CN107502679A

CN107502679A - 鉴别prrsv毒株基因亚型的lamp引物及鉴别方法和应用

Info

Publication number: CN107502679A
Application number: CN201710861384.XA
Authority: CN
Inventors: 姜平; 张日腾; 白娟; 张乔亚
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2017-09-21
Publication date: 2017-12-22

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及一种鉴别PRRSV毒株基因亚型的引物，见序列表中序列15‑31。PRRSV毒株基因亚型的鉴别方法，对待测样本分别使用引物进行扩增，根据结果判断是否为相应毒株。可以快速检测PRRSV并进行基因亚型分型，在PRRSV早期诊断中能较好的区分不同基因亚型毒株，灵敏快速，有较好的应用前景。

Description

鉴别PRRSV毒株基因亚型的LAMP引物及鉴别方法和应用

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及一种鉴别PRRSV毒株基因亚型的LAMP引物，还涉及PRRSV毒株基因亚型的鉴别方法及其应用。

背景技术

自从我国首次报道PRRS至今，该病历经各种变异和流行，已成为当前养猪业危害最为严重的传染病之一。因此开展PRRSV分子流行病学研究，明晰不同亚型毒株间的遗传演化关系，对PRRS流行预警、临床诊断和新型疫苗的研发等十分关键。当前，PRRSV诊断学方法主要包括常规PCR、荧光定量PCR、ELISA、免疫荧光试验等，但上述方法存在成本高、操作设备要求特殊等局限，难以在基层实际生产中普及应用。

LAMP技术是近些年发展起来的核酸快速扩增技术，在病原微生物检测上具有灵敏度高，成本低等优势，逐渐受到了人们的关注。该技术本身也在改进和提高，并与其他技术如横向流动试纸条法(LFD)、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)等合并应用，具有良好的发展前景。

关于PRRSV的RT-LAMP检测方法国内外已有不少报道。针对靶基因的选择主要有ORF1a、ORF7等。但上述方法只能对PRRSV病原进行检测，无法区分毒株亚型，不能较好的满足当前疾病诊断的需要。目前尚未有关于区分PRRSV经典、HP和类NADC3毒株RT-LAMP鉴别诊断方法的报道。

发明内容

为了解决以上现有技术中没有PRRSV经典、HP和类NADC3毒株LAMP鉴别方法的问题，本申请提供了一种鉴别PRRSV毒株基因亚型的LAMP引物。

本申请还提供了PRRSV毒株基因亚型的LAMP鉴别方法。

并且本申请提供了鉴别PRRSV毒株基因亚型的LAMP引物、PRRSV毒株基因亚型的LAMP鉴别方法的应用。

本发明是通过以下步骤得到的：

鉴别PRRSV毒株基因亚型的引物，

经典毒株扩增引物LAMP1包括如下序列：

F3：5’-ACCGCAATGCATCTTCAGG-3’,(见序列表中序列15)

B3：5’-GTCTGTGAGGAAGCAGACAA-3’,(见序列表中序列16)

FIP：5’-TCGGCTCACTCAAGGGTGTCA-AGTGAGCCGGCTCCAATT-3’,(见序列表中序列17)

BIP：5’-GCACCGCGGCGTAAGTTTCA-GTTCTGGTACGGTGGGATTG-3’,(见序列表中序列18)

LB：5’-GCAGGTGAAAAGATTGAGTTCGGC-3’；(见序列表中序列19)

高致病性毒株扩增引物LAMP2包括如下序列：

F3：5’-TTGAGGCGGCGAATCAGA-3’,(见序列表中序列20)

B3：5’-CCAGGACAACCTCTTCCAAC-3’,(见序列表中序列21)

FIP：5’-CCTTGCCCAAAGGCTCTTGAGT-AACCGGACAACCTCACGT-3’,(见序列表中序列22)

BIP：5’-TGACCGCCTTCTCACTGTCCA-CCTCTCACGGTGATGAACCT-3’,(见序列表中序列23)

LF：5’-CAGGGTGCAGCATGAGTTG-3’,(见序列表中序列24)

LB：5’-TGCTATTACCCTGCACAAGGTG-3’,(见序列表中序列25)

类NADC30毒株扩增引物LAMP3包括如下序列：

F3：5’-TTGTGCTTCCTGGGGTTG-3’,(见序列表中序列26)

B3：5’-AACTACCACACCTGGACCT-3’,(见序列表中序列27)

FIP：5’-GCCATGACAGAAACTGGAGCGT-GAGGCTGCTCAAGCAACG-3’,(见序列表中序列28)

BIP：5’-AAGCGGAGTCTGTCAGGAGCC-GATCTTTCTGCGTGGGGC-3’,(见序列表中序列29)

LF：5’-TGGTTGATAGGGGGCAGTTC-3’,(见序列表中序列30)

LB：5’-TCCAGAGAGCAGGCCTCT-3’。(见序列表中序列31)

上述引物在鉴别PRRSV毒株基因亚型中的应用。

一种PRRSV毒株基因亚型的LAMP鉴别方法，对待测样本分别使用权利要求1中的LAMP1、LAMP2和LAMP3引物进行扩增，若LAMP1检测结果为阳性，LAMP2和LAMP3检测结果为阴性，则判断待测样本是PRRSV经典毒株；若LAMP2检测结果为阳性，LAMP1和LAMP3检测结果为无扩增，则判断待测样本是PRRSV高致病性毒株；若LAMP3检测结果为阳性，LAMP1和LAMP2检测结果为阴性，则判断待测样本是PRRSV类NADC30毒株。

鉴别检测PRRSV时，先对待测样本进行PRRSV LAMP广谱扩增检测，如为阳性，证明有PRRSV感染，再分别进行LAMP1、LAMP2和LAMP3扩增。如果LAMP扩增为阴性，证明无PRRSV感染，则不再进行LAMP1、LAMP2和LAMP3鉴别扩增。

所述的鉴别方法，优选进行PRRSV LAMP广谱扩增检测中使用的引物序列如下：

F3：5’-AGAAAAACCCGGAGAAGCC-3’,(见序列表中序列7)

B3：5’-TGCTGAGGGTGATGCTGT-3’,(见序列表中序列8)

FIP：5’-ACAATTGCCGCTCACTAGGGG-CCATTTCCCTCTTGCGACT-3’,(见序列表中序列9)

BIP：5’-CGCTGGAACTTGTGCCCTGT-GCACAGTATGTTGCGTAGGC-3’,(见序列表中序列10)

LF：5’-GTGATGCCTGACGTCATCTTC-3’,(见序列表中序列11)

LB：5’-GGGAGGATAAGTTACACTGTGGA-3’。(见序列表中序列12)

所述的鉴别方法，25μL扩增反应体系如下：10×Thermopol Buffer 2.5μL，10mmol·L^-1的dNTP 3.5μL，100mmol·L^-1的MgSO₄ 1.5μL，甜菜碱3.0μL，4μmol/L的外引物F3/B3各1μL，40μmol/L的内引物FIP/BIP各为1μL，10μmol/L的环引物LF/LB各1μL，8000U/mL的Bst DNA聚合酶1.0μL，灭菌ddH₂O 5.5μL，反转录酶0.5μL，模板cDNA 1.5μL。

所述的鉴别方法，扩增条件62℃条件下反应35min。

本研究根据PRRSV ORF7基因保守区域序列，设计特异性引物，通过反应条件优化，建立了PRRSV反转录LAMP(Loop-mediated isothermal amplification)检测方法。根据不同亚型毒株Nsp2基因的缺失特性，分别设计三套引物，建立了可鉴别PRRSV经典、高致病性和类NADC30毒株的反转录RT-LAMP检测方法。该反应简便快速，62°条件下扩增35min，通过琼脂糖凝胶电泳或染料显色法判定结果。针对PRRSV、经典型PRRSV、HP-PRRSV和类NADC30毒株的最低病毒检测量分别为100.5、100.4、101.0and 102.5TCID50/mL，与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪流行性腹泻等病原均无交叉反应。引物设计均具备良好的特异性，与Real Time PCR检测灵敏性基本一致。反应可在35min内完成，既达到了快速检测的目的，又解决了不同变异株在传统PCR检测中相互干扰的难题。49份PRRSV阳性样品的诊断报告中，PRRSV经典毒株阳性率为14.3％，PRRSV高致病毒株阳性率为47.1％，类NADC30毒株阳性率为28.6％。部分样品测序后经进化树比对分析与RT-LAMP鉴别诊断的结论一致，这进一步确定了本试验检测结果的可靠性。本次临床样品的鉴定结果显示：当前，PRRSV在我国的流行趋势仍然以高致病性毒株为主，经典毒株在各地也占有一定比例，而类NADC30样毒株流行则逐渐呈上升趋势。随着LAMP技术的进一步发展和验证，相信这种方法的重要性会持续被揭示。

本发明的有益效果：

1)本研究建立的RT-LAMP方法操作相对简便，临床样品检测结果显示，该方法与传统的RT-PCR检测结果有较高的符合率，该方法具有较好应用前景；

2)本研究在引物设计时考虑了引物的二级结构，保证所建立的LAMP方法特异性好。反应速度上，通过在管盖中央加染料，35min内即可完成扩增，既节约时间，又有效的避免了开盖气溶胶污染问题。该方法具有较高灵敏性，LAMP能检测到TCID₅₀为10^0.5的病毒液，比常规RT-PCR方法敏感度高一个数量级。但也由于LAMP技术具有极高的灵敏度，为了防止检测过程中出现假阳性问题，LAMP检测环境需要严格分区，操作规范；

3)该方法设计筛选出四套PCR引物，建立了四管两步RT-LAMP检测方法，可以快速检测PRRSV并进行基因亚型分型，在PRRSV早期诊断中能较好的区分不同基因亚型毒株，灵敏快速，有较好的应用前景。

附图说明

图1为两组引物LAMP方法检测不同PRRSV毒株的比较，A:引物1；B:引物2。M:DNA分子质量标准；1-6:BB0907,S1,ZJ1405,GD1404,FJ1402和NT08017毒株；7:阴性对照，

图2为LAMP反应体系和条件优化，A:dNTP浓度优化；B:Mg2+优化；C:甜菜碱优化；D:内外引物浓度比优化；E:温度优化；F:时间优化，

图3为LAMP特异性试验结果，A:不同病原检测结果。M:DNA分子质量标准；1-7:PRRSV,PEDV,CSFV,PCV2,PRV,副猪嗜血杆菌,阴性对照。B:RT-LAMP反应产物内切酶鉴定结果。M:DNA分子质量标准；1-3:酶切产物,RT-LAMP产物,阴性对照，

图4为LAMP反应灵敏性试验，A:LAMP电泳结果；B:RT-PCR；C:荧光定量PCR；D:LAMP-SYBR GreenⅠ显色。M:DNA分子质量标准；1-7:104.5TCID50/mL-100.05TCID50/mL；8:阴性对照，

图5为RT-LAMP鉴别检测方法特异性试验，A:琼脂糖凝胶电泳检测结果；B:SYBRGreen I显色结果。M:DNA分子质量标准；1-9:FJ1402株,R98株,S1株,ZJ1405株,GD1404株,BB0907株,CSFV,PCV2,PRV；NC:阴性对照，

图6为RT-LAMP鉴别检测方法灵敏性试验，A:RT-LAMP电泳结果；B:SYBR GreenⅠ显色；C:荧光定量PCR；M:DNA分子质量标准；LAMP1:105.4TCID50/mL-100.04TCID50/mL；LAMP2:105.0TCID50/mL-100.00TCID50/mL；LAMP 3:105.5TCID50/mL-100.05TCID50/mL；NC:阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

1.1毒株与试剂

PRRSV：高致病性毒株BB0907、经典毒株S1、类NADC30毒株FJ1402、HP-PRRSV和经典毒株的重组毒株NT0801、高致病性毒株重组毒株GD1404、流行毒株ZJ1405等，均由本实验室分离鉴定并保存。

其它病原：猪圆环病毒2型(PCV2)SH毒株、猪伪狂犬病毒(PRV)ZJ01毒株、猪瘟病毒(CSFV)C株、猪流行性腹泻病毒(PEDV)NJ01毒株、副猪嗜血杆菌等，均由本实验室分离或保存。

甜菜碱(Betaine)购自Sigma公司；Bst DNA聚合酶大片段、硫酸镁(MgS0₄)和10×Thermopol Buffer购自NEB公司；核酸染料SYBR GreenI购自Invitrogen公司；HNB购自源叶生物有限公司；Hae Ⅱ内切酶购自Takara公司产品。

1.2LAMP引物设计与合成

根据GenBank上已发表的PRRSV S1和BB0907两种毒株ORF7基因保守序列，运用在线生物软件(https://primere explorer.jp/)设计2组特异性引物，每组引物分别包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环引物Loop F和Loop B，以上引物以及RT-PCR引物均由Invitrogen公司合成(见表1)。

表1引物序列

1.3病毒核酸提取及模板制备

采用TRIZOL试剂说明书方法提取PRRSV、PEDV及CSFV病毒核酸，并进行反转录制备cDNA作为模板，PCV2和PRV核酸提取按照DNA提取试剂盒说明书进行抽提，反应产物置-20℃保存。

1.4LAMP反应体系的建立及引物筛选

25μL反应体系如下：10×Thermopol Buffer 2.5μL，MgSO₄(100mmol·L^-1)1.5μL，dNTP(10mmol·L^-1)3.5μL，内引物FIP/BIP(40μmol/L)各为1μL，外引物F3/B3(5μmol/L)各1μL，环引物LF/LB(10μmol/L)各为1μL，Bst DNA聚合酶(8000U/mL)1.5μL，甜菜碱(Betaine)2.0μL，灭菌ddH₂O 6.0μL，AMV反转录酶0.5μL,模板cDNA 1.5μL。

采用两组引物分别检测PRRSV S1、BB0907、ZJ1405、GD1404、FJ1402和NT0801等6个毒株进行检测，图1中电泳结果显示，B组引物LAMP方法扩增效率更高(见图1中B)。

1.5LAMP反应条件及体系优化

反应体系优化：dNTP浓度按照(4、6、8、10、12、14mM)；Mg²⁺浓度按照(120mM、100mM、80mM、60mM和40mM)；甜菜碱浓度按照(0μL、1.0μL、2.0μL、3.0μL、4.0μL)；内、外引物浓度比按(40μM:4μM、40:5、36:6、32:8)分别进行LAMP反应。筛选最佳体系浓度。

反应条件优化：温度设置(59、62、65和68℃)、反应时间设置(25、30、35、40和50min)，结束后取5μL反应产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，根据条带扩增效果确定最佳反应条件。

根据图2中的优化结果，确定优化后的反应体系(25μL)确定为：10×ThermopolBuffer2.5μL，dNTP(10mmol·L^-1)3.5μL，MgSO₄(100mmol·L^-1)1.5μL，甜菜碱(Betaine)3.0μL，外引物F3/B3(4μmol/L)各1μL，内引物FIP/BIP(40μmol/L)各为1μL，环引物LF/LB(10μmol/L)各为1μL，Bst DNA聚合酶(8000U/mL)1.0μL，灭菌ddH₂O 5.5μL，反转录酶0.5μL，模板cDNA 1.5μL。最佳反应温度为62℃，最短反应时间为35min。

LAMP反应过程中，dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生焦磷酸镁白色沉淀。SYBR Green I则通过结合到双链DNA的小沟产生绿色荧光，而阴性呈现黄色。HNB为一种金属离子指示剂，Mg²⁺与HNB结合使得反应体系初始颜色为紫色，随反应进行，Mg² ⁺与析出的焦磷酸根反应，使得体系颜色变为蓝色。三种反应结果比较，SYBR GreenⅠ显色效果更好。

1.6特异性试验

非特异病原测定：采用猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒和猪流行性腹泻病毒，提取病毒基因组作为模板进行LAMP扩增，验证反应体系的特异性。

LAMP产物酶切鉴定：用Olige软件分析LAMP目的片段中的酶切位点，选择单一酶切位点的Hae II(识别GCGC)，LAMP目的片段酶切产物约214bp和120bp。20μL酶切反应体系包括：Hae II 1.5μL，LAMP产物1μL，10×Buffer 2μL，15.5μL ddH₂O。最后37℃反应2h，取15μL的酶切产物在1.5％琼脂糖凝胶进行鉴定。

除PRRSV阳性样品经LAMP扩增可见梯形条带，其他病原检测均未见条带(见图3中A)，说明该方法具有良好的特异性。

将LAMP产物经Hae II酶切过夜后，取15μL于1.5％琼脂糖凝胶上电泳，分别在大约214bp和120bp处产生新条带，与预期计算结果相符，证明扩增正确(见图3中B)。

1.7敏感性试验

取10^4.5TCID₅₀/mL PRRSV病毒液，10倍倍比稀释后提取RNA，用LAMP、RT-PCR以及Real-time PCR方法同步检测，确定其敏感性。

结果见图4。LAMP可检测到PRRSV的最低病毒含量为10^0.5TCID₅₀/mL，比常规RT-PCR方法敏感度高一个数量级，与Real-Time PCR检测敏感性基本一致。

1.8RT-PCR检测PRRSV

按M Gao等方法进行。将上述提取的RNA样品反转录制得cDNA模板。PCR反应程序为(25μL反应体系)：95℃5min，95℃30s，56℃30s，72℃45s，进行35个循环；72℃5min。PCR产物经1.5％脂糖凝胶电泳观察。

1.9Real-time PCR检测PRRSV

按Martíne z等方法进行。根据猪PRRSV ORF7基因序列设计实时荧光定量PCR引物。反应体系是：cDNA 2μL，2×Power SYBR Green PCR Master Mix 10μL，引物F/R400nmol/L，Rox Reference Dye0.4μL，双蒸水补齐至20μL。反应程序为：预变性95℃5min；95℃10s；60℃31s，循环数为40。

1.10临床样品检测

用所建立的PRRSV LAMP方法和普通RT-PCR方法同时对来自不同猪场110份临床样品进行检测，分析两种检测结果的符合率。

用所建立的LAMP方法与常规RT-PCR对110份临床样品进行检测，结果见表2。LAMP的阳性检出率为60.0％(66/110)，常规RT-PCR的阳性检出率为50.9％(56/110)，二者检测符合率为85.5％。相对常规RT-PCR，LAMP敏感性和特异性更高。

表2LAMP与RT-PCR检测临床样品PRRSV结果的比较

实施例2

1材料和方法

1.1材料

PRRSV：经典毒株S1和R98、高致病性毒株BB0907、高致病性毒株重组毒株GD1404、流行毒株ZJ1405、类NADC30毒株FJ1402等，均由本实验室分离鉴定并保存。其它病原：猪圆环病毒2型(PCV2)SH毒株、猪伪狂犬病毒(PRV)ZJ01毒株、猪瘟病毒(CSFV)C株等，均由本实验室分离或保存。

甜菜碱(Betaine)购自Sigma公司；Bst DNA聚合酶大片段、10×Thermopol Buffer和硫酸镁(MgSO4)购自NEB公司；核酸染料SYBR GreenI购自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1LAMP引物设计与合成

参考GenBank上已登录的S1株(DQ459471.1)、BB0907株(HQ315835.1)和FJ1402株(KX169191.1)基因序列，运用在线生物软件(https://primere explorer.jp/)，针对Nsp2基因变异特点，设计了3套特异性引物。LAMP1扩增区域为经典毒株S1的1429-1749位碱基(高致病性毒株和类NADC30毒株该区域存在缺失)。LAMP2根据高致病性毒株BB0907设计引物，扩增区域为Nsp2基因909-1120位碱基(该区域与经典毒株相比基因变异大且类NADC30毒株存在基因缺失)。LAMP3扩增序列为类NADC30毒株FJ1402的879-1305位碱基(该区域与其它亚型毒株相比基因变异较大)。引物包括外引物F3和B3、内引物FIP和BIP以及环引物Loop F和Loop B，由Invitrogen公司合成(表3)。

表3LAMP鉴别检测方法引物序列

1.2.2病毒核酸的提取及模板制备

采用TRIZOL试剂说明书方法提取PRRSV及CSFV病毒核酸，并进行反转录制备cDNA作为模板，PCV和PRV核酸提取按照DNA提取试剂盒说明书进行抽提，产物置-20℃保存备用。

1.2.3LAMP鉴别检测方法的反应体系

25μL反应体系如下：10×Thermopol Buffer 2.5μL，dNTP(10mmol·L^-1)3.5μL，MgSO₄(100mmol·L^-1)1.5μL，甜菜碱(Betaine)3.0μL，外引物F3/B3(4μmol/L)各1μL，内引物FIP/BIP(40μmol/L)各为1μL，环引物LF/LB(10μmol/L)各为1μL，Bst DNA聚合酶(8000U/mL)1.0μL，灭菌ddH₂O 5.5μL，反转录酶0.5μL，模板cDNA 1.5μL。62℃条件下反应35min。

四管两步RT-LAMP检测方法的操作步骤：第一步(1管)：通过实施例1给出的检测方案对样本进行PRRSV LAMP广谱检测，若结果为阴性，证明无PRRSV感染；若结果为阳性，则证明是PRRSV感染。第二步(3管)：对第一步检测结果为阳性的样本分别进行LAMP1、LAMP2和LAMP3，对PRRSV阳性样品分型鉴定，若LAMP1检测为阳性，LAMP2、LAMP3检测为阴性，则判断是PRRSV经典毒株；若LAMP2检测为阳性，LAMP1、LAMP3检测为阴性，则判断是PRRSV高致病性毒株；若LAMP3检测为阳性，LAMP1、LAMP2检测为阴性，则判断是PRRSV类NADC30毒株。

另外一种操作步骤为对待测样本使用扩增引物LAMP1、LAMP2和LAMP3进行扩增，若LAMP1检测结果为阳性，则判断待测样本是PRRSV经典毒株；若LAMP2检测结果为阳性，则判断待测样本是PRRSV高致病性毒株；若LAMP3检测结果为阳性，则判断待测样本是PRRSV类NADC30毒株。

1.2.4LAMP鉴别检测方法特异性试验

分别以PRRSV S1株、R98株、BB0907株、ZJ1405株、GD1404株、FJ1402株以及猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒等提取的基因组为模板进行RT-LAMP扩增，验证反应体系的特异性。

LAMP鉴别检测方法特异性结果显示：LAMP1能够成功鉴别出经典毒株S1和R98，LAMP2能够鉴别出HP-PRRSV毒株GD1404、BB0907以及ZJ1405，LAMP3能够鉴别出类NADC30毒株FJ1402，不同PRRSV基因亚型之间以及与其他病原未发生交叉反应(图5)。

1.2.5LAMP鉴别检测方法敏感性试验

将PRRSV S1株(10^5.4TCID₅₀/mL)、BB0907株(10^5.0TCID₅₀/mL)和FJ1402株(10^5.5TCID₅₀/mL)的病毒液进行10倍倍比稀释后提取RNA，进行RT-LAMP和Real-time PCR方法的同步扩增，检测其敏感性。

Real-time PCR反应体系按Martíne z等方法进行：cDNA 2μL，2×Power SYBRGreen PCR Master Mix 10μL，引物F/R 400nmol/L，Rox Reference Dye 0.4μL，双蒸水补齐至20μL。反应程序为：预变性95℃5min；95℃10s；60℃31s，循环数为40。

PRRSV RT-LAMP鉴别诊断方法检测到的S1株、BB0907株和FJ1402株最低病毒含量分别为10^0.4，10^1.0和10^2.5TCID₅₀/mL。相对而言，LAMP1方法敏感性最高，LAMP2和LAMP3次之。以上三种方法与Real-Time PCR检测敏感性基本一致(图6)。

1.2.6临床样品检测

用所建立的区分PRRSV经典、HP和类NADC30毒株的RT-LAMP鉴别检测方法，对来自不同猪场49份临床样品进行检测，分析PRRSV不同基因亚型毒株的流行监测信息。

49份PRRSV阳性样品检测结果显示(表4)：经典毒株检出率为14.3％(7/49)，高致病性毒株的检出率为47.1％(23/49)，类NADC30毒株的检出率为28.6％(14/49)。从鉴定为经典、高致和类NADC30毒株样品中随机抽样进行测序，进化树比对分析与RT-LAMP结果一致。

表4RT-LAMP临床样品检测

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

<110>南京农业大学

<120>鉴别PRRSV毒株基因亚型的LAMP引物及鉴别方法和应用

<160>31

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

GATGGCCAGC CAGTCAAT 18

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

GCCTTGATTA AAGGCGGTCT 20

<210>3

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

CTTTCCCGGT CCCTTGCCTC GTGCCAGATG CTGGGTAAG 39

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

AACCCGGAGA AGCCCCATTT TACACAATTG CCGCTCACTA G 41

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

CTGGTTTTGC TGAGCGATGA T 21

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

CTAGCGACTG AAGATGATGT CAG 23

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>7

AGAAAAACCC GGAGAAGCC 19

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>8

TGCTGAGGGT GATGCTGT 18

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成

<400>9

ACAATTGCCG CTCACTAGGG GCCATTTCCC TCTTGCGACT 40

<210>10

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

CGCTGGAACT TGTGCCCTGT GCACAGTATG TTGCGTAGGC 40

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>11

GTGATGCCTG ACGTCATCTT C 21

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>12

GGGAGGATAA GTTACACTGT GGA 23

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>13

ATGGCCAGCC AGTCAATCA 19

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>14

TCGCCCTAAT TGAATAGGTG 20

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>15

ACCGCAATGC ATCTTCAGG 19

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>16

GTCTGTGAGG AAGCAGACAA 20

<210>17

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>17

TCGGCTCACT CAAGGGTGTC AAGTGAGCCG GCTCCAATT 39

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成

<400>18

GCACCGCGGC GTAAGTTTCA GTTCTGGTAC GGTGGGATTG 40

<210>19

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<400>19

GCAGGTGAAA AGATTGAGTT CGGC 24

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>20

TTGAGGCGGC GAATCAGA 18

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>21

CCAGGACAAC CTCTTCCAAC 20

<210>22

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成

<400>22

CCTTGCCCAA AGGCTCTTGA GTAACCGGAC AACCTCACGT 40

<210>23

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<400>23

TGACCGCCTT CTCACTGTCC ACCTCTCACG GTGATGAACC T 41

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>24

CAGGGTGCAG CATGAGTTG 19

<210>25

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<400>25

TGCTATTACC CTGCACAAGG TG 22

<210>26

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>26

TTGTGCTTCC TGGGGTTG 18

<210>27

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<400>27

AACTACCACA CCTGGACCT 19

<210>28

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成

<400>28

GCCATGACAG AAACTGGAGC GTGAGGCTGC TCAAGCAACG 40

<210>29

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<400>29

AAGCGGAGTC TGTCAGGAGC CGATCTTTCT GCGTGGGGC 39

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<400>30

TGGTTGATAG GGGGCAGTTC 20

<210>31

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<400>31

TCCAGAGAGC AGGCCTCT 18

Claims

1.鉴别PRRSV毒株基因亚型的引物，其特征在于

经典毒株扩增引物LAMP1包括如下序列：

F3：5’-ACCGCAATGCATCTTCAGG-3’,

B3：5’-GTCTGTGAGGAAGCAGACAA-3’,

FIP：5’-TCGGCTCACTCAAGGGTGTCA-AGTGAGCCGGCTCCAATT-3’,

BIP：5’-GCACCGCGGCGTAAGTTTCA-GTTCTGGTACGGTGGGATTG-3’,

LB：5’-GCAGGTGAAAAGATTGAGTTCGGC-3’；

高致病性毒株扩增引物LAMP2包括如下序列：

F3：5’-TTGAGGCGGCGAATCAGA-3’,

B3：5’-CCAGGACAACCTCTTCCAAC-3’,

FIP：5’-CCTTGCCCAAAGGCTCTTGAGT-AACCGGACAACCTCACGT-3’,

BIP：5’-TGACCGCCTTCTCACTGTCCA-CCTCTCACGGTGATGAACCT-3’,

LF：5’-CAGGGTGCAGCATGAGTTG-3’,

LB：5’-TGCTATTACCCTGCACAAGGTG-3’,

类NADC30毒株扩增引物LAMP3包括如下序列：

F3：5’-TTGTGCTTCCTGGGGTTG-3’,

B3：5’-AACTACCACACCTGGACCT-3’,

FIP：5’-GCCATGACAGAAACTGGAGCGT-GAGGCTGCTCAAGCAACG-3’,

BIP：5’-AAGCGGAGTCTGTCAGGAGCC-GATCTTTCTGCGTGGGGC-3’,

LF：5’-TGGTTGATAGGGGGCAGTTC-3’,

LB：5’-TCCAGAGAGCAGGCCTCT-3’。

2.一种权利要求1中的引物在鉴别PRRSV毒株基因亚型中的应用。

3.一种PRRSV毒株基因亚型的鉴别方法，其特征在于对待测样本分别使用权利要求1中的扩增引物LAMP1、LAMP2和LAMP3进行扩增，若LAMP1检测结果为有扩增，LAMP2和LAMP3检测结果为无扩增，则判断待测样本是PRRSV经典毒株；若LAMP2检测结果为有扩增，LAMP1和LAMP3检测结果为无扩增，则判断待测样本是PRRSV高致病性毒株；若LAMP3检测结果为有扩增，LAMP1和LAMP2检测结果为无扩增，则判断待测样本是PRRSV类NADC30毒株。

4.根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于进行LAMP1、LAMP2和LAMP3扩增之前，先对待测样本进行PRRSV LAMP广谱扩增检测，如有扩增，证明有PRRSV感染，再分别进行LAMP1、LAMP2和LAMP3扩增，如无扩增，证明无PRRSV感染，鉴别到此结束。

5.根据权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于进行PRRSV LAMP广谱扩增检测中使用的引物序列如下：

F3：5’-AGAAAAACCCGGAGAAGCC-3’,

B3：5’-TGCTGAGGGTGATGCTGT-3’,

FIP：5’-ACAATTGCCGCTCACTAGGGG-CCATTTCCCTCTTGCGACT-3’,

BIP：5’-CGCTGGAACTTGTGCCCTGT-GCACAGTATGTTGCGTAGGC-3’,

LF：5’-GTGATGCCTGACGTCATCTTC-3’,

LB：5’-GGGAGGATAAGTTACACTGTGGA-3’。

6.根据权利要求4或5所述的鉴别方法，其特征在于扩增的25 μL反应体系如下：10×Thermopol Buffer 2.5 μL，10 mmol·L^-1的dNTP 3.5 μL，100 mmol·L^-1的MgSO₄ 1.5 μL，甜菜碱3.0 μL，4μmol/L的外引物F3/B3各1 μL，40μmol/L的内引物FIP/BIP各为1 μL，10μmol/L的环引物LF/LB各 1 μL，8000U/mL的Bst DNA聚合酶1.0 μL，灭菌ddH₂O 5.5 μL，反转录酶0.5 μL，模板cDNA 1.5 μL。

7.根据权利要求4或5所述的鉴别方法，其特征在于扩增条件62℃条件下反应35 min。