CN105567867B

CN105567867B - 人类免疫缺陷病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

Info

Publication number: CN105567867B
Application number: CN201410532598.9A
Authority: CN
Inventors: 尹华立; 居金良
Original assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shanghai Rendu Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2014-10-11
Filing date: 2014-10-11
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2034-10-11
Also published as: CN105567867A

Abstract

本发明公开了一种人类免疫缺陷病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，具体包括：捕获探针、HIV‑1引物T7引物和nT7引物、HIV‑1检测探针、M‑MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等试剂。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、快速地对含有人类免疫缺陷病毒1型的血清或血浆样品进行核酸扩增检测，具有检测效率高，准确度高的特点，能够检测出HIV的所有型，包含M、N、O群所有亚型，具有广阔的应用前景。

Description

人类免疫缺陷病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒的生物医学检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的实时荧光核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）是导致一种慢性致死性疾病艾滋病（Acquired immune defiiency syndrome,AIDS）的病原微生物。由于艾滋病具有传染性和高致死性，因此已经成为世界范围内重点防控的主要疾病之一。自第一例艾滋病病例于1981首次报告艾滋病病例以来，到目前为止，艾滋病已造成超过两千五百万人死亡。中国自1985年首次发现艾滋病病例以来，艾滋病的流行呈快速爬升倾向。近年来，中国艾滋病的感染与发病人数也增长较快。中国艾滋病现状，据联合国驻华机构显示的数据，目前中国艾滋病病毒感染者约84万人，加上已经过世的24万人，总数应在100万人左右。根据世界卫生组织预测，目前虽然中国艾滋病病毒携带者占总人口的比例虽然很低，但感染总人数在亚洲位居第2位，在全球居第14 位。鉴于中国是世界人口基数最大，人口最为密集的国家，一旦艾滋病大规模流行将成为一场公共卫生灾难。

根据HIV基因结构、免疫学和流行病学的特征，HIV被分为HIV-1和HIV-2 两大类，HIV-1的感染力较强，在世界各地广为流行，而HIV-2主要集中在非洲西部、欧洲、美国，南美的一些地区也偶有报道。

HIV病毒为逆转录病毒，其基因具有显著的多样性，不同的地区和民族，HIV流行的基因型不同。境内流行的HIV主要为M组HIV-1型（目前境内尚未见HIV-1 N组和O组的报道，HIV-2型感染病例的报道极少），其基因型主要为B/B’、BC重组型（包括CRF 07_BC重组型和CRF 08_BC重组型）以及AE重组型（CRF 01_AE重组型）。而且，HIV-1基因型具有一定的地域差异，不同的地区流行的HIV基因型也不尽相同，如CRF 07_BC重组型流行于四川、新疆等地，而CRF 08_BC重组型则流行于广西等地。

HIV 有十分高的遗传变异率，它是一个多态性病毒，从不同的AIDS 患者体内分离出的病毒结构表现出一定的差异，事实上，独立分离到的HIV-1和2彼此都不相同，这是由于病毒传播过程中突变，缺失或插入引起的，高度变异区在env基因内，相当于gp120 的五个区段，gag 和pol 基因较少变异，因此，只有选择病毒基因组中高度保守区域作为目的基因加以扩增，才能有效地检测所有HIV的变异性。

核酸检测主要涉及核酸提取与和核酸扩增检测。

目前血清和血浆中病毒核酸的提取方法主要有离心柱提取法及磁珠法。柱提取法操作过程复杂，效率低，且不易于实现自动化；磁珠法能快速实现核酸的分离与纯化，易于实现自动化操作。

目前国内已批准上市的HIV荧光定量PCR检测试剂仅有3-4种，且检测灵敏度低，约在1000IU/ml 左右；对于小于1000IU/ml的样本无法检出，不能满足临床检测的需求。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)是一种直接快速检测RNA的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性进行专门设计。目前尚无针对人类免疫缺陷病毒1型RNA进行检测的实时荧光核酸恒温扩增检测技术的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速，高准确度，污染易控，设备简单，成本低的人类免疫缺陷病毒1型RNA检测试剂盒，同时解决了现有技术中的人免疫缺陷病毒1型检测试剂盒基因型覆盖不全，灵敏度低及漏检率高的技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种人类免疫缺陷病毒1型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条HIV-1靶标核酸的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HIV-1靶标核酸的DNA拷贝的HIV-1检测引物T7和nT7，和一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述HIV-1靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HIV-1检测探针；捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示； HIV-1检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；HIV-1检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

进一步，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶， M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，捕获探针存在于病毒核酸提取液中，T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。

再进一步，所述试剂盒还包含有HIV-1内标和内标检测探针，可有效反映体系假阴性现象；HIV-1内标为人类免疫缺陷病毒1型核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用T7和nT7引物，由序列表中序列6所示的体外转录RNA；内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于扩增检测液中。

更进一步，所述试剂盒包含病毒核酸提取液、洗涤液1、洗涤液2、HIV-1扩增检测液、SAT酶液、HIV-1阳性对照、HIV-1阴性对照、HIV-1内标和稀释液，其中：

病毒核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液1：含NaCl和SDS；

洗涤液2：矿物油；

HIV-1扩增检测液：含dNTP、NTP、T7引物、nT7引物、HIV-1检测探针和内标检测探针；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7 RNA聚合酶；

HIV-1阳性对照；人类免疫缺陷病毒1型pol基因核酸的稀释物；

HIV-1阴性对照：不含人类免疫缺陷病毒1型靶标核酸序列或不含人类免疫缺陷病毒1型的血清或血浆溶液；

HIV-1内标：HIV-1 IC RNA稀释物；

稀释液：含硫酸铵(NH₄)₂SO₄和HEPES。

具体的，所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：

（1）病毒核酸提取液：HEPES 250-800mM，LLS 4-10%，捕获探针1-50μΜ，磁珠50-500mg/L；

（2）洗涤液1：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500 mM，1% SDS，EDTA 1-10mM；

（3）洗涤液2：矿物油；

（4）HIV-1扩增检测液：Tris 10-50mM，MgCl2 10-40mM，dNTP 0.1-10mM，NTP 1-20mM，PVP40 1-10%，KCl 5-40mM，HIV-1引物和探针浓度在2.5-10pmol/反应；

（5）SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应、2-10mM HEPES pH7.5、10-100 mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose、40-200 mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1% (v/v) Triton X-100和20-50% (v/v) glycerol；

（6）HIV-1阳性对照：含10⁵-10⁸拷贝/mL人类免疫缺陷病毒1型pol基因核酸的稀释物；

（7）HIV-1阴性对照：不含有人类免疫缺陷病毒1型靶标核酸序列或不含有人类免疫缺陷病毒1型的血清或血浆溶液；

（8）HIV-1内标：含10⁴-10⁸拷贝/mL HIV-1 IC RNA的稀释物；

（9）稀释液：25-250mM HEPES，5-50mM (NH4)2SO4。

更为具体的，所述试剂盒的HIV-1扩增检测液中T7引物浓度为2.5pmol/反应，nT7引物浓度为7.5pmol/反应，HIV-1检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应；其他组分不变。

所述人类免疫缺陷病毒1型核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一：

（1）可与序列表中序列1所示的人类免疫缺陷病毒1型的靶标核酸序列特异结合的捕获探针（TCO，Target Capture Oligo），所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；

（2）用于扩增HIV-1靶标核酸的HIV-1检测引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；

（3）用于与在T7 RNA聚合酶作用下HIV-1靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HIV-1检测探针，所述HIV-1检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；

（4）用于与HIV-1核苷酸成竞争性的内标核苷酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HIV-1内标检测探针，所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

本发明提供了一种人类免疫缺陷病毒1型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，使用该试剂盒进行检测，与现有HIV-1检测相比，具有以下优点：

（1）本发明试剂盒针对HIV-1所有基因型，特别是M、N、O组的亚型进行靶标筛选、引物设计，涵盖范围广，具有高准确度、高特异性，可以实现对血清、血浆等样本中的人类免疫缺陷病毒1型进行快速、准确测定。

（2）本发明试剂盒针对血清、血浆基质特点，对HIV-1 靶核酸RNA进行了提取优化，设计了针对性的捕获探针及提取体系，避免了现有技术中提取DNA的加热、离心等操作，简化实验步骤，易于实现自动化，对检测灵敏度有了较大提高。

（3）本发明试剂盒中加入内标，可进一步有效监控假阴性的存在，提供更准确的检测结果。

（4）本发明将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个过程没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，同时降低了对所用PCR仪的设计和生产成本。

（5）本发明扩增产物为RNA，RNA在自然界中极易降解，相对PCR扩增DNA而言，污染易控，交叉影响小。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1比对组的引物对和探针序列的荧光检测结果；

图2本发明组的引物对和探针序列的荧光检测结果；

图3为人类免疫缺陷病毒1型核酸检测参考品(阴性符合率)SAT检测结果；

图4为人类免疫缺陷病毒1型核酸检测参考品(阳性符合率)SAT检测结果；

图5为人类免疫缺陷病毒1型核酸检测参考品(灵敏度)SAT检测结果；

图6为人类免疫缺陷病毒1型核酸检测50IU/ml的SAT检测结果；

图7为临床血清样本SAT检测的靶标荧光检测结果；

图8为临床血清样本SAT检测的内标荧光检测结果；

图9为临床血浆样本SAT检测的靶标荧光检测结果；

图10为临床血浆样本SAT检测的内标荧光检测结果；

图11为临床血清样本PCR的检测结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

HIV-1亚型众多，要全面覆盖各个基因型，本发明人经过长期而深入的研究，充分考虑HIV-1基因型检测的通用性，选择人类免疫缺陷病毒pol基因的保守区域片段作为检测靶标，经过大量筛选和验证，开发了高特异性，高灵敏的专用引物对，和相应的检测探针，使用该特定的引物序列可对人类免疫缺陷病毒1型的核酸进行高效扩增，具有高特异性，高灵敏等优异优点，可以用于准确地检测血清、血浆中的人类免疫缺陷病毒1型。

试剂盒

本发明提供了一种人类免疫缺陷病毒1型的实时荧光核酸检测试剂盒，包括：

捕获探针，一对扩增人类免疫缺陷病毒1型的特异性T7和nT7的引物对，以及一条检测探针。

所述的捕获探针（TCO，Target Capture Oligo），可与人类免疫缺陷病毒1型的靶标核酸序列特异结合，在有HIV-1内标时，其还可与该HIV-1内标序列特异结合；

所述引物对是一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HIV-1靶标核酸的DNA拷贝的HIV-1检测引物，由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；

所述检测探针是一条用于与在T7 RNA聚合酶作用下根据所述HIV-1靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的检测探针，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

为便于进行结果分析，试剂盒还包括：一条内标检测探针和HIV-1内标， HIV-1内标为人类免疫缺陷病毒1型核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用T7和nT7引物，在扩增体系引入内标，可以预防由于样本中可能存在的干扰物质导致的假阴性，由序列表中序列6所示的体外转录RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于扩增检测液中。

所述试剂盒中还可以包括一种或多种酶。如M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶。在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于酶液中，所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。

在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分：病毒核酸提取液、洗涤液1、洗涤液2、HIV-1扩增检测液、SAT酶液、稀释液、HIV-1阳性对照、HIV-1阴性对照、HIV-1内标和稀释液，各组分说明如下：

（1）病毒核酸提取液：用于提取和纯化人类免疫缺陷病毒1型核酸，为含捕获探针1-50μΜ、磁珠50-500mg/L的水溶液；

（2）洗涤液1：用于磁珠水相清洗， NaCl 50-500 mM和1 wt% SDS的水溶液；

（3）洗涤液2：用于磁珠有机相清洗的矿物油；

（4）HIV-1扩增检测液：含SAT所需组分，包含dNTP 0.1-10mM、NTP 1-20mM、引物和探针浓度为2.5-10pmol/反应的水溶液；

（5）SAT酶液：SAT扩增所需多酶反应体系，主要含M-MLV反转录酶 400-4000U/反应、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应；

（6）HIV-1阳性对照；人类免疫缺陷病毒1型pol基因核酸的稀释物；

（8）HIV-1内标：HIV-1 IC RNA的稀释物；

（9）稀释液：为表面活性剂，含5-50mM (NH₄)₂SO₄和25-250mM HEPES的水溶液。

在一优选例中，所述试剂盒中HIV-1扩增检测液中的T7引物 2.5pmol/反应、nT7引物 7.5pmol/反应、HIV-1检测探针5pmol/反应和内标检测探针5pmol/反应，其他不变。

对照物

由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，因此，在本发明的试剂盒中还可以设置对照物，以排除检测结果失真的情况。

本发明中可以设置的参照物包括：HIV-1阳性对照、HIV-1阴性对照和HIV-1内标中的一个或多个对照物。

HIV-1阳性对照为人类免疫缺陷病毒1型pol基因片段核酸（如序列1所示），通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。

HIV-1内标可以是体外转录的RNA，不具有生物学活性。HIV-1内标作为靶标核酸的竞争性内标，可以作为参照物，用于防止假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。

阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。

HIV-1阳性对照中RNA，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：

(1)用化学合成法合成一段HIV-1pol基因DNA片段(其核苷酸序列如序列表中SEQNo. 8所示)；

(2)将片段克隆到pGEM®-T载体中，构建HIV-1阳性质粒；

(3) HIV-1阳性质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为pGEM®-T- HIV-1菌株，贮存于-70℃；

(4)从pGEM®-T- HIV-1菌株中提取pGEM®-T-HIV-1质粒，将质粒进行转录RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定HIV-1体外转录RNA （SEQ No.1）。

HIV-1内标中的体外转录的HIV-1 IC RNA，可以通过多种方法制备所得。其中一种制备方法如下：

(1)用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同HIV-1靶标序列区域(HIV-1内标片断，其核苷酸序列如序列表中SEQ No. 9所示)；

(2)将片段克隆到pGEM®-T载体中，构建HIV-1内标质粒；

(3) HIV-1内标质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为pGEM®-T-HIV-1 IC菌株，贮存于-70℃；

(4)从pGEM®-T- HIV-1 IC菌株中提取pGEM®-T- HIV-1 IC质粒，将质粒进行转录RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定内标RNA（SEQ No. 6）。

检测方法

将本发明人类免疫缺陷病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒用于检测血清、血浆等样本中的人类免疫缺陷病毒1型核酸检测的操作步骤是：

1、对照品准备

1.1 内标：取400 μL稀释液，加入10 μL HIV-1内标，混匀备用。

1.2 阳性对照：取250 μL阴性对照，加入10 μL阳性对照品，混匀备用。

1.3 阴性对照：取250 μL阴性对照备用。

2、核酸提取

2.1在样品处理管中加入200μl-800μl病毒核酸提取液、 250μl-1ml血清样本和10μl内标溶液，用病毒核酸提取液裂解待测样品中的人类免疫缺陷病毒1型，用病毒核酸提取液裂解待测样品中的人类免疫缺陷病毒1型释放出RNA，混匀，60℃保温10分钟，室温放置10分钟。

2.2将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液1 振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，然后加入800μl洗涤液1和200μl洗涤液2，振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠。

2.3将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。

3、SAT扩增检测

3.1向样品处理管中加入40μl扩增检测液洗涤磁珠。

3.2取振荡混匀的上述反应检测液30μl 加至洁净微量反应管，用ABI 7500型PCR仪 60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。

3.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪)，42℃反应60分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测50次；荧光素通道选择FAM通道(靶标信号检测，F1)和VIC通道(HEX和VIC波长相近，内标信号检测，F2)。

4、结果判定

根据SAT扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。

阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)

阳性结果判断：

F1通道dt≤50，F2通道有或者无数值的样本为阳性。

阴性结果判断：

F1通道dt无数值或为60，同时F2通道dt≤50的样品为阴性。

其中，dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数（与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似）

与现有的HIV-1检测相比，本发明具有以下优点：

(1)高特异性、高纯度、低污染：针对血清与血浆等临床样本中病毒特性，优化出适合血清与血浆裂解HIV-1病毒的病毒核酸提取液，同时设计出HIV-1靶核酸的优选捕获探针，可高效、特异性捕获人类免疫缺陷病毒1型的核酸（HIV-1 RNA）。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个反应过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。

(2)快速检测：核酸（HIV-1 RNA）扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要50分钟。

(3)污染易控：与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。

(4)设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。

综上所述，本发明试剂盒能够提取并检测血清或血浆样本中的人类免疫缺陷病毒1型核酸（HIV-1 RNA），具有特异性高、灵敏度高（可达50IU/ml）、污染低（扩增产物RNA在自然环境下易于降解）及快速检测（50分钟完成扩增检测）的特点，将在人类免疫缺陷病毒1型早期感染的临床诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例中所用主要原料SAT酶液、HIV-1体外转录RNA及内标的体外转录RNA由美国RD Biosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。

实施例1 用于实时荧光核酸恒温扩增检测人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的专用引物和探针的设计

本发明选择人类免疫缺陷病毒1型5’非编码区核酸中无二级结构且高度保守区段作为扩增靶序列区域（其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示），进行引物探针设计，获得如下具体序列：

(1)用于扩增人类免疫缺陷病毒1型靶多核苷酸的nT7引物及T7引物，T7引物核苷酸序列为：5’- AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGATTTTGTAATTCTTTAGTTTGTATGTCTG -3’（序列3）； nT7引物核苷酸序列为：5’- ACAGTATTCATTCACAATTTTA-3’（序列4）；

(2)用于检测人类免疫缺陷病毒1型靶多核苷酸的检测探针，其序列为： 5’-CCAUCCGUGCAGGGGAAAGAGAUGG-3’（序列5），5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

在引物、探针设计过程中，产生了诸多对引物和探针序列，比如T7引物序列：5’ aatttaatacgactcactatagggagaATTTGCTTTTGTAATTCTTTA 3’，nT7引物序列：5’GTACAAATGACAGTATTCA 3'，检测探针序列为5’ cccgGAAAGAAUAAUAGcggg 3’(5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记)，以及SEQ ID NO：1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3等。将上述各序列用专利200810111479.0中所述的反应体系进行扩增，比对灵敏度检测并选取较优者。

结果如图1，图2（图1为比对组，图2为本发明组）所示，同样10copies/反应的浓度，本发明组的扩增曲线明显优于比对组，显示本发明组能给扩增带来更高的灵敏度。

为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的HIV-1内标（SEQ ID NO: 6），设计了内标检测探针，HIV-1内标与HIV-1靶标核苷酸拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述HIV-1内标可通过HIV-1靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与HIV-1检测探针序列、荧光标记不同的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为

5’ CCGACGCUCACCACGCUCCAGUCGG3’（SEQ ID NO: 5），5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

实施例2 制备人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明人类免疫缺陷病毒1型的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。试剂盒包括有捕获探针(TCO，Target Capture Oligo)、T7引物、nT7引物、检测探针、M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等组分，其中：

捕获探针核苷酸序列为SEQ ID NO: 2、T7引物序列SEQ ID NO: 3、nT7引物序列为SEQ ID NO: 4、检测探针核苷酸序列为SEQ ID NO: 5。

所述的捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和HIV-1检测探针存在于HIV-1扩增检测液中，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中。具体地将，所述试剂盒包含以下组分：病毒核酸提取液、洗涤液1、洗涤液2、HIV-1扩增检测液、SAT酶液、HIV-1阳性对照、HIV-1阴性对照和稀释液，具体为：

（1）病毒核酸提取液：含捕获探针1-50μΜ、磁珠50-500mg/L的水溶液；

（2）洗涤液1：含NaCl 50-500 mM和 1 wt% SDS的水溶液；

（3）洗涤液2：用于磁珠有机相清洗的矿物油；

（4）HIV-1扩增检测液：含SAT所需组分，包含dNTP 0.1-10mM、NTP 1-20mM、HIV-1引物和探针浓度为2.5-10pmol/反应的水溶液；

（6）HIV-1阳性对照；人类免疫缺陷病毒1型5’非编码区核酸的稀释物；

（8）稀释液：含5-50mM (NH₄)₂SO₄和25-250mM HEPES的水溶液。

更具体的，本试剂盒的组成如下：

(1)病毒核酸提取液：HEPES 250-800mM，LLS 4-10%，捕获探针5-25μΜ，磁珠50-300mg/L；

(2)洗涤液1：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500 mM，1% SDS，EDTA 1-10mM；

(3)洗涤液2：矿物油；

(4)HIV-1扩增检测液：Tris 10-50mM，MgCl₂ 10-40mM，dNTP 0.5-8mM，NTP 1-10mM，PVP40 1-10%，KCl 5-40mM，HIV-1引物对T7引物浓度优选为2.5pmol/反应，nT7引物浓度优选为5pmol/反应，HIV-1检测探针浓度优选为5pmol/反应；

(5)SAT酶液：M-MLV反转录酶500-2000U/反应、T7 RNA聚合酶300-1500U/反应、2-10mM HEPES pH7.5、10-100 mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose、40-200 mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1% (v/v) Triton X-100和20-50% (v/v) glycerol；

(6)HIV-1阳性对照；含10⁵-10⁸拷贝/mL人类免疫缺陷病毒1型5’非编码区核酸稀释物；

(7)HIV-1阴性对照：不含有人类免疫缺陷病毒1型靶标核酸序列或不含有人类免疫缺陷病毒1型的血清或血浆溶液；

(8)稀释液：含有硫酸铵和HEPES缓冲液的溶液，具体包含HEPES 25-250mM，(NH₄)₂SO₄ 5-50mM。

实施例3 人类免疫缺陷病毒1型核酸国家参考品的实时荧光核酸恒温扩增检测

运用实施例2中的试剂盒对中国食品药品检定研究院的人类免疫缺陷病毒1型核酸国家参考品中的阴性符合率、阳性符合率及灵敏度参考品、及用灵敏度参考品B110倍梯度稀释至50IU/ml（重复检测10次）分别进行实时荧光核酸恒温扩增检测，其中，阳性参考品为P1-P8，阴性参考品为N1-N8，灵敏度参考品B1-B6，其中B6为阴性；另设阴性对照、阳性对照（10⁶拷贝/ml HIV IC RNA的稀释物）各一个，具体步骤如下：

1、核酸提取

在样品处理管中加入400μl病毒核酸提取液(HEPES 500mM，LLS 8%，捕获探针15μΜ，磁珠 150mg/L)、 250μl参考品样本，混匀，60℃保温10分钟，室温放置10分钟。

将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液1(HEPES 25mM，NaCl 150mM，1 wt%SDS，EDTA 2.5mM；) 振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，然后加入800μl洗涤液1和200μl洗涤液2，振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠。

将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。

2、SAT扩增检测

向样品处理管中加入40μl扩增检测液洗涤磁珠。HIV-1扩增检测液具体包含Tris15mM，MgCl₂ 15mM，dNTP 2.5mM，NTP 3mM，PVP40 1%，KCl 10mM，T7引物浓度为2.5pmol/反应，nT7引物浓度为7.5pmol/反应，HIV-1检测探针浓度为5pmol/反应。

取振荡混匀的上述反应检测液30μl 加至洁净微量反应管，用ABI 7500型PCR仪60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAT酶液中含有M-MLV反转录酶1500U/反应、T7 RNA聚合酶1000U/反应、10mM HEPES pH7.5、15 mM N-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mMzinc acetate(乙酸锌)、20 mM trehalose(海藻糖)、100mM Tris-HCl pH 8.0、80mM KCl、0.25mM EDTA、0.5% (v/v) Triton X-100和30% (v/v) glycerol(丙三醇)。

将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪，ABI公司产品)，42℃反应60分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测60次；荧光素通道选择FAM通道(靶标信号检测，F1)和VIC通道(HEX和VIC波长相近，内标信号检测，F2)。

3、结果判定

阳性结果判断：

F1通道dt≤50，F2通道有或者无数值的样本为阳性；

阴性结果判断：

F1通道dt无数值或为50，同时F2通道dt≤50的样品为阴性。

4、结果

从图3、图4、图5、图6显示，本发明试剂盒完全可以检出阳性参考品P1-P8，阳性符合率100%（图3）；N1-N8阴性参考品检出均为阴性（图4），阴性符合率100%，特异性良好；B1-B6灵敏度参考品均可检出（图5），其中B1-B5阳性，B6阴性，完全符合参考品结果；再结合图6，本试剂盒重复10次均可检出50IU/ml的浓度，且曲线良好，说明本试剂盒最低灵敏度至少可保证在50IU/ml。

实施例4 试剂盒对其他基因型的检测

为进一步检验本发明设计的覆盖范围，以实施例3所述的试剂盒对Seracare LifeSciences 的基因型参考品（Purified HIV-1 RNA）进行检测，操作步骤同实施例3。

从检测结果显示：本发明试剂盒可覆盖以上10个基因型。

实施例5 临床血清、血浆样本的实时荧光核酸恒温扩增检测

用本发明试剂盒检测临床血清、血浆样本中的人类免疫缺陷病毒1型，同步比对常规PCR检测相同的血清样本。试剂盒含有内标检测探针和HIV-1内标（内标检测探针浓度为5pmol/反应，存在于扩增检测液中；HIV-1内标为10⁵拷贝/mL IC RNA的稀释物），其他组分、浓度同实施例3。SAT检测的具体方法包括以下步骤：

1、样本采集、运输及保存

由临床医师根据实际情况进行标本采集，血清样本的采集方法为：用无菌注射器抽取1-10号受检者静脉血2 mL，收集于无菌收集管中，室温不超过4小时，1600rpm离心5分钟分离出血清，转移至另一无菌离心管中备用。

血浆标本的采集方法为：用无菌注射器抽取1-10号受检者静脉血2 mL，注入含有EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的无菌收集管中（不可用肝素抗凝），立即轻轻颠倒混匀，室温不超过4小时，1600rpm离心5分钟分离出血浆，转移至另一无菌离心管中备用。

另设阴性对照、阳性对照（10⁶拷贝/ml HIV 体外转录RNA的稀释物）各一个。

2、核酸提取

在样品处理管中加入200μl病毒核酸提取液、500μl血清或血浆样本和10μl内标溶液，用病毒核酸提取液裂解待测样品中的人类免疫缺陷病毒1型，混匀，60℃保温10分钟，室温放置10分钟。其余步骤同实施例3。

3、SAT扩增检测

向样品处理管中加入40μl扩增检测液洗涤磁珠，其中，HIV-1扩增检测液中含有内标检测探针浓度为5pmol/反应。其余步骤同实施例3。

结果判定同实施例3。

结果显示，图7（靶标F1）中1-10号血清样本dt值<30，图8（内标F2）扩增曲线有出有不出，提示反应体系未受抑制，根据判定结果，1-10号血清样本均为阳性样本；而图9（靶标F1）中1-10号血浆样本dt值<30，图10（内标F2）扩增曲线有出有不出，显示1-10号血浆样本也都是阳性样本；可见，1-10号的血清、血浆结果完全一致，没有因样本类型的不同产生差异；同常规PCR检测相比，结果相同（图11）。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的人类免疫缺陷病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物上结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海仁度生物科技有限公司

<120> 人类免疫缺陷病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 449

<212> RNA

<213> Human immunodeficiency virus type 1

<400> 1

ggauauauag aagcagaagu uaucccagca gaaacaggac aggaaacagc auacuuucug 60

cuaaaauuag caggaagaug gccaguaaaa guaauacaca cagacaaugg uagcaauuuc 120

accagcaaug caguuaaagc agcuuguugg ugggccaaug uccgacagga auuugggaug 180

cccuacaauc cucaaaguca aggaguagua gaaucuauga auaaggaauu aaagaaaauc 240

auagggcaga uaagagaaca agcugaacac cuuaagacag cuguacaaau gacaguauuc 300

auucacaauu uuaaaagaaa aggggggauu gggggguaca gugcagggga aagaauaaua 360

gacauaauag caacagacau acaaacuaaa gaauuacaaa agcaaauuac aaaaauucaa 420

aauuuucggg uuuauuacag ggacagcag 449

<210> 2

<211> 57

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 捕获探针序列

<400> 2

ctggccatct tcctgctaat tttagcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 57

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> T7引物序列

<400> 3

aatttaatac gactcactat agggagattt tgtaattctt tagtttgtat gtctg 55

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> nT7引物序列

<400> 4

acagtattca ttcacaattt ta 22

<210> 5

<211> 25

<212> RNA

<213> Unknown

<220>

<223> 检测探针序列

<400> 5

ccauccgugc aggggaaaga gaugg 25

<210> 6

<211> 449

<212> RNA

<213> Unknown

<220>

<223> 内标RNA序列

<400> 6

ggauauauag aagcagaagu uaucccagca gaaacaggac aggaaacagc auacuuucug 60

cuaaaauuag caggaagaug gccaguaaaa guaauacaca cagacaaugg uagcaauuuc 120

accagcaaug caguuaaagc agcuuguugg ugggccaaug uccgacagga auuugggaug 180

cccuacaauc cucaaaguca aggaguagua gaaucuauga auaaggaauu aaagaaaauc 240

auagggcaga uaagagaaca agcugaacac cuuaagacag cuguacaaau gacaguauuc 300

auucacaauu uuaaaagaaa aggggggauu ggagcguggu gagcagggga aagaauaaua 360

gacauaauag caacagacau acaaacuaaa gaauuacaaa agcaaauuac aaaaauucaa 420

aauuuucggg uuuauuacag ggacagcag 449

<210> 7

<211> 25

<212> RNA

<213> Unknown

<220>

<223> 内标检测探针

<400> 7

ccgacgcuca ccacgcucca gucgg 25

<210> 8

<211> 449

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 靶标阳性片段序列

<400> 8

ggatatatag aagcagaagt tatcccagca gaaacaggac aggaaacagc atactttctg 60

ctaaaattag caggaagatg gccagtaaaa gtaatacaca cagacaatgg tagcaatttc 120

accagcaatg cagttaaagc agcttgttgg tgggccaatg tccgacagga atttgggatg 180

ccctacaatc ctcaaagtca aggagtagta gaatctatga ataaggaatt aaagaaaatc 240

atagggcaga taagagaaca agctgaacac cttaagacag ctgtacaaat gacagtattc 300

attcacaatt ttaaaagaaa aggggggatt ggggggtaca gtgcagggga aagaataata 360

gacataatag caacagacat acaaactaaa gaattacaaa agcaaattac aaaaattcaa 420

aattttcggg tttattacag ggacagcag 449

<210> 9

<211> 449

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 内标阳性片段序列

<400> 9

ggatatatag aagcagaagt tatcccagca gaaacaggac aggaaacagc atactttctg 60

ctaaaattag caggaagatg gccagtaaaa gtaatacaca cagacaatgg tagcaatttc 120

accagcaatg cagttaaagc agcttgttgg tgggccaatg tccgacagga atttgggatg 180

ccctacaatc ctcaaagtca aggagtagta gaatctatga ataaggaatt aaagaaaatc 240

atagggcaga taagagaaca agctgaacac cttaagacag ctgtacaaat gacagtattc 300

attcacaatt ttaaaagaaa aggggggatt ggagcgtggt gagcagggga aagaataata 360

gacataatag caacagacat acaaactaaa gaattacaaa agcaaattac aaaaattcaa 420

aattttcggg tttattacag ggacagcag 449

Claims

1.一种人类免疫缺陷病毒1型实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条序列表中序列1所示的HIV-1的靶标核酸的捕获探针，一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HIV-1靶标核酸的DNA拷贝的HIV-1检测引物T7和nT7，和一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述HIV-1靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的HIV-1检测探针；还包含有HIV-1内标和内标检测探针；

所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列2所示；

所述HIV-1检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列3所示，nT7引物序列如序列表中序列4所示；

所述HIV-1检测探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；

所述HIV-1内标为人类免疫缺陷病毒1型核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用T7和nT7引物，由序列表中序列6所示的体外转录RNA；

所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于一SAT酶液中，所述捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述内标检测探针存在于扩增检测液中。

4.根据权利要求1至3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含病毒核酸提取液、洗涤液1、洗涤液2、HIV-1扩增检测液、SAT酶液、HIV-1阳性对照、HIV-1阴性对照、HIV-1内标和稀释液，其中：

病毒核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液1：含NaCl和SDS；

洗涤液2：矿物油；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

HIV-1阳性对照；含人类免疫缺陷病毒1型pol基因核酸稀释物；

HIV-1阴性对照：不含有人类免疫缺陷病毒1型靶标核酸序列或不含有人类免疫缺陷病毒1型的血清或血浆溶液；

HIV-1内标：HIV-1 IC RNA的稀释物；

稀释液：含硫酸铵(NH₄)₂SO₄和HEPES。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：

(1)病毒核酸提取液：HEPES 250-800mM，LLS 4-10％，捕获探针1-50μΜ，磁珠50-500mg/L；

(2)洗涤液1：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500mM，1％SDS，EDTA 1-10mM；

(3)洗涤液2：矿物油；

(4)HIV-1扩增检测液：Tris 10-50mM，MgCl₂ 10-40mM，dNTP 0.1-10mM，NTP 1-20mM，PVP40 1-10％，KCl 5-40mM，HIV-1引物和探针浓度在2.5-10pmol/反应；

(5)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7RNA聚合酶200-2000U/反应、2-10mMHEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mMtrehalose、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、0.1-1％(v/v)Triton X-100和20-50％(v/v)glycerol；

(6)HIV-1阳性对照：含10⁵-10⁸拷贝/mL人类免疫缺陷病毒1型pol基因核酸的稀释物

(8)HIV-1内标：含10⁴-10⁸拷贝/mL HIV-1IC RNA的稀释物；

(9)稀释液：25-250mM HEPES，5-50mM(NH₄)₂SO₄。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述HIV-1扩增检测液中T7引物浓度为2.5pmol/反应，nT7引物浓度为7.5pmol/反应，HIV-1检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应；其他组分不变。