CN106868224A - 检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和nadc‑30毒株的rt‑pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC‑30毒株的RT‑PCR方法，本发明参考GenBank中发表的猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)Nsp2基因序列，应用Primer5.0软件设计了一对引物。这对引物可用于RT‑PCR方法检测猪蓝耳病毒三种氨基酸数目不同的亚型。本发明的灵敏性高、特异性好，能够成功检测出猪蓝耳病毒三种亚型—经典毒株、高致病性变异毒株和NADC‑30毒株，可以对疑似患有猪蓝耳病毒的临床样本进行检测，从而用于猪蓝耳病毒的诊断及流行病学监测。

Description

检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株 的RT-PCR方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)又称为猪蓝耳病，以引起母猪流产，产死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪和育肥猪呼吸困难、败血症、高死亡率为主要特征。该病在世界各地普遍存在，给我国的养猪业造成严重的经济损失。近年来，PRRSV的变异现象引起了人们的关注，国外的研究表明，同一基因型的分离毒株之间存在明显的序列差异，PRRSV的变异是造成本病难以控制的重要原因之一。

目前国际上根据PRRSV的抗原特性，可将其分为欧洲型和美洲型2个血清型，美洲型毒株又根据其在非结构蛋白NSP2碱基数的缺失分为三种亚型，分别为经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株。

RT-PCR方法具体操作步骤是先用特异性引物扩增样品核酸的特异片段基因，取PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳，然后在凝胶成像仪拍照观察，依据目的基因片段大小判断是否为NADC-30目标片段，如基因片段大小为493bp，判定为猪蓝耳病毒阳性，如基因片段大小为860bp，则判定为高致病性猪蓝耳病毒阳性，如果基因片段大小为757bp，则判定为猪蓝耳病毒类NADC-30毒株阳性，否则判定为阴性。RT-PCR方法特异性和灵敏度高。

目前现有技术中没有一种同时检测猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)三种亚型(经典毒株、高致病性变异毒株、NADC-30毒株)的RT-PCR方法。采用单一对引物分别用PCR扩增三种亚型存在操作复杂、检测时间长等缺点，不能及时了解检测样本PRRS的基因特点。

发明内容

有鉴于此，本发明针对采用单一对引物分别用PCR扩增三种亚型存在操作复杂、检测时间长的问题，提供了一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株、NADC-30毒株的RT-PCR方法，可以对疑似患有猪蓝耳病毒的临床样本进行检测，从而用于猪蓝耳病毒的诊断及流行病学监测。目前三种不同亚型的蓝耳病病毒在猪群中普遍存在，但未有同时检测三种亚型的蓝耳病病毒的检测方法。本发明在多株PRRSV Nsp2基因序列比对基础上，设计了一对可区分经典毒株、高致病性毒株和NADC30毒株三种不同基因型PRRSV的特异性引物，本发明是一种简单、快速、灵敏度高和特异强的检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、变异株和NADC-30样毒株的引物，用于RT-PCR反应，该引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法，包括以下步骤：以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用上述的引物，对待测样本进行RT-PCR扩增，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；扩增产物大小为887bp，则样本中含有或候选含有猪蓝耳病毒经典毒株；扩增产物大小为797bp，则样本中含有或候选含有高致病性变异毒株；扩增产物大小为493bp，则样本中含有或候选含有NADC-30毒株。

进一步地，用购自宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒进行反转录，所述反转录的步骤为：将RNA模板4μL与1号5×Prime Script Buffer 4μL、2号Prime ScriptRTEnzyme Mix 1μL、4号Random 6mers 2μL和5号RNase Free dH₂O 9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。

进一步地，反转录的反应条件为：37℃15min，85℃15s，16℃10min。

进一步地，所述RT-PCR扩增的反应体系如下：模板cDNA 3μL，Quick Taq HSDyeMix 10μL，上游引物和下游引物各0.6μL，余下的由ddH₂O补足，总量为20μL。

进一步地，RT-PCR扩增的反应体系条件如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸8min。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明建立的方法对200份疑似患有PRRSV的核酸样本进行RT-PCR检测，检出率为46.5％(93/200)，其中经典毒株检测率为8.5％(17/200)、高致病性变异毒株检出率为28.5％(57/200)和NADC-30毒株检出率为9.5％(19/200)。

2)本发明具有较高的可靠性，特异性好、灵敏性高，克服了对三种毒株进行分别检测所带来的耗时、耗试剂、增加污染概率的风险，与试剂盒相比对PRRSV的诊断和防治具有更加直接和有效的意义。

3)本发明不仅操作步骤少，能节约大量时间，比检测PRRSV单重或二重RT-PCR方法更加灵敏、快速，为猪蓝耳病的快速诊断和流行病学调查奠定了基础。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明中阳性模板经55℃-61℃11个退火温度RT-PCR扩增后，1.5％琼脂糖凝胶电泳图，其中，M代表DNA标准Ⅱ，N代表阴性对照，1-7代表实验样本，分别为55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃和61℃，其中57℃为最适退火温度；

图2是是本发明中阳性模板与不同浓度上下游引物0.2μL-1μL混合后RT-PCR扩增后，1.5％琼脂糖凝胶电泳图；其中，M代表DNA标准Ⅱ，N代表阴性对照，1-5泳道为与0.2μL、0.4μL、0.6μL、0.8μL、1μL浓度混合后的实验样本，其中0.6μL为最佳引物浓度；

图3是本发明中阳性模板用无菌水从10^-1到10^-9做10倍连续稀释后经RT-PCR后，1.5％琼脂糖凝胶电泳图；其中，M代表DNA标准Ⅱ，N代表阴性对照，1-5泳道依次阳性模板稀释倍数为：1.0×10^-3、1.0×10^-4、1.0×10^-5、1.0×10^-6和1.0×10^-7。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1引物设计

根据NCBI登陆的PRRSV基因的三个亚型序列(猪蓝耳病毒经典毒株(EF536003)、高致病性变异株(EF112445)和NADC-30毒株(JN654459))，应用Primer5.0软件设计针对PRRSV的Nsp2基因使用可以区分猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异株和NADC-30毒株的特异性引物，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

上游引物(Nsp2F引物)：GACACCTCCTTTGATTGG，SEQ ID NO:1；

下游引物(Nsp2R引物)：GAGAGGAIGCAGACAAATC(其中I代表T或C或A或G)，SEQ IDNO:2；

使用上述引物RT-PCR扩增，可以通过琼脂糖凝胶电泳条带的大小对PRRSV的三种亚型进行快捷的鉴别区分，特异性和灵敏度高，操作简単。

实施例2检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法

该方法包括以下步骤：

(1)待检样品RNA提取：

待检血液样品经过8000g离心5分钟，取上层血清各用；组织器官样品需要以1:5的质量体积比与灭菌双蒸水混合，研磨后8000g离心5分钟，取上清液备用。

(2)提取的RNA加入到购自宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA模板：

反转录步骤为：将RNA模板4μL与1号5×PrimeScript Buffer 4μL、2号PrimeScriptRT Enzyme Mix 1μL、4号Random 6mers 2μL和5号RNase Free dH₂O 9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。其反应条件：37℃15min，85℃15s，16℃10min。此反转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

(3)RT-PCR步骤

PCR按20μL反应体系：模板cDNA 3μL，Quick Taq HS DyeMix 10μL，上下游引物各0.6μL，余下的由ddH₂O补足。Nsp2F/R引物反应条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸8min。得到的PCR产物取5μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行观察。

(4)检测结果：扩增产物大小为887bp(SEQ ID NO:3)，则样本中含有或候选含有经典毒株的猪蓝耳病毒；扩增产物大小为797bp(SEQ ID NO:4)，则样本中含有或候选含有高致病性变异毒株的猪蓝耳病毒；扩增产物大小为493bp(SEQ ID NO:5)，则样本中含有或候选含有NADC-30毒株的猪蓝耳病毒。

实施例3退火温度和引物浓度的优化以及灵敏度的测定

(1)克隆转化和重组阳性质粒：RT-PCR扩增出目的基因，进行电泳观测分析。电泳筛选出来的阳性样本用购自OMGA公司PCR纯化试剂盒进行PCR产物纯化，将纯化的PCR产物与TMD-19T载体连接，放入金属浴12h后取出。得到的连接产物加入感受态细胞(大肠杆菌DH5α株)后液体加入1mL LB液体中，放入37℃摇菌箱，然后5000r/min 4min离心，弃800μL上清液，剩下200μL吹打混匀。吸取菌液滴于LB+AMP的培养基，并用涂布棒把菌液均匀的分布在培养基上，放37℃细菌培养箱12h～16h。挑取单菌落溶于10μL灭菌水中混匀，取2μL菌液为PCR模板跑电泳。挑取亮条带的菌液加到4mL LB+AMP液体中摇菌12h。用OMGA公司的质粒提取试剂盒对已摇好的菌液进行质粒的提取，得到的质粒即阳性模板放-20℃保存。

(2)退火温度的优化：Nsp2F/R引物反应条件中的退火温度设置55℃-65℃，得到的PCR产物取5μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行观察。选取最亮条带的温度为最佳退火温度，如图1所示，本发明的最佳退火温度为55℃。

(3)引物浓度的优化：PCR按20μL反应体系，上下游引物各0.2μL-1μL。选取最亮条带的引物浓度为最佳引物浓度，如图2所示，最佳引物浓度为0.6μL。

(4)将上述制备得到的阳性模板用无菌水做10倍连续稀释：10^-1-10^-7，取1.0×10^-3、1.0×10^-4、1.0×10^-5、1.0×10^-6和1.0×10^-7稀释的质粒，按以上最优的RT-PCR反应体系和反应条件进行扩增，得到的PCR产物取5μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行观察，检测其最低浓度见如图3所示，所建立的RT-PCR反应最低检测量分别为：经典毒株-1.13×10⁴拷贝数/反应、高致病性变异毒株-9.47×10³拷贝数/反应、NADC-30毒株-2.30×10⁴拷贝数/反应，表明灵敏性良好。

对比例1

根据已报的国家标准GBT27517-2011鉴别猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病性与经典毒株复合RT-PCR方法，合成国家标准中的引物，利用该方法对200份疑似患有PRRSV的核酸样本进行检测：用TriZol法提取待测血清的RNA，得到RNA用ddH₂O溶解后放-20℃冰箱保存。用购自宝上海乔羽生物科技有限公司有限公司的反转录试剂盒对提取的RNA进行RT-PCR扩增，反应体系为20μL：其中每管加入10μL RNA，M-MLV 5×Reaction Buffer 4μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，M-MLV 0.5μL，RNA酶抑制剂提0.5μL，复合PCR共用反转录引物(5’-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTG-3’，如SEQ ID NO:8所示)1μL。放入PCR仪中37℃1h，70℃15min后直接用于下面的PCR扩增；复合PCR反应体系成分：cDAN 4μL，10×PCR缓冲液2.5μL，2.5mmol/L dNTPs 2μL，上游引物(5’-GGTTCGGAAGAAACTGTCGG-3’，如SEQ ID NO:6所示)0.5μL，上游引物(5’-AGCAGGTGGAAGAAGCGAATC-3’，如SEQ ID NO:7所示)0.5μL，下游引物(5’-GAGCTGAGTATTTTGGGCGTG-3’，如SEQ ID NO:8所示)1μL，复合PCR共用反转录引物1μL。其中试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司。反应程序如下：94℃45s，59℃45s，70℃45s，共35个循环；70℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，检出率48.5％，其中经典毒株检测率为9％(18/200)、高致病性变异毒株检出率为29.5％(59/200)。

本发明建立的方法对200份疑似患有PRRSV的核酸样本进行RT-PCR检测，检出率为46.5％(93/200)，其中经典毒株检测率为8.5％(17/200)、高致病性变异毒株检出率为28.5％(57/200)和NADC-30毒株检出率为9.5％(19/200)；本发明方法与该方法的符合率为95.9％。

对比例2购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司猪繁殖与呼吸综合征病毒RT－PCR诊断试剂盒(通用型)

将血清样本和阴阳性对照各100μL置于1.5mL灭菌离心管中，分别加入裂解液600μL混匀后室温静置3～5min。将液体吸入套有收集管的吸附柱中，13000rmp离心30s，弃去收集管中液体，向吸附柱中加入600μL洗涤液，13000rmp离心30s，弃去收集管中液体(重复两次)。再空柱离心13000rmp离心30s，将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，加入25μL洗脱液，室温静置1min，13000rmp离心30s获得总RNA。RT-PCR反应体系：总体积20μL，16.8μL RT-PCR反应液，1.2μL酶混合液，2μL模板RNA。在PCR扩增仪器上进行一下程序：42℃45min,94℃3min；扩增条件：94℃30s,55℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸7min。2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR诊断试剂盒(通用型)检测的经典毒株检出率为50.5％(101/200)，与本发明方法结果符合率达到92.1％。

对比例3猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒

该试剂盒的实验步骤同对比例2。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Nsp2 1594～1680变异株)RT-PCR检测试剂盒检测的高致病性变异毒株检出率为28％(56/200)，与本发明方法结果符合率达到98.2％。

从对比例1-3可以得出：说明本发明具有较高的可靠性，特异性好、灵敏性高，克服了对三种毒株进行分别检测所带来的耗时、耗试剂、增加污染概率的风险，与试剂盒相比，本发明对PRRSV的诊断和防治具有更加直接和有效的意义。

实施例4应用例

从四川绵阳、广元、北川和德阳等地采集疑似患有蓝耳病的仔猪的肺脏、腹股沟淋巴结和血清等样本150份，提取样本中RNA和反转录成cDNA。按照本发明报告的RT-PCR方法扩增体系和扩增条件对蓝耳病经典毒株、高致病性变异毒株、NADC-30毒株进行检测，并设立阴阳性对照，取PCR产物5μL在1.5％琼脂糖凝胶电泳中进行电泳后判定结果：PRRSV检出率为37.3％(56/150)，其中PRRSV经典毒株阳性率为8％(12/150)；PRRSV高致病性变异毒株阳性率为16.7(25/150)％；PRRSV NADC30毒株阳性率为12.6％(19/150)。经与对比例1-3的三种已报道的方法，合成国家标准中的引物(GBT27517-2011)和购买试剂盒(购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)检测这三种PRRSV毒株的PCR检测结果进行比较分析符合率为91.6～100％(如表1)。

表1本发明方法与已报道方法对临床病料检测结果比较

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南民族大学

<120> 检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法

<130> 2017

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacacctcct ttgattgg 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagaggatgc agacaaatc 19

<210> 3

<211> 886

<212> DNA

<213> PRRSV基因

<400> 3

gacacctcct ttgattggaa tgttgtgctt cctggggttg aggcggcgaa tcagacaacc 60

aaacagctcc acgtcaacca gtgccgcgct ctggctcctg tcgtgactca agagcctttg 120

gacaaagact cggtccctct gaccgccttc tcgctgtcca attgctatta ccctgcacaa 180

ggtgacgagg ttcgtcaccg tgagaggtta aattccgtac tctctaagtt ggagggggtt 240

gttctagaag aatatgggct catgtccact ggacttggcc cgcgacccgt actgccgagc 300

gggctcgacg agcttaaaga ccagatggag gaggatctgc tagaactagc caacacccag 360

gcgacttcag aaatgatggc ctgggcggcc gagcaggttg atttaaaagc ttgggtcaaa 420

agctacccac ggtggacacc accaccccct ccaccaagag ttcaacctcg aaaaacgaag 480

cctgtcaaga gcttgccaga gaacaagcct gtccccgctc cgcgcaggaa ggttagatcc 540

gactgtggca gcccgatttt aatgggcgac aatgtcccta acggttggga agatttgact 600

gtcggtggtc cccttgattt tccgacacca tccgagccga tgacacctct gagtgagcct 660

gtgcttatgc ccgcgtcgca acatatttct aggccagtga cacctttgag tgggccggcc 720

ccagttcctg caccgcgtag aactgtgtcc cgaccgatga cgcccttgag tgagccaatt 780

tttgtgtctg caccgcgaca caaatttcag caggtggaag aagcgaatcc ggcggcaaca 840

acgctgacgt atcaggacga gcctctagat ttgtctgcct cctctc 886

<210> 4

<211> 796

<212> DNA

<213> PRRSV基因

<400> 4

gacacctcct ttgattggga cgttgtgttt cctggggttg aggcggcaaa tcagaccgcc 60

gaacaacctc acgccaactc atgctgtacc ctagtccctc ccgtgactca agagcctctg 120

ggcaaggact cggtccctct gaccgccttc tcactgtcca atcgctatta ccctgcacaa 180

ggcgacgagg ttcatcaccg tgagaggcta aattctgtac tctctaagtt ggaagaggtt 240

gtcctggaag aatatgggtt catgcccact ggatttggcc cgcgacctgt gctgccgagc 300

gggctcgacg agcttaaaga ccggatggag gaggatctgc taaaactagc caacacccag 360

gcgacttcag aaatgatggc cagggcggcc gagcaggtcg atttaaaaac ttgggttaaa 420

agctacccgc ggtggacacc accacccctt ccaccaagag ttcaacctcg aagaacaaag 480

tctgcaaaaa gcttgccaga gggcaagcct gtcccagctc cgcgtaggaa ggtcagatcc 540

gactgcggca gtcctgcctg gatgggcaac aatgtgccta acagttcgga agaaactgtc 600

ggcgaacccc ccaattttcc gacaccagcc gagctgatga cacctgttgg tgagcccgta 660

cttgtgcctg cgttgcaaca tgtccccaag ctaatgacac ctttgagtgg gtcggcacca 720

gttcctgcac cgcgtagaac tgttacaaca acgctgacgc accaggacga gcctctggat 780

ttgtctgcct cctctc 796

<210> 5

<211> 493

<212> DNA

<213> PRRSV基因

<400> 5

gacacctcct ttgattggga tttcgtgctg cctggagttg gagtggctgc tcaagcagcg 60

gaattgcccc ccatcagcca gtgtcacgct cctgtcaccg ttgtagccca aaggtcttcg 120

ccggaattcc agtctcggaa agcggagtct gtcaggagcc ttccagagaa caggcctctt 180

cctgccccac gcaggaagat caggtccagg tgtggtagtt tggtttcatt gggcggcaac 240

ttccctgaca gctgggtaga cttggtcggt ggttccttcc attccccagt cctgcctgag 300

tcagtggcac gttcgaatga gcctgtgcct gtcccggcgc cacgcaggat tgtgccccgg 360

ctgaagccgt caccaataac accaactcct gtgcccgcgc cacgatctgg gcttcagcag 420

gtgggaggaa tgaacttagc ggtagggact ctggcgtgcc aggacgagct cctcgatttg 480

tctgcctcct ctc 493

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggttcggaag aaactgtcgg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agcaggtgga agaagcgaat c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gagctgagta ttttgggcgt g 21

Claims (6)

1.一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的引物，用于RT-PCR反应，其特征在于，该引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

2.一种检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

以待检测样品的RNA为模板，反转录得到cDNA，用权利要求1中所述的引物，对待测样本进行RT-PCR扩增，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物；扩增产物大小为887bp，则样本中含有或候选含有猪蓝耳病毒经典毒株；扩增产物大小为797bp，则样本中含有或候选含有高致病性变异毒株；扩增产物大小为493bp，则样本中含有或候选含有NADC-30毒株。

3.根据权利要求2所述的检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法，其特征在于，用购自宝生物工程(大连)有限公司的反转录试剂盒进行反转录，所述反转录的步骤为：将RNA模板4μL与1号5×Prime Script Buffer 4μL、2号PrimeScriptRT Enzyme Mix 1μL、4号Random 6mers 2μL和5号RNase Free dH₂O 9μL混匀，放入PCR仪上进行反转录。

4.根据权利要求2所述的检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法，其特征在于，所述反转录的反应条件为：37℃15min，85℃15s，16℃10min。

5.根据权利要求2所述的检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增的反应体系如下：模板cDNA 3μL，Quick TaqHS DyeMix 10μL，上游引物和下游引物各0.6μL，余下的由ddH₂O补足，总量为20μL。

6.根据权利要求2所述的检测猪蓝耳病毒经典毒株、高致病性变异毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法，其特征在于，所述RT-PCR扩增的反应体系条件如下：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸8min。