扩增，荧光RT-PCR扩增的动力学曲线见见图11；
(6)以扩增曲线的Ct值为横坐标，以猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照拷贝数浓度的对数为纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为Y＝-3.3186X+39.064，相关系数(r)为0.9985，表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到至少410个拷贝的RNA分子，可用于尼帕病毒M基因的定量检测，具有很高的检测敏感性。
第九步骤是对基于第四步骤、第五步骤、第六步骤和第七步骤确定的引物和标记探针的三重荧光RT-PCR方法进行特异性试验，过程包括：
(1)对于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流感病毒病毒的细胞培养物和猪口蹄疫疫苗，采用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒按操作说明书提取基因组RNA；
(2)对于伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒的细胞培养物，采用采用TaKaRaMiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒按操作说明书提取基因组DNA。
(3)以基于第四步骤、第五步骤、第六步骤和第七步骤确定的引物和标记探针的三重荧光RT-PCR方法，对猪口蹄疫病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流感病毒病毒的基因组RNA以及伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒的基因组DNA进行荧光RT-PCR扩增，检测结果显示基于第四步骤、第五步骤、第六步骤和第七步骤确定的引物和标记探针的三重荧光RT-PCR方法具有良好的特异性，与上述猪相关病毒核酸不出现非特异性扩增曲线，分别见图2、图6和图10。
第十步骤是确定检测家猪及其相关样本中非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的的操作方法，过程包括：
(1)建立处理家猪及其相关样本方法；
(2)同时提取样本的RNA/DNA的方法；
(3)利用基于第四步骤、第五步骤、第六步骤和第七步骤确定的引物和标记探针的三重荧光RT-PCR方法，对这些样本进行非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因检测及结果判定。
实施例1非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照的制备
对非洲猪瘟病毒CP530R基因序列(GenBank收录号：KJ380911.1)进行BLAST，选取一段保守且适宜设计荧光PCR引物和探针的序列作为制备非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照质粒的参考序列，如SEQ ID NO.4所示。
2.扩增引物设计与合成
基于上述序列，设计合成4条PCR扩增引物，其中CP530RF1和CP530RR1序列完全互补用做模板，CP530RF2和CP530RR2分别与CP530RF1和CP530RR1序列部分重叠，合成的序列如下：
CP530RF15-TCTTGCCAAGTCGGTCTCCTTGCTGTCTTTCTTGTCGCCTCAACCATCCCACCGAGTT-3
CP530RR1：5-AACTCGGTGGGATGGTTGAGGCGACAAGAAAGACAGCAAGGAGACCGACTTGGCAAGA-3
CP530RF2：5-ACTGGTGTAGTGTCAATAATCCCTATCTTGCCAAGTCGGTCTCCTTGCTG-3
CP530RR2：5-GTCTATAAGCGGCAGTACCTTAATAACTCGGTGGGATGGTTGAGGCGA-3
3.PCR扩增
在50μL PCR扩增体系中，依次加入10×Buffer(含MgCl2)5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，TaKaRa Taq聚合酶(5.0U/μL)0.2μL，CP530RF1(1pmmol/μL)和CP530RR1(1pmmol/μL)各1μL，CP530RF2(25pmmol/μL)和CP530RR2(25pmmol/μL)各1μL，补足ddH2O至50μL。
PCR扩增反应参数条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸6min；4℃保温1min。
4.PCR产物的回收、纯化
取PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，切割大小为121bp的目的扩增条带，按照小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作说明书纯化回收目的DNA片段。
5.PCR产物与克隆载体的连接、转化
按照PCR2.1克隆载体操作说明书，将纯化的目的DNA片段与PCR2.1克隆载体在16℃条件下过夜连接，将该连接产物与DH5α大肠杆菌基因工程菌混合，42℃热激90s，冰浴2min后，加入1mL LB培养基37℃振摇培养1h，然后于AMP+LB平板上涂布后37℃过夜培养。
6.CP530R基因阳性对照(质粒)的挑选、鉴定及测定
挑取10个单菌落，于3mL LB培养基中37℃振摇过夜培养，然后用小量质粒提取试剂盒按操作说明书提取和纯化克隆质粒，用PCR方法筛选插入PP62保守序列的阳性克隆质粒；用DNA/RNA含量分析仪对纯化的阳性克隆质粒进行质量测定，并按照如下公式将质粒质量换算成拷贝数：
由上述方法即制备成非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照。
实施例2猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照(RNA)的制备
1.参照基因序列的选择
对猪瘟病毒5’UTR基因序列(GenBank收录号：AY259122)进行BLAST，选取一段保守且适宜设计荧光RT-PCR引物和探针的序列作为制备猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照(RNA)的参A)的参如SEQ ID NO.1所示。
2.扩增引物设计与合成
基于上述序列，设计合成4条PCR扩增引物，其中CSFV-F1和CSFV--R1序列完全互补用做模板，CSFV-F2和CSFV--R2分别与CSFV-F1和CSFV-R1序列部分重叠，合成的序列如下：
CSFV-F2:5’-CTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGC-3’
CSFV-F1:5’-GTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCA-3’
CSFV-R1:5’-TGCCCTCGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGCTTCTGCTCACGTCGAACTACTGACGAC-3’
CSFV-R2:5’-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTGGGCATGCCCTCGTCCACATAGCATC-3’
3.PCR扩增
在50μL PCR扩增体系中，依次加入10×Buffer(含MgCl2)5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，TaKaRa Taq聚合酶(5.0U/μL)0.2μL，CSFV-F1(1pmmol/μL)和CSFV-R1(1pmmol/μL)各1μL，CSFV-F2(25pmmol/μL)和PRRSV-NSP2-R2(25pmmol/μL)各1μL，补足ddH2O至50μL。
PCR扩增反应参数条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸6min；4℃保温1min。
4.PCR产物的回收、纯化
取PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，切割大小为128bp的目的扩增条带，按照小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作说明书纯化回收目的DNA片段。
5.PCR产物与克隆载体的连接、转化
按照PCR2.1克隆载体操作说明书，将纯化的目的DNA片段与PCR2.1克隆载体在16℃条件下过夜连接，将该连接产物与DH5α大肠杆菌基因工程菌混合，42℃热激90s，冰浴2min后，加入1mL LB培养基37℃振摇培养1h，然后于AMP+LB平板上涂布后37℃过夜培养。
6.插入猪瘟病毒5’UTR基因阳性质粒的挑选、鉴定
挑取10个单菌落，于3mL LB培养基中37℃振摇过夜培养，然后用小量质粒提取试剂盒按操作说明书提取和纯化克隆质粒，用PCR方法筛选插入猪瘟病毒5’UTR保守序列的阳性克隆质粒；
7.猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照(RNA)的制备及拷贝数测定
对上述纯化的阳性克隆质粒用Bam HⅠ酶切，回收酶切产物，以线性化的阳性克隆质粒DNA为模板，使用DNA体外转录试剂盒RiboMAXTM Large Scale RNA Production SystemT7,按照操作说明书进行体外转录，用DNA酶消化DNA模板，提取RNA，分装。用核酸含量分析仪对纯化的阳性克隆质粒进行质量测定，并按照如下公式将质粒质量换算成拷贝数：
由上述方法即制备成猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照(RNA)。
实施例3猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照(RNA)的制备
1.参照基因序列的选择
对猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因序列(GenBank收录号：JX087437)进行BLAST，选取一段保守且适宜设计荧光RT-PCR引物和探针的序列作为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照(RNA)的参考序列，如SEQ ID NO.1所示。
2.扩增引物设计与合成
基于上述序列，设计合成4条PCR扩增引物，其中PRRSV-NSP2-F1和PRRSV-NSP2-R1序列完全互补用做模板，PRRSV-NSP2-F2和PRRSV-NSP2-R2分别与PRRSV-NSP2-F1和
PRRSV-NSP2-R1序列部分重叠，合成的序列如下：
PRRSV-NSP2-F1:5’-GGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGG-3’
PRRSV-NSP2-R1:5’-CCCCGCCTCCAGGATGCCCATGTTCTGCGATGGTGCTAGGGGGAAAGCCTCATATTCC-3’
PRRSV-NSP2-F2:5’-GATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTTCCCCCTA-3’
PRRSV-NSP2-R2:5’-GAGATTTCACTCAGGACTTCCTCAGCTTCTTGCCCCCCCGCCTCCAGGATGCCCATG-3’；
3.PCR扩增
在50μL PCR扩增体系中，依次加入10×Buffer(含MgCl2)5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，TaKaRa Taq聚合酶(5.0U/μL)0.2μL，PRRSV-NSP2-F1(1pmmol/μL)和PRRSV-NSP2-R1(1pmmol/μL)各1μL，PRRSV-NSP2-F2(25pmmol/μL)和PRRSV-NSP2-R2(25pmmol/μL)各1μL，补足ddH2O至50μL。
PCR扩增反应参数条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，共35个循环；72℃延伸6min；4℃保温1min。
4.PCR产物的回收、纯化
取PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，切割大小为128bp的目的扩增条带，按照小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的操作说明书纯化回收目的DNA片段。
5.PCR产物与克隆载体的连接、转化
按照PCR2.1克隆载体操作说明书，将纯化的目的DNA片段与PCR2.1克隆载体在16℃条件下过夜连接，将该连接产物与DH5α大肠杆菌基因工程菌混合，42℃热激90s，冰浴2min后，加入1mL LB培养基37℃振摇培养1h，然后于AMP+LB平板上涂布后37℃过夜培养。
6.插入猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性质粒的挑选、鉴定
挑取10个单菌落，于3mL LB培养基中37℃振摇过夜培养，然后用小量质粒提取试剂盒按操作说明书提取和纯化克隆质粒，用PCR方法筛选插入PP62保守序列的阳性克隆质粒；
7.猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照(RNA)的制备及拷贝数测定
对上述纯化的阳性克隆质粒用Bam HⅠ酶切，回收酶切产物，以线性化的阳性克隆质粒DNA为模板，使用DNA体外转录试剂盒RiboMAXTM Large Scale RNA Production SystemT7,按照操作说明书进行体外转录，用DNA酶消化DNA模板，提取RNA，分装。用DNA/RNA核酸含量分析仪对纯化的阳性克隆质粒进行质量测定，并按照如下公式将质粒质量换算成拷贝数：
由上述方法即制备成猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照(RNA)。
实施例4非洲猪瘟病毒CP530R基因荧光定量PCR检测标准曲线的绘制
1.CP530R基因阳性对照(质粒)的稀释
对浓度为6.1×1010的非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照(质粒)进行10倍系列稀释，选择6.1×108～6.1×102倍稀释的CP530R基因阳性对照(质粒)作为标准品模板。
2.荧光PCR反应的体系配制及扩增
采用TaKaRa公司的采用TaKaRa公司的One Step PrimeScriptTM RT--PCR Kit(Perfect Real Time)荧光RT-PCR反应试剂，按表1的反应体系组成配制反应体系，充分混合均匀后向每个荧光PCR管中分装24.0μL，然后依次加入1.0μL10倍系列稀释的CP530R基因阳性对照(质粒)，每个稀释度做3个平行检测体系，密封后离心后，放置于ABI Applied7500荧光PCR仪上的样本检测槽中。反应参数为42℃5min，95℃10sec，然后95℃10sec，56℃10sec，60℃30sec，40个循环，在每一次循环60℃退火结束前采集FAM通道的荧光信号。
表1 荧光RT-PCR反应体系组成
3.标准曲线的绘制
反应结束后，获得的非洲猪瘟病毒CP530R基因荧光RT-PCR扩增动力学曲线见图3，非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照的拷贝数浓度与对应的Ct值见表2。
表2 非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照的荧光定量PCR各拷贝数对应Ct值
以扩增曲线的Ct值为横坐标，以非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照的拷贝数浓度为纵坐标绘制标准曲线，获得的获得的标准曲线回归方程为Y＝-3.453X+38.76，相关系数(r)为0.999，见图4，表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到至少610个拷贝的非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照DNA分子，可用于微量非洲猪瘟病毒CP530R基因的定量检测，具有很高的检测敏感性。
实施例5猪瘟病毒5’UTR基因荧光定量RT-PCR检测标准曲线的绘制
1.猪瘟病毒5’UTR基因(RNA)的稀释
对浓度为1.1×109的猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照(RNA)进行10倍系列稀释，选择1.1×108～1.1×102倍稀释的猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照(RNA)作为标准品模板。
2.荧光PCR反应的体系配制及扩增
采用TaKaRa公司的One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)荧光RT-PCR反应试剂，按表3的反应体系组成配制反应体系，充分混合均匀后向每个荧光PCR管中分装24.0μL，然后依次加入1.0μL10倍系列稀释的CP204L基因阳性对照(质粒)，每个稀释度做3个平行检测体系，密封后离心后，放置于ABI Applied7500荧光PCR仪上的样本检测槽中。反应参数为42℃5min，95℃10sec，然后95℃10sec，56℃10sec，60℃30sec，40个循环，在每一次循环60℃退火结束前采集VIC通道的荧光信号。
表3 荧光RT-PCR反应体系组成
3.标准曲线的绘制
反应结束后，获得的猪瘟病毒5’UTR基因荧光RT-PCR扩增动力学曲线见图7，猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照的拷贝数浓度与对应的Ct值见表4。
表4 猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照的荧光定量RT-PCR各拷贝数对应Ct值
以扩增曲线的Ct值为横坐标，以猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照的拷贝数浓度为纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为Y＝-3.408X+38,49，相关系数(r)为0.999，见图8,表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到至少110个拷贝的猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照RNA分子，可用于微量猪瘟病毒5’UTR基因的定量检测，具有很高的检测敏感性。
实施例6猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因荧光定量RT-PCR检测标准曲线的绘制
1.猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因(RNA)的稀释
对浓度为4.1×109的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照(RNA)进行10倍系列稀释，选择4.1×108～4.1×102倍稀释的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照(RNA)作为标准品模板。
2.荧光PCR反应的体系配制及扩增
采用TaKaRa公司的One Step PrimeScriptTM RT--PCR Kit(Perfect Real Time)荧光RT-PCR反应试剂，按表5的反应体系组成配制反应体系，充分混合均匀后向每个荧光PCR管中分装24.0μL，然后依次加入1.0μL10倍系列稀释的CP204L基因阳性对照(质粒)，每个稀释度做3个平行检测体系，密封后离心后，放置于ABI Applied7500荧光PCR仪上的样本检测槽中。反应参数为42℃5min，95℃10sec，然后95℃10sec，60℃34sec，40个循环，在每一次循环60℃退火结束前采集NED通道的荧光信号。
表5 荧光RT-PCR反应体系组成
3.标准曲线的绘制
反应结束后，获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因荧光RT-PCR扩增动力学曲线见图11，猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照的拷贝数浓度与对应的Ct值见表6。
表6 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照的荧光定量RT-PCR各拷贝数对应Ct值
以扩增曲线的Ct值为横坐标，以猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照的拷贝数浓度为纵坐标绘制标准曲线，获得的标准曲线回归方程为Y＝-3.3186X+39.064，相关系数(r)为0.9985，见图12，表明所设计的引物及探针扩增效率和结合率高，优化的反应条件适宜，可检测到至少410个拷贝的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照RNA分子，可用于微量猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的定量检测，具有很高的检测敏感性。
实施例7实际样本中非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的检测
1.样本的处理及其基因组DNA提取
(1)样本的处理
对于猪血液血液样本，直接吸取200μL，用于基因组RNA提取；对于猪肌肉及脏器组织(肝、脾、淋巴结、肺、肾)样本，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研钵中，充分研磨，再加10mL PBS混匀，或置于组织匀浆器中，加入10mL PBS匀浆，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，3000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌1.5mL离心管中，吸取200μL悬液，用于基因组DNA/RNA提取。
(2)基因组DNA/RNA提取
对于猪血液样本和经处理的猪肌肉及脏器组织样本采用TaKaRa MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒，按操作说明书提取的基因组DNA/RNA；同时，按同法处理和提取非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的阳性对照和阴性对照(正常的阴性猪组织样品)的基因组DNA/RNA。
2.荧光RT-PCR反应体系配制及扩增条件
(1)反应体系配制
采用TaKaRa公司的One Step PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real Time)荧光RT-PCR反应试剂，按表3的反应体系组成配制反应体系，充分混合均匀后向每个荧光PCR管中分装40.0μL，然后加入10.0μL核酸检测样本，密封后离心后，放置于ABIApplied7500荧光PCR仪上的样本检测槽中。
表三 重荧光RT-PCR反应体系组成
(2)扩增条件
反应参数为42℃5min，95℃10sec，然后95℃5sec，60℃35sec，40个循环，在每一次循环60℃退火结束前采集FAM、VIC和NED通道的荧光信号。
3.结果判定
试验结束后，观察FAM、VIC和NED通道的阳性对照、阴性对照和样本的扩增曲线和Ct值，判定试验是否成立及样本检测的结果。当阴性对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线，则试验成立，否则此次实验视为无效。Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在病毒，判为阳性结果，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无病毒，判为阴性结果。
本发明建立了一种快速简便、特异性强、灵敏度高的三重荧光定量RT-PCR检测体系，可在3～4小时内从被检样本中快速、准确、特异、安全、经济、简便地检出非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因，尤其适合于从少量样本中同时检测微量的非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (5)

1.一种非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂，其特征在于，包括用于分别检测非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’-UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的三对特异性引物、三条特异性探针和三个阳性对照，扩增目标长度分别为73bp、77bp和95bp，引物和探针序列为：
非洲猪瘟病毒
上游引物：CP530R-F:5’-GTGTCAATAATCCCTATCTTGCCA-3’          SEQ ID NO.1
下游引物：CP530R-R：5’-AACTCGGTGGGATGGTTGAG-3’             SEQ ID NO.2
探针：CP530R-P:5’-FAM-TCCTTGCTGTCTTTCTTGTC-3’-MGB          SEQ ID NO.3
阳性对照：ACTGGTGTAGTGTCAATAATCCCTATCTTGCCAAATCAGTTTCCTTGCTGTCTTTCTTGTCGCTCAACCATCCCACCGAGTTTATTAAGGTACTGCCGCTTATAGAC；              SEQ ID NO.4
猪瘟病毒
上游引物：CSFV-5’UTR-F:5’-GTTCGACGTGAGCAGAAGCC-3’         SEQ ID NO.9
下游引物：CSFV-5’UTR-R:5’-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTC-3’        SEQ ID NO.10
探针：CSFV-5’UTR-P:5’-VIC-ACCACCATAGCAATGAGCAAGG-MGB-3’       SEQ ID NO.11
阳性对照：CTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACCTTAACCCTAGCGG
                                                             SEQ ID NO.12
猪繁殖与呼吸综合征病毒
上游引物：PRRSV-NSP2-F:5’-CTCACAGACGGAATATGAGGC-3’         SEQ ID NO.17
下游引物：PRRSV-NSP2-R:5’-CACTCAGGACTTCCTCAGCTTC-3’            SEQ ID NO.18
探针：PRRSV-NSP2-P:5’-NED-CACCATCGCAGAAC-MGB-3’                SEQ ID NO.19
阳性对照：GATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGGGGGCAAGAAGCTGAGGAAGTCCTGAGTGAAATCTC
                                                             SEQ ID NO.20。
2.如利要求1所述的非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择非洲猪瘟病毒CP530R基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，为：
ACTGGTGTAGTGTCAATAATCCCTATCTTGCCAAATCAGTTTCCTTGCTGTCTTTCTTGTCGCTCAACCATCCCACCGAGTTTATTAAGGTACTGCCGCTTATAGAC；
(2)选择猪瘟病毒5’UTR基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，为：
CTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCATGCCCAAGACACACCTTAACCCTAGCGG；
(3)选择猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因序列保守片段为扩增和制备阳性对照的靶目标序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，为：
GATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGGGGGCAAGAAGCTGAGGAAGTCCTGAGTGAAATCTC；
(4)设计4条引物，以之PCR扩增和制备CP530R基因阳性对照，引物序列SEQ IDNO.5-SEQ ID NO.8如下：
CP530RF1：5’-TCTTGCCAAGTCGGTCTCCTTGCTGTCTTTCTTGTCGCCTCAACCATCCCACCGAGTT-3’
CP530RR1：5’-AACTCGGTGGGATGGTTGAGGCGACAAGAAAGACAGCAAGGAGACCGACTTGGCAAGA-3’
CP530RF2：5’-ACTGGTGTAGTGTCAATAATCCCTATCTTGCCAAGTCGGTCTCCTTGCTG-3’
CP530RR2：5’-GTCTATAAGCGGCAGTACCTTAATAACTCGGTGGGATGGTTGAGGCGA-3’
(5)设计4条引物，以之PCR扩增和制备猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.13-SEQ ID NO.16，如下：
CSFV-F1:5’-CTGGGTGGTCTAAGTCCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGC-3’
CSFV-F2:5’-GTCGTCAGTAGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACCTCGAGATGCTATGTGGACGAGGGCA-3’
CSFV-F1:5’-TGCCCTCGTCCACATAGCATCTCGAGGTGGGCTTCTGCTCACGTCGAACTACTGACGAC-3’
CSFV-R2:5’-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCTTGGGCATGCCCTCGTCCACATAGCATC-3’
(6)设计4条引物，以之PCR扩增和制备猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照，引物序列SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.24，如下：
PRRSV-NSP2-F1:5’-GGAATATGAGGCTTTCCCCCTAGCACCATCGCAGAACATGGGCATCCTGGAGGCGGGG-3’
PRRSV-NSP2-R1:5’-CCCCGCCTCCAGGATGCCCATGTTCTGCGATGGTGCTAGGGGGAAAGCCTCATATTCC-3’
PRRSV-NSP2-F2:5’-GATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTTCCCCCTA-3’
PRRSV-NSP2-R2:5’-GAGATTTCACTCAGGACTTCCTCAGCTTCTTGCCCCCCCGCCTCCAGGATGCCCATG-3’
(7)根据非洲猪瘟病毒CP530R基因阳性对照序列、猪瘟病毒5’UTR基因阳性对照序列和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因阳性对照序列，设计多对引物和多条探针,经过大量的对比筛选试验，确定最适的引物对和标记探针组合：
非洲猪瘟病毒
上游引物：CP530R-F:5’-GTGTCAATAATCCCTATCTTGCCA-3’          SEQ ID NO.1
下游引物：CP530R-R：5’-AACTCGGTGGGATGGTTGAG-3’             SEQ ID NO.2
探针：CP530R-P:5’-FAM-TCCTTGCTGTCTTTCTTGTC-3’-MGB          SEQ ID NO.3
猪瘟病毒
上游引物：CSFV-5’UTR-F:5’-GTTCGACGTGAGCAGAAGCC-3’         SEQ ID NO.9
下游引物：CSFV-5’UTR-R:5’-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTC-3’        SEQ ID NO.10
探针：CSFV-5’UTR-P:5’-VIC-ACCACCATAGCAATGAGCAAGG-MGB-3’   SEQ ID NO.11
猪繁殖与呼吸综合征病毒
上游引物：PRRSV-NSP2-F:5’-CTCACAGACGGAATATGAGGC-3’         SEQ ID NO.17
下游引物：PRRSV-NSP2-R:5’-CACTCAGGACTTCCTCAGCTTC-3’        SEQ ID NO.18
探针：PRRSV-NSP2-P:5’-NED-CACCATCGCAGAAC-MGB-3’            SEQ ID NO.19
(8)检测非洲猪瘟病毒CP530R基因的探针的5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；检测猪瘟病毒5’UTR基因的探针的5’端标记的荧光报告基团是VIC，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；检测猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的探针的5’端标记的荧光报告基团是NED，3’端标记的非荧光淬灭基团为MGB；
(9)经过大量的对比试验和反应条件优选，确定三重荧光RT-PCR最适的反应条件、引物及探针的特异性和灵敏度。
3.根据权利要求2所述的非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂的制备方法，其特征在于，所述(9)中的最适的反应条件为检测非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的上、下游引物使用浓度均为12pmol/μL，探针的使用浓度均为5.0pmol/μL，在50μL体系中均加入1.0μL的引物及探针；引物及探针的特异性使其区别于猪源其它病毒，检测非洲猪瘟病毒CP530R基因、猪瘟病毒5’UTR基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因的灵敏度分别达到610个拷贝、110个拷贝和410个拷贝。
4.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂在生产标准化试剂盒中的应用。
5.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂在绘制非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR检测标准曲线的用途。
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