CN107090521A - 一种人类免疫缺陷病毒ⅰ型总核酸hiv‑1 tna的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种人类免疫缺陷病毒ⅰ型总核酸hiv‑1 tna的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV‑1 TNA的试剂盒及其应用，本发明一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV‑1 TNA的试剂盒，所述人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV‑1 TNA的试剂盒包括RT‑PCR mix、酶混合液、引物组、探针组和质控品，所述引物组和探针组选自引物探针组1、引物探针组2中的至少一组；本发明能够实现对全血中的HIV‑1总核酸进行快速检测，灵敏度高。本发明引入了更适合RNA和DNA扩增的Tris‑MOPS‑柠檬酸钠缓冲液，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了普通RT‑PCR方法特异性不高的缺点。

Description

一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1 TNA的试剂盒及其 应用
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，涉及一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1 TNA的试剂盒及其应用。
背景技术
艾滋病(AIDS)是全球面临的重大公共卫生问题。目前人类免疫缺陷病毒诊断常采用的手段包括病毒学诊断和血清学诊断。共培养法是病毒学诊断技术中常用方法，即通过培养从正常人外周血液分离单个核细胞，培养过程需加PHA刺激，然后加入病人单个核细胞进行艾滋病的诊断。该方法专一性强，特异性高，不会出现假阳性，但其敏感性低，周期较长，且需要在P3实验室进行，易造成实验室污染，临床应用较少。
血清学诊断中，酶联免疫法是目前诊断艾滋病的主要手段，可以分为初筛实验和确认实验，但由于免疫学诊断要依赖抗原抗体介导的免疫反应，而病毒感染机体产生抗体并达到一定滴度存在滞后性，另外由于免疫学诊断的灵敏度，其“窗口期”最短也有14天。
血清学诊断中，核酸分子检测由于具有更高的灵敏度和特异性，在检验医学和临床研究中相比酶联免疫诊断显示出更大的优势，其“窗口期”缩短至11天。近年来，检测人类免疫缺陷病毒RNA水平是艾滋病检测常用方法，大大的提高了艾滋病的检测准确性，已成为诊断艾滋病的“金标准”方法。但由于病毒RNA极度容易降解，对标本的收集及保藏条件要求高,不利于资源匮乏地区的筛查。另外，针对接受高效抗逆转录病毒治疗的艾滋病患者而言，体内的病毒载量一般维持在较低水平，低于目前最灵敏的病毒载量检测试剂盒的最低检出限，因此通过病毒载量检测试剂盒无法检测出。
近年来，人类免疫缺陷病毒DNA检测技术快速发展，填充了人类免疫缺陷病毒RNA检测领域的空白区，主要采用全血标本、PBMC细胞等，检测细胞中前病毒DNA，但由于全血中前病毒DNA水平相对较低，对DNA检测灵敏度要求更高。另外同样存在的标本采集、保存、运输等困难，如资源匮乏地区或条件欠缺实验室并不能及时地将采集的全血分离、冻存，没有完善冷冻链运输，运输过程受生物危险品运输限制，从而影响标本检测准确性。
干血斑，一般采用国际通用903#滤纸制备而成，可解决上述标本遇到的问题，优势：可常温保存运输，常温下可保存3个月以上，无病毒感染。但是由于干血斑标本采样量少(70-80ul全血)，灵敏度低于常规核酸检测试剂盒约1个数量级，影响干血斑在人类免疫缺陷病毒筛查或早期诊断的应用。有文献报告，采用总核酸检测方法检测全血及干血斑中的靶基因，相比前病毒DNA检测可有效的降低假阴性。
人类免疫缺陷病毒总核酸(HIV-1 TNA)是指与人类免疫缺陷病毒相关的所有RNA和DNA总称。根据人类免疫病毒侵染机体过程显示，人类免疫缺陷病毒感染机体后，主要攻击外周血免疫T细胞，在T细胞类经逆转录成cDNA,之后，部分在整合酶的作用下整合到人类基因组中，另外一部分以1-LTR或2-LTR等形式DNA存在细胞内；整合基因组病毒序列又通过转录翻译等过程，在细胞内形成mRNA，剪切RNA等形式RNA，部分组装成病毒排出细胞。因此，人类免疫缺陷病毒DNA检测方法或RNA检测方法都只选择机体部分形式的核酸作为检测对象，因本身含量低或高效抗逆转录治疗后导致含量低，限制了病毒检测范围应用。
为了对现有技术进行改进，人们进行了长期的探索，提出了各种各样的解决方案。例如，中国专利文献公开了一种人类免疫缺陷病毒核酸检测试剂盒[公开号：CN103074446A]，本发明提供一种人类免疫缺陷病毒HIV核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括至少两套引物探针，且所述至少两套引物探针分别来自 不同的保守区域。优选的是，所述保守区域包括HIV基因的相对保守区：GAG、POL和LTR区。本发明设计组合两个不同区域的两套引物探针配制反应体系对HIV-1RNA进行联合检测以鉴别阳性反应的存在，两个不同区域是同一个区域两套不同的引物探针都能取到同样的效果。特色是相比传统做法1对引物1探针；我方是多对引物，多条探针，多对引物类似巢式PCR，提高特异性和灵敏度，多条探针覆盖多个亚型。有效降低了漏检的几率，能够更全面的覆盖所有亚型(包括HIV-1的M、N、O群的所有亚型)，并进一步提高检测灵敏度和更准确地定量，其检测灵敏度可达20IU/ml，定量线性范围为20～1.0×107IU/ml。本发明另外提供一种HIV核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括一套引物探针序列，所述引物探针序列选自LTR1、LTR2、GAG1、GAG2、POL1和POL2这六套中的任意一套。
不同于通常的HIV-1 DNA和HIV-1 RNA检测，HIV-1总核酸尚无商品化的荧光PCR检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供了一种灵敏度高，特异性好的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1 TNA的试剂盒及其应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1 TNA的试剂盒，所述人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1 TNA的试剂盒包括RT-PCR mix、酶混合液、引物组、探针组和质控品，
所述引物组和探针组选自引物探针组1、引物探针组2中的至少一组；
其中，所述引物探针组1包括引物组1和探针组1，所述引物组1由核苷酸序列SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4组成，
所述探针组1由核苷酸序列SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7组 成；
引物组1：
所述HIV-1TNA-F1引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；
所述HIV-1 TNA-R1引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-F1引物具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；
所述HIV-1 TNA-R1引物具有SEQ ID No.4的核苷酸序列；
探针组1：
所述HIV-1 TNA-P1探针具有SEQ ID No.5的核苷酸序列；
所述HIV-1 TNA-P2探针具有SEQ ID No.6的核苷酸序列；
所述HIV-1 TNA-P3探针具有SEQ ID No.7的核苷酸序列。
所述引物探针组2包括引物组2和探针组2，所述引物组2由核苷酸序列SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11组成，
所述探针组2由核苷酸序列SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14组成；
引物组2：
所述HIV-1TNA-F1引物具有SEQ ID No.8的核苷酸序列；
所述HIV-1 TNA-R1引物具有SEQ ID No.9的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-F2引物具有SEQ ID No.10的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-R2引物具有SEQ ID No.11的核苷酸序列；
探针组2：
所述HIV-1TNA-P1探针具有SEQ ID No.12的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-P2探针具有SEQ ID No.13的核苷酸序列；
所述HIV-1 TNA-P3探针具有SEQ ID No.14的核苷酸序列。
进一步地，所述试剂盒还含有内标IC，所述用于检测内标IC的引物组和探针：
所述IC-F1引物具有SEQ ID No.15的核苷酸序列；
所述IC-R1引物具有SEQ ID No.16的核苷酸序列；
所述IC-P1引物具有SEQ ID No.17的核苷酸序列。
进一步地，所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为含有HIV-1目的片段的MS2假病毒，所述阴性质控品为生理盐水。
更进一步地，所述的RT-PCR mix包含Tris-MOPS-柠檬酸钠缓冲体系、硫酸铵和氯化钾。
进一步地，所述Tris-MOPS-柠檬酸钠缓冲液为3-(N-吗啉)丙磺酸、Tris和柠檬酸三钠相互混合而成；所述3-(N-吗啉)丙磺酸：Tris：柠檬酸三钠的摩尔比为20-100：10-50：1-5。
本发明所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1 TNA的试剂盒的PCR扩增体系，所述实时荧光定量PCR扩增检测体系包括50μL的扩增体系：50μL体系，包含PCR Mix 27.5μL、酶混合液2.5μL，瞬时离心，然后加入待检测的TNA 20μl；同样按照上述体系设置阳性对照和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品20μL进行扩增。
进一步地，所述酶混合液含有Stoffel片段1μL、MMLV DNA聚合酶0.5μL和Tfl DNA聚合酶1μL。
本发明所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1 TNA的试剂盒及其检测方法在人类免疫缺陷病中的应用。
有益效果：本发明能够实现对全血中的HIV-1总核酸进行快速检测，灵敏度高，应用极为方便。本发明的试剂盒适合在各级疾控单位和医院进行推广，具有广泛的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明引入了更适合RNA和DNA扩增的Tris-MOPS-柠檬酸钠缓冲液，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了普通RT-PCR方法特异性不高，以及无法对低浓度模版进行定量的缺点。
(2)本发明提供了特异性引物探针组，用以扩增全血或干血斑中的HIV-1 总核酸，而可将全血或干血斑中各种形式的DNA与RNA都扩增出来，大大地增加了检测的灵敏度。
(3)本发明还引入了Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶的双聚合酶的扩增方法。其中Stoffel片段为去除5’-3’外切酶活性结构域的Taq DNA聚合酶，去除5’-3’外切酶活性的同时，恢复了少量3’-5’外切酶的校正活性，弥补了Tfl DNA聚合酶特异性不足的缺陷。而TflDNA聚合酶则提供切除taqman探针的5’-3’外切酶活性。
(4)Stoffel片段和Tfl DNA聚合酶耐抑制剂能力都较强，使得根据本发明构建的荧光RT-PCR试剂盒中可以加入更多的模版。从而可以用于提升灵敏度。
附图说明
图1为应用本发明HIV TNA实时荧光RT-PCR检测方法对HIV TNA检测的特异性实验结果比较图；
图2为应用本发明阳性参考品P1-P8扩增曲线图；
图3为应用本发明阴性参考品N1-N8扩增曲线图。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1
所述引物组和探针组选自引物探针组1、引物探针组2中的至少一组；
HIV-1特异性引物及探针的设计：
根据从Genbank上检索到的HIV-1基因组核酸序列，选择env区域，设计用于检测HIV-1 TNA的引物组和探针，所述引物探针组1由核苷酸序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7组成；
引物组1：
HIV-1TNA-F1：5’-AGTGTTAGTGTGAAAGTTTGACAGCC-3’(SEQ ID NO.1)，
HIV-1 TNA-R1：5’-GACCAGCGGAAAGTCCCTTG-3’(SEQ ID NO.2)，
HIV-1 TNA-F2：5’-GTTTGACAGCCAACTAGC-3’(SEQ ID NO.3)
HIV-1 TNA-R2：5’-GCGCCTTTCAGGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)
荧光探针组1：
HIV-1 TNA-P1：5’-Fam-GAGCTGCATCCGGAGTAC-3’BHQ1(SEQ ID NO.5)，
HIV-1 TNA-P2：5’-Fam-CTGCATCCGGAGTACTACA-3’BHQ1(SEQ ID NO.6)，
HIV-1 TNA-P3：5’-Fam-ATCTACATGCGCAGCACTGCA-3’BHQ1(SEQ ID NO.7)，
扩增片段长度为156bp；
所述引物探针组2由核苷酸序列SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14组成；
或引物组2：
HIV-1TNA-F1：5’-TAGTGTGAAAGTTTGACAGCCAACTAG-3’(SEQ ID NO.8)
HIV-1TNA-R1：5’-GACCAGCGGAAAGTCCCTTG-3’(SEQ ID NO.9)
HIV-1TNA-F2：5’-TAGCATCTCGTCACCTGGC-3’(SEQ ID NO.10)
HIV-1TNA-R2：5’-AATGGAACATCTTTCGAGC-3’(SEQ ID NO.11)
荧光探针组2：
HIV-1TNA-P1：5’-Fam-ATCTACATGCGCAGCACTGCA-3’BHQ1(SEQ ID NO.12)，
HIV-1TNA-P2：5’-Fam-CATCCGGAGTACTACAAGGAC-3’BHQ1(SEQ ID NO.13)，
HIV-1 TNA-P3：5’-Fam-TATACATACCGAGTAATACTAGGAC-3’BHQ1(SEQ ID NO.14)，
扩增片段长度为156bp；
所述试剂盒还含有内标IC，内标特异性引物及探针的设计
根据从Genbank上检索到的actin基因组核酸序列，选择保守区域，设计用于检测内标(IC)的引物组和探针，其序列如下：
IC-F1：5’-GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG-3’(SEQ ID NO.15)，
IC-R1：5’-GCGCTCGGTGAGGATCTT-3’(SEQ ID NO.16)，
荧光探针：
IC-P1：5’-Fam-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT-3’BHQ1(SEQ ID NO.17)。
试验1
标本采集和预处理：
本方法及试剂盒适用标本类型包括全血和干血斑样品，采集自广州市中第八人民医院。
TNA的提取：
采用商用总核酸提取试剂盒提取阴性质控品、阳性质控品及待测标本中总核酸，保存备用作为模板。
阳性质控品的制备：
将扩增片段合成MS2假病毒，作为阳性质控品(现有技术，方法略)。
荧光定量PCR扩增：
每个测试反应体系配制如下，50μL体系，包含PCR Mix(设置实验组和对照组)27.5μL、酶混合液(设置实验组和对照组)2.5μL瞬时离心，然后加入待检测的TNA 20μl；同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品20μL进行扩增。
所述PCR Mix(实验组)为表1所示：
表1
所述PCR Mix(对照组)为表2所示：
表2
所述酶混合液也包括实验组和对照组如表3所示：
表3
另设置一组，PCR mix选择PCR Mix(对照组)，酶混合液选择酶混合液(对照组)，模版添加5μL提取的TNA，以及15μL DEPC处理水。
将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类(设置HIV-1 TNA的报告基团为FAM，淬灭基团选择none)，设定循环条件：
宏时SLAN荧光PCR仪循环条件为45℃40分钟，94℃2分钟；94℃15秒，65℃30秒，72℃30秒，8个循环；94℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，8个循环；94℃15秒，53℃50秒，40个循环。55℃时收集荧光。
结果分析和判定：
1、结果分析条件设定
1)设置基线(baseline)：使用宏石SLAN荧光PCR仪软件默认设置，可根据具体情况对基线适当调整。
2)设置阈值(threshold)：以阈值线刚超过阴性对照扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点。
2、结果判断
1)阳性：检测样本Ct值小于等于30.0，且曲线有明显的指数增长期；
2)可疑：检测样本Ct值大于30.0且小于34.0，重复一次实验，如果Ct值小于34，且曲线有明显的指数增长期，为阳性，否则为阴性；
3)阴性：检测不到样本Ct值或Ct值大于34。
试验2
对确定为艾滋病患者样本，但通过商用HIV RNA检测试剂盒(COBAS AmpliPrepCOBAS TaqManHIV-1 Test，version2.0)无法检测出，取全血样本进行TNA提取，按下表进行扩增，结果记录在表4所示：
表4
由上表4和图1分析可知，当样本量5μL时，使用Taq DNA聚合酶和mmlv DNA聚合酶即可以正常扩增(第5组)；
当样本量增加到20μL时，仅使用Taq DNA聚合酶和mmlv DNA聚合酶无法扩增(第2组和第4组)，而使用Stoffel片段、Tfl DNA聚合酶以及MMLV DNA聚合酶，可以正常扩增(第1组和第3组)；
相比传统的Tris-HCl作为缓冲对的PCR mix，使用Tris-SO4、MOPS、柠檬酸钠组成的缓冲液，灵敏度更高。
试验3
特异性试验
以中检所人类免疫缺陷病毒Ⅰ核酸国家定量参考品中的阴阳性参考品血清标本(N1-N8，P1-P8)为待测标本，之后根据实施案例3的检测方法进行检测，检测结果：阳性参考品P1-P8扩增曲线图如2所示，阴性参考品N1-N8扩增曲线图如3所示。
检测结果表明，本发明对阳性参考品血清标本P1-P8的检测结果均为阳性，对阴性参考品血清标本N1-N8的检测结果均为阴性，符合国家参考品说明书的质量标准。即说明本发明的试剂盒及检测方法特异性好。
试验4
临床标本阳性检出率
采用临床标本，通过探讨不同病毒载量标本下本发明的阳性检出率。
采集了200份全血标本(已确认都是艾滋病患者样本)，各取70ul制备成干血斑，之后进行分离血浆，同时分别采用市面上成熟的商业化病毒载量试剂盒进行病毒载量检测及本发明的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸检测方法进行检测，结果如表5所示。
据文献结果显示，采用人类免疫缺陷病毒Ⅰ型病毒载量的检测方法检测干血斑标本，病毒载量范围在：小于1000copies/mL、1000-3000copies/mL、和大于3000copies/mL的阳性检出率分别为50-65％、80-90％、100％。
表5
如表5结果所示，本发明的人类免疫缺陷病毒总核酸检测试剂盒其检出率优于市面成熟病毒载量检测试剂盒，尤其在全血样本的检测，检出率明显高于对照试剂。另外，说明本发明的试剂盒同样适用于干血斑检测，对照试剂阴性结果，采用干血斑为样本本试剂盒检测出8个，但不足之处是对照试剂检测阳性，但通过干血斑样本检测有两个样本检测为阴性。总体来说，本发明的人类免疫缺陷病毒总核酸检测试剂盒检出率优于对照试剂，适用于全血、干血斑等样本检测。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (8)

1.一种人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1TNA的试剂盒，其特征在于：所述人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1TNA的试剂盒包括RT-PCR mix、酶混合液、引物组、探针组和质控品，
所述引物组和探针组选自引物探针组1、引物探针组2中的至少一组；
其中，所述引物探针组1包括引物组1和探针组1，所述引物组1由核苷酸序列SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4组成，
所述探针组1由核苷酸序列SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7组成；
引物组1：
所述HIV-1TNA-F1引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-R1引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-F1引物具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-R1引物具有SEQ ID No.4的核苷酸序列；
探针组1：
所述HIV-1TNA-P1探针具有SEQ ID No.5的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-P2探针具有SEQ ID No.6的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-P3探针具有SEQ ID No.7的核苷酸序列。
所述引物探针组2包括引物组2和探针组2，所述引物组2由核苷酸序列SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11组成，所述探针组2由核苷酸序列SEQ IDNo.12、SEQ ID No.13和SEQ ID No.14组成；
引物组2：
所述HIV-1TNA-F1引物具有SEQ ID No.8的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-R1引物具有SEQ ID No.9的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-F2引物具有SEQ ID No.10的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-R2引物具有SEQ ID No.11的核苷酸序列；
探针组2：
所述HIV-1TNA-P1探针具有SEQ ID No.12的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-P2探针具有SEQ ID No.13的核苷酸序列；
所述HIV-1TNA-P3探针具有SEQ ID No.14的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1TNA的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还含有内标IC，所述用于检测内标IC的引物组和探针：
所述IC-F1引物具有SEQ ID No.15的核苷酸序列；
所述IC-R1引物具有SEQ ID No.16的核苷酸序列；
所述IC-P1引物具有SEQ ID No.17的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1TNA的试剂盒，其特征在于：所述质控品包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为含有HIV-1目的片段的MS2假病毒，所述阴性质控品为生理盐水。
4.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1TNA的试剂盒，其特征在于：所述的RT-PCR mix包含Tris-MOPS-柠檬酸钠缓冲体系、硫酸铵和氯化钾。
5.根据权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1TNA的试剂盒，其特征在于：所述Tris-MOPS-柠檬酸钠缓冲液为3-(N-吗啉)丙磺酸、Tris和柠檬酸三钠相互混合而成；所述3-(N-吗啉)丙磺酸：Tris：柠檬酸三钠的摩尔比为20-100：10-50：1-5。
6.权利要求1所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1TNA的试剂盒的PCR扩增体系，其特征在于：所述实时荧光定量PCR扩增检测体系包括50μL的扩增体系：50μL体系，包含PCRMix 27.5μL、酶混合液2.5μL，瞬时离心，然后加入待检测的TNA 20μl；同样按照上述体系设置阳性对照和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品20μL进行扩增。
7.根据权利要求6所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1TNA的试剂盒的PCR扩增体系，其特征在于：所述酶混合液含有Stoffel片段1μL、MMLV DNA聚合酶0.5μL和Tfl DNA聚合酶1μL。
8.权利要求1至7任一项所述的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型总核酸HIV-1TNA的试剂盒及其检测方法在人类免疫缺陷病中的应用。
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