CN117143867A - 一种耶氏肺孢子菌检测引物组、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种耶氏肺孢子菌检测引物组、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种耶氏肺孢子菌检测引物组、试剂盒及其应用，属于真菌检测技术领域，本发明提供的耶氏肺孢子菌检测引物组包括如SEQ ID NO.1~5所示的引物，克服了现有技术中耶氏肺孢子菌检测灵敏度较低的问题。本发明提供的引物组灵敏度高、特异性强，检测限低至1000 copies/mL，有助于耶氏肺孢子菌感染的早筛早诊，便于及时进行干预治疗和控制病情。本发明提供的检测耶氏肺孢子菌的试剂盒采用恒温扩增‑核酸胶体金层析法，可在35min内完成检测反应，结果判断简便；使用本发明提供的试剂盒单次检测费用低，对仪器设备要求低，适用于基层医疗单位，能够进行居家自测试，有助于真菌感染的早诊。

Description

一种耶氏肺孢子菌检测引物组、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及真菌检测技术领域，尤其涉及一种耶氏肺孢子菌检测引物组、试剂盒及其应用。
背景技术
耶氏肺孢子（Pneumocystis jirovecii，PJ）是一种可感染人的机会性致病真菌，可引起严重的肺孢子肺炎（P.jiroveciipneumonia/Pneumocystispneumonia，PJP/PCP），在免疫功能低下者中发病率较高，曾被认为是艾滋病患者的标志性疾病。近年来，随着接受高效抗逆转录病毒治疗（HAART）和肺孢子菌肺炎预防措施的实施，HIV感染患者发生PJP的概率明显减少，但癌症患者、器官移植者、老年患者、先天性或获得性免疫缺陷及因其它疾病而接受免疫抑制剂等肺孢子菌肺炎高危人群的扩大，临床肺孢子菌肺炎患者日益增多。PJP患者的临床症状、体征、X线胸片及常规实验室检查均无特异性，易漏诊和误诊，因此，采取适合的诊断方法，实现耶氏肺孢子感染的早期正确诊断，对于及时合理治疗以提高PJP诊治水平具有重要意义。
目前组织病理学检查方法是诊断PJP的“金标准”，其主要通过对下呼吸道标本染色镜检以发现特征性包囊和滋养体，特异性好，在临床得到广泛应用，但该方法受限于标本质量、肺孢子菌的载量、检验师的从业经验等因素，检出率较低，不适于孢子菌肺炎的早期诊断。此外，目前耶氏肺孢子菌体外培养技术尚待完善，也导致难以通过体外培养进行鉴定。
目前耶氏肺孢子感染的分子生物学方法检测技术主要基于荧光定量PCR仪，如中国专利CN109988856A公开了一种基于LAMP扩增技术的耶氏肺孢子检测技术，但该方法灵敏度不高（约500000copies/mL）且依赖荧光定量PCR仪进行结果判断，不适于耶氏肺孢子菌感染的早期诊断。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耶氏肺孢子菌检测引物组、试剂盒及其应用，以解决现有技术中耶氏肺孢子菌检测灵敏度较低的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种耶氏肺孢子菌检测引物组，包括以下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物PJ F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物PJ FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物PJ BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物PJ LB；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物PJ B3。
优选的，所述引物PJ FIP的5’端标记有荧光基团；
所述引物PJ LB的5’端标记有生物素。
优选的，所述荧光基团为FAM或FITC。
本发明还提供了上述耶氏肺孢子菌检测引物组在制备检测耶氏肺孢子菌的试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，包括上述耶氏肺孢子菌检测引物组和检测试剂。
优选的，所述试剂盒中引物PJ FIP的终浓度为1.6~2.4μmol/L；
所述试剂盒中引物PJ BIP的终浓度为1.6~2.4μmol/L。
优选的，所述检测试剂包括等温扩增缓冲液、dNTP和Bst DNA聚合酶。
优选的，所述等温扩增缓冲液包括Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4和Tween-20。
优选的，所述试剂盒还包括胶体金免疫层析试纸条。
优选的，所述胶体金免疫层析试纸条包括底板、样品垫、判读区和吸水垫；所述样品垫、判读区和吸水垫依次设置于底板上；所述判读区上依次设置检测线和质控线；
所述检测线中包被有FAM抗体，所述FAM抗体的浓度为0.05~0.15mg/mL；
所述质控线中包被有biotin-BSA溶液，所述biotin-BSA溶液的浓度为1.5~3mg/mL。
本发明的有益效果：
本发明提供的耶氏肺孢子菌检测引物组灵敏度高、特异性强，检测限低至1000copies/mL，有助于耶氏肺孢子菌感染的早筛早诊，便于及时进行干预治疗和控制病情。
本发明提供的检测耶氏肺孢子菌的试剂盒采用恒温扩增-核酸胶体金层析法，可在35min内完成检测反应，结果判断简便；使用本发明提供的试剂盒单次检测费用低，对仪器设备要求低，适用于基层医疗单位，能够进行居家自测试，有助于深部真菌感染的早诊。
附图说明
图1为本发明重复检测结果图；
图2为本发明特异性检测结果图。
具体实施方式
除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本申请所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用，术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1-2”、“1-2和4-5”、“1-3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
本发明提供了一种耶氏肺孢子菌检测引物组，包括以下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物PJ F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物PJ FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物PJ BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物PJ LB；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物PJ B3。
所述引物组的靶标为耶氏肺孢子菌DHFR第441-643位核酸序列。
在本发明中，所述引物PJ FIP的5’端优选标记有荧光基团，所述荧光基团优选为FAM或FITC；所述引物PJ LB的5’端标记有生物素。
本发明还提供了上述耶氏肺孢子菌检测引物组在制备检测耶氏肺孢子菌的试剂盒中的应用，所述检测耶氏肺孢子菌的试剂盒优选为采用恒温扩增原理的试剂盒。
本发明还提供了一种检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，包括上述耶氏肺孢子菌检测引物组和检测试剂，所述试剂盒中引物PJ FIP的终浓度优选为1.6~2.4μmol/L，进一步优选为1.8~2.2μmol/L，所述试剂盒中引物PJ BIP的终浓度优选为1.6~2.4μmol/L，进一步优选为1.8~2.2μmol/L，所述试剂盒中引物PJ F3的终浓度优选为0.1~0.3μmol/L，进一步优选为0.15~0.25μmol/L，所述试剂盒中引物PJ LB的终浓度优选为0.5~0.8μmol/L，进一步优选为0.6~0.7μmol/L，所述试剂盒中引物PJ B3的终浓度优选为0.1~0.3μmol/L，进一步优选为0.15~0.25μmol/L。
在本发明中，所述检测试剂优选包括等温扩增缓冲液、dNTP和Bst DNA聚合酶，所述等温扩增缓冲液优选包括Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4和Tween-20，所述试剂盒中Tris-HCl的浓度优选为15~18mmol/L，进一步优选为16~17mmol/L；所述试剂盒中(NH4)2SO4的终浓度优选为7~9mmol/L，进一步优选为7.5~8.5mmol/L，所述试剂盒中KCl的终浓度优选为11~13mmol/L，进一步优选为11.5~12.5mmol/L，所述试剂盒中MgSO4的终浓度优选为1~3mmol/L，进一步优选为1.5~2.5mmol/L，所述试剂盒中Tween-20的终浓度优选为0.06~0.1%，进一步优选为0.07~0.09%，所述试剂盒中dNTP的终浓度优选为0.55~0.65mmol/L，进一步优选为0.58~0.62mmol/L，所述试剂盒中Bst DNA聚合酶的终酶活优选为0.2~0.3U/mL，进一步优选为0.24~0.28U/mL。
在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选包括以下步骤：①采用基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA；②试剂配置：取1.5mL离心管(DNase/RNase-Free，灭菌)配制反应体系，将等温扩增PCR反应液和引物混合液加入后，涡旋振荡10秒，离心待用，20μL/管分装至PCR反应管中（无菌和DNase/RNase-Free）；③加样：将提取的核酸转移10μL到每个PCR反应管中，盖紧管盖、离心、转移至PCR检测区；④PCR扩增：将PCR反应管放入等温扩增的样品槽中，60℃反应30min，得到样本扩增产物，测定样本扩增产物是否含有耶氏肺孢子菌DHFR第441-643位核酸序列，即可得知样品中是否含有耶氏肺孢子菌。
在本发明中，所述试剂盒还优选包括胶体金免疫层析试纸条，所述胶体金免疫层析试纸条优选包括底板、样品垫、判读区和吸水垫；所述样品垫、判读区和吸水垫依次设置于底板上；所述判读区上依次设置检测线和质控线；所述判读区优选包括结合垫和硝酸纤维素膜；样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次互相交错搭接成长条状后粘贴在底板上，底板为PVC板；结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，在硝酸纤维素膜上从吸水纸往结合垫方向依次设有C线（质控线）和T线（检测线），其中C线区包被有biotin-BSA溶液，T线区包被有FAM抗体。所述biotin-BSA溶液的浓度优选为1.5~3mg/mL，所述FAM抗体的浓度优选为0.05~0.15mg/mL，所述FAM抗体优选为兔抗FAM抗体；在本发明中，将所述试纸条装配进外壳中即制备成检测卡。
本发明所述试纸条的检测原理为：判读区内结合垫上喷涂有链霉亲和素标记的示踪标志物，示踪标志物为包括胶体金、乳胶微球、荧光微球在内的纳米颗粒，硝酸纤维素膜上C线包被biotin-BSA，T线包被兔抗FAM抗体；同时带有FITC/FAM和生物素标记的双链扩增产物流经试纸条时，可以被胶体金标记抗体和硝酸纤维素膜上特定的抗体识别和捕获，在相应的T线区（检测线）形成红色条带，而未结合的胶体金标记抗体随缓冲液层析至C线（质控线）区，被膜上固定的特定抗原识别和捕获，形成红色条带，从而完成对试纸条的质控。
结果判定标准：
C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品为阳性；
C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品为阴性；
C线没有出现红色的线，说明检测卡失效。
在本发明中，所述试剂盒还配置有常规的DNA提取试剂盒、层析缓冲液及备用的一次性移液管和反应管各五支以上；所述环介导等温扩增反应液，引物混合液和层析缓冲液各放置在独立的反应管中无菌密封。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
以耶氏肺孢子菌DHFR第441-643位核酸序列作为检测耶氏肺孢子菌的特异性检测靶标，根据靶标区域序列设计引物组，所述引物组的核苷酸序列如下（序列均为5'to 3'）：
引物PJ F3：GGAACATTCAAGGTTAAATCGTATT，如SEQ NO.1所示，位置为DHFR基因序列上第441-465位；
引物PJ FIP：GAGAACTCCGAAAATCAATAGGGAGCTACTGTAATTCACAATGAAGTT，如SEQNO.2所示，由两个在DHFR基因上相间隔的片段组合而成，分别位于基因序列上第469-492位和第509-532位；
引物PJ BIP：GTCATGTTTGCCTTGGAGAAAGCATTTATTTTACCCTGAGGAACTT，如SEQ NO.3所示，由两个在DHFR基因上相间隔的片段组成，分别位于第534-556位和第593-615位；
引物PJ LB：CATTCGGTTTTGGAGGCTTGG，如SEQ NO.4所示，位于DHFR基因区域第562-582位；
引物PJ B3：TCTCAAACTCGTAAATAAAACCA，如SEQ NO.5所示，位于DHFR基因序列上第621-643位。
其中，引物PJ FIP 5’端标记有FAM基团，引物PJ LB 5’端标记有生物素。
实施例2
与实施例1的不同之处仅在于，引物PJ FIP 5’端标记有FITC基团，引物PJ LB 5’端标记有生物素。
实施例3
配制试剂盒组分：包括实施例1引物组合的混合液、环介导等温扩增反应液、核酸胶体金检测卡；
环介导等温扩增反应液包含：2.5μL 10×等温扩增缓冲液、1.4μL dNTP（25mmol/L）、1μL Bst DNA聚合酶（8000U/mL）。
10×等温扩增缓冲液由Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4、Tween-20等构成，各组分在反应体系中的配比如下：
引物PJ F3：0.2μmol/L；
引物PJ FIP：1.6μmol/L；
引物PJ BIP：1.6μmol/L；
引物PJ LB：0.67μmol/L；
引物PJ B3：0.2μmol/L；
dNTP：0.58mmol/L；
Tris-HCl：16.67mmol/L；
(NH4)2SO4：8.33mmol/L；
KCl：12.5mmol/L；
MgSO4：1.67mmol/L；
Tween-20：0.08%；
Bst聚合物：0.27U/mL。
核酸胶体金检测卡为市售，例如，由江苏猎阵生物科技有限公司制备，货号为HDu01。
实施例4
采用基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA；
试剂配置：选用实施例3中的试剂盒进行实验，取1.5 mL离心管(DNase/RNase-Free，灭菌)配制反应体系，环介导等温扩增PCR反应液和引物组合的混合液加入后，涡旋振荡10秒，离心待用，20μL/管分装至PCR反应管中（无菌和DNase/RNase-Free）。
加样：将提取的核酸转移10μL到每个PCR反应管中，盖紧反应管管盖、经过离心后转移至PCR检测区。
PCR扩增：将PCR反应管放入等温扩增的样品槽中，60℃反应30min。
准备检测卡：将检测卡从铝箔袋中取出，放置于干燥的水平台面上。
加样检测：使用移液器取20μL样本扩增产物至检测卡加样孔中，再加入100μL层析缓冲液，2min内读取结果。
结果判定标准：
C线出现红色的线，同时T线出现红色的线，说明被检样品为阳性；
C线出现红色的线，同时T线没有出现红色的线，说明被检样品为阴性；
C线没有出现红色的线，说明检测卡失效。
实施例5
与实施例3的不同之处仅在于，将反应体系中引物PJ FIP的终浓度替换为2.4μmol/L。
实施例6
与实施例3的不同之处仅在于，将反应体系中引物PJ BIP的终浓度替换为2.4μmol/L。
实施例7
与实施例3的不同之处仅在于，将反应体系中引物PJ FIP的终浓度替换为2.4μmol/L、引物PJ BIP的终浓度替换为2.4μmol/L。
实验例1
将实施例1所示的引物，按照实施例4中的方法对耶氏肺孢子菌标准菌株（Pneumocystis jirovecii，购自美国ATCC保藏中心，No.ATCC MYA-5006SD）进行验证检测，耶氏肺孢子菌样本的浓度约为10000 copies/mL，重复检测10次，检测结果如图1所示。
由图1可以看出，10次检测的结果均为耶氏肺孢子菌阳性，且显色均一，表明本发明组合具有良好的检测一致性。
实验例2 耶氏肺孢子菌检测试剂盒的检测灵敏度
将耶氏肺孢子菌标准菌株（Pneumocystis jirovecii，购自美国ATCC保藏中心，No.ATCC MYA-5006SD）制备成浓度为5000 copies/mL、2500 copies/mL、1000 copies/mL、500 copies/mL和250 copies/mL的待测样本，按照实施例4中的方法进行检测，每个梯度重复测试5次，记录结果，以全部检出时的样本浓度为检测限，结果如下表1所示（“+”为阳性，“-”为阴性）：
表1 灵敏度检测结果
由结果可知，5000 copies/mL、2500 copies/mL和1000 copies/mL浓度样本全部检出，500 copies/mL和250 copies/mL浓度样本概率检出。由此可以看出，本发明的组合试剂对于耶氏肺孢子菌的检出限为1000 copies/mL，灵敏度较高，可以用于耶氏肺孢子菌检测。
实验例3 耶氏肺孢子菌检测试剂盒的特异性
使用购自美国ATCC保藏中心的耶氏肺孢子（Pneumocystis jirovecii，PJ，No.ATCC MYA-5006SD）、烟曲霉（Aspergillus fumigatus，AF，No. ATCC 1022DQ）、黄曲霉菌（Aspergillus flavus，AFla，No.ATCC 9643DQ）、黑曲霉（Aspergillus niger，AN，No.ATCC1015DQ）、米曲霉（Aspergillus oryzae，AO，No.ATCC 1011）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans，ANi，No.ATCC 10074）、格特隐球菌（Cryptococcus gatti，CG，No.ATCC MYA-4562）、新生隐球菌（Cryptococcus neoformans，CN，No.ATCC 32045）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，SP，No.ATCC 49619DQ）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA，No.ATCC 29213）、百日咳杆菌（Bordetella pertussis，BP，No.ATCC 9797DQ）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，HI，No.ATCC 51907DQ）、白色念珠菌（Candida albicans，CA，No.ATCC 10231DQ）、近平滑念珠菌（Candida parapsilosis，CP，No.ATCC22019DQ）、热带念珠菌（Candida tropicalis，CT，No.ATCC 66029DQ）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，SC，No.ATCC MYA-4941DQ），共16例样本进行特异性试验。各待测样本的浓度为5000copies/mL，按照实施例4的方法进行检测。
检测结果如图2所示，16例样本的检测结果中，仅耶氏肺孢子菌为阳性，其余皆为阴性，显示本发明组合可以排除不同病原体的干扰，精准的检测出耶氏肺孢子菌。
实验例4 不同引物组对比
引物组合（核苷酸序列和修饰方式）是影响核酸检测平台检测能力的关键性因素，要求所用引物组合具有较高的特异性和灵敏度，故优选引物组合尤为重要。在本发明试剂盒的研发阶段，分别进行了不同引物组合、不同修饰方式的比较。
本发明设计了以下备选引物，（序列均为5'to 3'）：
耶氏肺孢子菌备选引物组合1位于DHFR序列的第107-297位核酸序列，具体地：
PJ F3-1引物的位置为DHFR序列上第107-127位，序列为：TTAGTCGAGTTACATCTGGTT，如SEQ NO.6所示；
PJ FIP-1引物由两个相间隔的片段组合而成，分别位于DHFR序列上第129-149位和第169-188位，序列为：TCCCATGTCTTACGACCCATGCTAGTTACTCGTTCTACTGG，如SEQ NO.7所示；
PJ BIP-1由两个在DHFR序列上相间隔的片段组成，分别位于核酸序列上第191-212位和第249-270位，序列为：GTCTTCCTGCTCATTCTAGGCCTTACCCTAAATCAAGAACCTCT，如SEQNO.8所示；
PJ B3-1引物位于DHFR序列上第275-297位。序列为：CAACTTTTGCAATTCAATTGACA，如SEQ NO.9所示；
耶氏肺孢子菌备选引物组合2位于DHFR序列的第76-297位核酸序列，具体地：
PJ F3-2引物的位置为DHFR序列上第76-96位，序列为CCATGGAAATTGAAGTCTGAT，如SEQ NO.10所示；
PJ FIP-2引物由两个相间隔的片段组合而成，分别位于DHFR上第102-125和第147-171位，序列为CATCAAAACAACATTCATCTGACCAGTTTTTTAGTCGAGTTACATCTGG，如SEQ NO.11所示；
PJ BIP-2由两个在DHFR上相间隔的片段组成，分别位于核酸序列第180-201位和第243-261位，序列为GACATGGGAAAGTCTTCCTGCTATCAAGAACCTCTTGACGA，如SEQ NO.12所示；
PJ LB-2引物位于DHFR上第202-226位，序列为CATTCTAGGCCTCTTAAGAATCGAA，如SEQ NO.13所示。
PJ B3-2引物位于DHFR上第275-297位，序列为CAACTTTTGCAATTCAATTGACA，如SEQNO.14所示。
其中，各备选引物组合反应体系中F3引物和B3引物浓度都为0.2μmol/L、FIP引物和BIP引物浓度都为1.6μmol/L，LF引物（如有）和LB引物（如有）浓度都为0.67μmol/L；反应体系中其它组分及浓度与实施例3相同。
在实施例1的基础上结合不同修饰位点的比较方案，包括：
实施例1（引物PJ FIP 5’端标记FAM基团，引物PJ LB 5’端标记生物素）；
备选修饰方案1（引物PJ BIP 5’端标记FAM基团，引物PJ LB 5’端标记生物素）；
备选修饰方案2（引物PJ FIP 5’端标记FAM基团，引物PJ BIP 5’端标记 生物素）。
以耶氏肺孢子菌标准菌株作为待测样本进行检测，结果如表2所示：
表2 各引物组合检测限检测结果
结果显示，备选引物组1的检出限为5000 copies/mL，而备选修饰方案1、备选修饰方案2和备选引物组2的检出限都为2500 copies/mL。综上，本发明组合的检测限最低，灵敏度最高。
实验例5 不同引物浓度对比
鉴于LAMP反应体系中FIP和BIP的引物浓度对检测灵敏度影响较大，对本发明引物组进行FIP和BIP的不同浓度检测对比实验，以期获得最适反应浓度，在实施例3的基础上调整引物FIP和引物BIP的浓度，如下表3所示：
表3 不同引物浓度实验组
各组合以耶氏肺孢子菌标准菌株（1000copies/mL）作为待测样本进行检测，重复检测10次，检测方法同实施例4，结果如表4所示：
表4 不同引物浓度检测结果
由表4可知，组合5、6、8、9，即反应体系中FIP和BIP浓度均不低于1.6μmol/L时，才能稳定检出1000 copies/mL的耶氏肺孢子菌，因此，结合试剂成本考虑，反应体系中FIP和BIP引物浓度定为1.6μmol/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种耶氏肺孢子菌检测引物组，其特征在于，包括以下引物：
核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物PJ F3；
核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的引物PJ FIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物PJ BIP；
核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的引物PJ LB；
核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物PJ B3。
2.根据权利要求1所述的耶氏肺孢子菌检测引物组，其特征在于，所述引物PJ FIP的5’端标记有荧光基团；
所述引物PJ LB的5’端标记有生物素。
3.根据权利要求2所述的耶氏肺孢子菌检测引物组，其特征在于，所述荧光基团为FAM或FITC。
4.权利要求1~3任一项所述的耶氏肺孢子菌检测引物组在制备检测耶氏肺孢子菌的试剂盒中的应用。
5.一种检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~3任一项所述的耶氏肺孢子菌检测引物组和检测试剂。
6.根据权利要求5所述的检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中引物PJ FIP的终浓度为1.6~2.4μmol/L；
所述试剂盒中引物PJ BIP的终浓度为1.6~2.4μmol/L。
7.根据权利要求5所述的检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括等温扩增缓冲液、dNTP和Bst DNA聚合酶。
8.根据权利要求7所述的检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述等温扩增缓冲液包括Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、MgSO4和Tween-20。
9.根据权利要求5所述的检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括胶体金免疫层析试纸条。
10.根据权利要求9所述的检测耶氏肺孢子菌的试剂盒，其特征在于，所述胶体金免疫层析试纸条包括底板、样品垫、判读区和吸水垫；所述样品垫、判读区和吸水垫依次设置于底板上；所述判读区上依次设置检测线和质控线；
所述检测线中包被有FAM抗体，所述FAM抗体的浓度为0.05~0.15mg/mL；
所述质控线中包被有biotin-BSA溶液，所述biotin-BSA溶液的浓度为1.5~3mg/mL。
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