CN102329790A - 双标记核酸恒温扩增方法及检测试纸条 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种双标记核酸恒温扩增方法及试纸条，该方法通过先合成内引物、外引物和环引物，用生物素和荧光素标记内引物或/和环引物，将标记引物加入LAMP反应体系中恒温扩增，得到双标记的核酸恒温扩增产物。试纸条包括支撑层、核酸扩增产物吸附层，核酸扩增产物吸附层粘贴于支撑层上，以生物素亲和蛋白及异硫氰酸荧光素抗体分别在纤维素层上印制检测印迹和对照印迹。本发明的试纸条检测特异性强、灵敏度高、速度快，既能直观检测LAMP扩增产物，又能克服胶体金检测试纸特异性相对较低的缺点，可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于环介导等温扩增方法及试纸条，特别是涉及一种双标记核酸扩增方法及其快速检测试纸条。
背景技术
随着现代分子生物学和分子技术的发展，研究开发了许多核酸扩增技术。其中核酸环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），由于其具有特异性强、灵敏度高、反应速度快等特点，在核酸特异性扩增和检测领域具有取代PCR的趋势，成为生命科学领域研究的热点之一。核酸环介导扩增的主要原理是基于对靶序列的6个区域设计2对特异引物，利用一种链置换 DNA 聚合酶（Bst DNA polymerase），在65℃左右的恒温条件下保温约60分钟，完成核酸扩增反应，在存在环引物的情况下，扩增时间可进一步缩短为40分钟。用于LAMP扩增的3对引物对应于靶基因的8个区段，因而具有比PCR 更高的特异性，同时具备不需要热循环、扩增效率更高、不需要特殊仪器等优点。
目前LAMP产物的检测经常采用电泳法和浊度法，需要用高致癌性的荧光染料溴化乙锭，不仅危害操作人员的健康，而且无法排除假阳性的问题，限制了LAMP技术的推广使用。
发明内容
本发明要解决的技术问题：克服现有技术的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、速度快的双标记核酸恒温扩增方法；
还提供了一种用双标记核酸恒温扩增产物得到的简易检测试纸条，该试纸条可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测。
本发明的技术方案：
一种双标记核酸恒温扩增方法，根据检测目标设计LAMP 引物，进行内引物、外引物和环引物的合成；用生物素和荧光素分别标记两种内引物，或分别标记两种环引物，或分别标记一种内引物和一种环引物，将标记引物加入LAMP反应体系中恒温扩增，得到双标记核酸恒温扩增产物。
所述标记是标记内引物各引物的5’端；所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明。
所述恒温扩增是在59-65℃温度下、恒温扩增5-20min。
一种含有双标记核酸恒温扩增产物的检测试纸条，含有支撑层、吸附层，支撑层为不吸水薄片条，吸附层粘贴于支撑层上，所述吸附层从测试端依次为测试端纤维层、纤维素膜层和手柄端吸水材料层，所述纤维素膜层含有权利要求1所述的双标记核酸恒温扩增产物，用生物素亲和蛋白及荧光素抗体分别在纤维素膜层上印制检测印迹和对照印迹，或用生物素亲和蛋白及荧光素金标抗体分别在纤维素膜层上印制检测印迹和对照印迹，检测印迹和对照印迹平行排列为“ ”。
所述不吸水薄片条为硬质塑料片条或不吸水硬纸片条，所述纤维素膜层是用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成，所述手柄端吸水材料层是用吸水纸制成，所述测试端纤维层是用玻璃棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成。
所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明。
所述测试端吸附纤维层、吸水材料层上均覆盖有保护膜，在测试端纤维层的保护膜上印制有样品标记线，该标记线距离测试端0.5cm。
所述的检测试纸条在检测各种致病性微生物或病原体的特异性基因中的应用。
本发明的积极有益效果：
１. 本发明的双标记核酸恒温扩增方法具有下列优点：
（1）特异性强，用于LAMP扩增的3对或2对引物分别对应于靶基因的8个或6个区段，理论上可以检测出一个碱基差异的序列，因而具有比PCR 更高的特异性；
（2）灵敏度高，LAMP能在模板DNA纯度很低的情况下进行扩增，很少受培养介质和生物学物质的影响，纯化步骤可以忽略；
（3）速度快，LAMP是恒温扩增反应，没有 PCR反应中温度变化的耗时，在30～60min内即可完成反应过程，10 min内即可完成扩增反应，结合本发明中试纸条检测手段，试纸检测可在5min内完成，加上前处理过程，可在1小时左右完成对样品的检测；
（4）易推广，LAMP反应是一个恒温扩增过程，不用控制温度变化，只需简单的恒温器，也不需要昂贵的 PCR仪，对操作人员的分子生物学技术要求不高。
２.本发明的检测试纸条可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测，具体包括：
可用于人致病性病原体的检测，包括牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, Pg）、福赛坦氏菌（Tannerella forsythia，Tf〕、齿垢密螺旋体（Treponema denticola，Td）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、伴放线放线杆菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aa）、变形链球菌（Streptococcus mutans）、远缘链球菌（Streptococcus sobrinus）、伴放线放线杆菌（Aggregatibacter ( Actinobacillus) actinomycetemcomitans）、直肠弯曲菌（Campylobacter rectus）、啮蚀艾肯菌（Eikenella corrodens）、具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）、解肝素普氏菌（Prevotella intermedia）和嗜沫嗜血杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）、假结核耶尔森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）、由结核分枝杆菌（Mycobacteria tuberculosis）、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）、非洲分枝杆据（Mycobacterium africanum）和田鼠分枝杆菌（Mycobacterium microti）组成的结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex）、鸟结核分枝杆菌（Mycobacterium avium）、胞内分支杆菌（Mycobacteriumintracellulare）、堪萨斯分支杆菌（Mycobacteriumkansasii）、戈登分支杆菌（Mycobacteriumgastri）、军团菌属（Legionella species）、志贺氏菌（Shigella）、侵袭性大肠杆菌（enteroinvasive Escherichia coli）、产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC）和大肠杆菌普通株（common strains of Escherichia coli）、肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、艰难梭菌（Clostridium difficile,C.d）、百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、幽门螺旋杆菌（helicobacter pylori, H.pylori或Hp）(Minami et al, 2006)、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）和副流感嗜血杆菌（Haemophilus parainfluenzae）、产vero毒素大肠杆菌（toxin-producing Escherichia coli）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA）和产肠毒素金黄色葡萄球菌（enterotoxigenic Staphylococcus aureus）、产毒素霍乱弧菌（cholera toxin-producing Vibrio cholerae）、豚鼠气单胞菌（Aeromonas caviae）、类鼻疽伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pseudomallei）、空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）、结肠弯曲杆菌（Campylobacter coli)和胎儿弯曲杆菌（Campylobacter fetus）、沙门氏菌O9（Salmonella O9）、布鲁氏菌（Brucella spp）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、人类疱疹病毒6 型（human herpesvirus）、急性呼吸综合征 (SARS)冠状病毒（severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus）、水痘-带状疱疹病毒（varicella-zoster virus, VZV）、流感病毒A型（human influenza A viruses）和流感病毒B型（human influenza B viruses）、腮腺炎病毒（mumps virus）、登革热病毒（dengue virus）、麻疹病毒（measles virus）、人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus, RSV）、 流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、细胞巨化病毒（cytomegalovirus）、诺如病毒(norovirus, NV)、风疹病毒（rubella virus）、基孔肯雅病毒（Chikungunya virus）、腺病毒（adenovirus）、埃博拉病毒（Ebola virus）、甲型肝炎病毒（Hepatitis A Virus，HAV）、乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）、人细小病毒B19型（human parvovirus B19）、爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr Virus, EBV）、猴痘病毒（Monkeypox Virus）、人类免疫缺陷病毒（Human immunodeciency virus type 1, HIV-1）、兽棚病毒(flock house virus, FHV)和导致肾移植患者发生多瘤病的病毒（BK virus）、非洲锥体虫（African trypanosomes）、布氏冈比亚锥虫（Trypanosoma brucei gambiense）、布氏罗得西亚锥虫（Trypanosoma brucei rhodesiense）、恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、肺孢子虫(Pneumocystis pneumonia)、恙虫东方体（Orientia tsutsugamushi）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）等。
可用于鱼贝类致病性病原体的检测，包括对虾白斑综合征病毒（white spot syndrome virus, WSSV）、桃拉综合征病毒（Taura syndrome virus）和斑节对虾的黄头病毒（Yellow head virus）、鱼虹彩病毒（fish iridovirus）、新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus, SGIV）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）红体病虹彩病毒（turbot reddish body iridovirus, TRBIV）、传染性造血器官坏死症病毒（infectious hematopoietic necrosis virus, IHNV）、锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus, KHV）、皮下及造血组织坏死病毒（infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV）、罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus, MrNV）、小病毒颗粒（extravsmall virus, XSV）、锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus, KHV）、鲤春血症病毒（spring viraemia of carp virus, SVCV）、诺如病毒（norovirus）、迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）、叉尾鮰爱德华菌（Edwardsiella ictaluri）、柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）、脚鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolae）、鲁克氏耶尔森氏菌（Yersinia ruckeri）、鲑鱼肾杆菌（Renibacterium salmoninarum）、黑美人弧菌（Vibrio nigripulchritudo）、微孢子虫（Microsporidia）、粘孢子虫（Tetracapsuloides bryosalmonae）和脑粘体虫（Myxobolus cerebralis）等。
可用于农牧养殖业中病原体的检测，包括猪水泡病病毒（Swine Vesicular Disease Virus, SVDV）、猪圆环病毒（porcine circovirus type 2, PCV2）、猪瘟（classical swine fever virus, CSFV）、猪繁殖与呼吸综合症病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）、猪细小病毒（porcine parvovirus, PPV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、H5N1禽流感病毒（H5N1 avian influenza virus）、H9禽流感病毒（H9 avian influenza virus）、鸭瘟病毒（duck plagues virus, DPV）犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus）、犬细小病毒（canine parvovirus）、牛白血病病毒（bovine leukemia virus, BLV）羊传染性脓疱病毒（orf virus）、锥体虫（trypanosomes）、犬吉氏巴贝斯虫（Babesia gibsoni）、马泰勒虫（Theileria equi）、驽巴贝斯虫（Babesia caballi）、环形泰勒焦虫（Theileria annulata）、吕氏泰勒虫（Theileria luwenshuni, UTRlu8）、尤氏泰勒虫（Theileria uilenbergi, UTRu6）、牛巴贝西虫属寄生虫（bovine Babesia parasites）、隐孢子虫（Cryptosporidium）、绦虫（Taenia）、副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis）、钩端螺旋体（Leptospira）等。
可用于植物病源微生物的检测，包括番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl virus, TYLCV）、番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus,TSWV）、病毒马铃薯病毒Y型（Potato virus Y, PVY）、李树和桃树的李痘病毒（Plum pox virus, PPV）、柑橘青果病细菌（Citrus Greening Organism）、柑橘黄龙病病原类细菌（Liberibacter Species Associated with Citrus Huanglongbing）、茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、青枯菌（Ralstonia solanacearum）及疫霉属的栎树猝死病菌（Phytophthora ramorum）等。
可用于食品中病源微生物的检测，包括沙门氏菌（Salmonella）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）、弯曲杆菌属（Campylobacter spp.）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、志贺氏菌（Shigella. Spp）和大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O 157 :H 7 ）等。
3. 本发明的试纸条使用时检测结果形象、直观、准确，试纸条同时显示绿色荧光检测印迹“
”和对照印迹“
”，或显示红色检测印迹“”和对照印迹“
”，则检测结果为阳性，表示样品中含有待检物质；若只显示绿色荧光或红色对照印迹“
”，则检测结果为阴性，表示样品中不含待检物质。即在纤维素膜上检测线位置显示一条绿色或红色检测印迹“”，表示待检样品中含有特异性核酸片段。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性的误判。
4.本发明的检测试纸条，既能直观检测LAMP扩增产物，又能克服胶体金检测试纸特异性相对较低的缺点，广泛适用于专业化验、海关检疫、卫生防疫、基层卫生医疗部门、食品质量监督部门和食品企业等各层次的需求，具有较好的市场前景和经济效益。
附图说明
图1：本发明的双标记核酸恒温扩增检测试纸条结构示意图。
图2：本发明的双标记核酸恒温扩增检测试纸条俯视结构示意图。
图中1为支撑层，2为测试端纤维层，3为纤维素膜层，4为手柄端吸水材料层，5为检测印迹，6为对照印迹，7为测试端纤维层的保护膜，8为手柄端吸水材料层的保护膜，9为样品标记线。
具体实施方式
本发明的双标记核酸恒温扩增及简易检测试纸条可广泛用于各种致病性微生物或病原体中特异性基因的检测，下面举例说明。
实施例1：食品中志贺氏菌（Shigella）特异性基因ipaH的扩增方法及检测试纸条
１．食品中志贺氏菌特异性基因ipaH的扩增方法
（1）引物设计及标记
通过查阅文献和用 BLAST 软件分析筛选出志贺氏菌特异性基因ipaH的232－437位核酸序列，针对该片段的八个位点（这八个位点分别是：233－254bp、256－273 bp、275－294 bp、302－323bp、341－362bp、363－382bp、386－405bp和420－438bp）设计出LAMP 引物并合成，引物设计通过LAMP专用引物设计软件完成，得到如下引物：
正向外引物 F3-ipaH 5’-CATGGCTGGAAAAACTCAGTGC-3’
反向外引物 B3-ipaH 5’-GAGGCGGAACATTTCCCTG-3’
正向内引物
FIP-ipaH 5’-TCCTCACAGCTCTCAGTGGCATTTTTCTGCGGAGCTTCGACAG-3’
反向内引物
BIP-ipaH 5’-ATCTCCGGAAAACCCTCCTGGTTTTTAGCGCCGGTATCATTATCGA-3’
正向环引物LF-ipaH 5’-AGCAGCAACAGCGAAAGACT-3’
反向环引物LB-ipaH 5’-CCATCAGGCATCAGAAGGCC-3’。
将生物素和异硫氰酸荧光素分别标记正向内引物FIP和反向内引物BIP的5’端。
（2）反应体系（反应总体积为 25μl）见下表。
| 成分 | 母液浓度 | 用量（μl） | 终浓度 |
| 核酸模板 | － | 2.0 | － |
| F3-ipaH | 20μM | 1 | 0.8 μM |
| B3-ipaH | 20μM | 1 | 0.8 μM |
| FIP-ipaH | 40μM | 1 | 1.6 μM |
| BIP-ipaH | 40μM | 1 | 1.6 μM |
| LF-ipaH | 5μM | 1 | 0.2 μM |
| LB-ipaH | 5μM | 1 | 0.2 μM |
| 甜菜碱（betaine） | 5M | 5 | 1.0 M |
| dNTP | 150 mM | 3 | 1.2 mM |
| MgSO4 | 100 mM | 0.5 | 4 mM |
| Bst DNA Polymerase Buffer | 10× | 2.5 | － |
| Bst DNA Polymerase | 8U/μl | 1 | 0.32 U/μl |
| ddH2O | － | 5 | － |
（3）扩增反应 在温度为 65℃ 的恒温水浴锅保温约 10分钟。
（4）产物检查 将固定有生物素亲和蛋白avidin的双标记核酸恒温扩增检测试纸条插入到上述反应体系中，层析5分钟，荧光灯下检测。若检测试纸条同时显示绿色荧光检测印迹“”和对照印迹“”，表示样品中含有志贺氏菌的特异性基因ipaH。若只显示绿色荧光对照印迹“
”，表示样品中不含待检物质。
用于上述双标记核酸恒温扩增检测的试纸条
参见图１、图２，图中支撑层1为不吸水薄片条，可采用塑胶薄片条制成，核酸扩增产物吸附层由测试端纤维层2、纤维素膜层3、手柄端吸水材料层4组合而成，从测试端纤维层2开始，到手柄端吸水材料层4依次粘贴在支撑层1上，其中测试端纤维层2用玻璃纤维棉（即玻璃棉），纤维素膜层3采用硝酸纤维素膜，手柄端吸水材料层4采用吸水纸制成，测试端纤维层2、纤维素膜层3、手柄端吸水材料层4各层之间交界处纤维互相交叉渗透，试纸条总长度为8cm，宽度0.48cm，5为生物素亲和蛋白溶液在纤维素膜上印制的检测印迹“
”， 6为异硫氰酸荧光素抗体溶液在纤维素膜上印制的对照印迹“
”， 两印迹组合为“
”，7和8分别为覆盖在测试端纤维层2和手柄端吸水材料层4的保护膜，9为样品标记线。
检测反应原理：
当分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素的内引物一起对模板进行环介导恒温扩增后，生物素和异硫氰酸荧光素被同时标记在核酸扩增产物上。当用上述试纸条进行检测时，由于生物素与其亲和蛋白的特异性结合，将同时带有异硫氰酸荧光素的核酸扩增产物结合在检测印迹“
”处，在荧光灯下异硫氰酸荧光素发出绿色荧光；而游离的带有异硫氰酸荧光素的引物由于没有标记生物素不能结合在检测印迹“”处，通过异硫氰酸荧光素与其抗体的特异性反应而结合在对照印迹“”处，在荧光灯下异硫氰酸荧光素发出绿色荧光。
实施例2：罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus, MrNV）RNA-2的扩增方法及及检测试纸条。
1．罗氏沼虾诺达病毒RNA-2的扩增方法
（1）引物设计及标记
通过查阅文献和用 BLAST 软件分析，筛选出罗氏沼虾诺达病毒特异性基因片段RNA-2，针对该片段的八个位点（这八个位点分别是：1976-1994bp、1997-2007bp、2007-2032bp、2057-2076bp、2107-2136bp、2171-2147bp、2195-2178bp和2198-2216bp）设计出LAMP 引物并合成，引物设计通过LAMP专用引物设计软件完成，得到如下引物：
正向外引物 F3－RNA-2 5’- CCAATATGAACCGGGAGTG-3’
反向外引物 B3－RNA-2 5’- GGGTTCAACCTTGAGTTCC-3’
正向内引物
FIP－RNA-2 5’- TCAGCCTAACTGCTGCGTATTTTTGG TTAAGAGTGGTAGTCCAA-3’
反向内引物
BIP－RNA-2 5’- TGGCTTAAGTTTCGGCGACGTTTTAC CAAGTTGTTCGACGAC-3’
正向环引物 LF－RNA-2 5’- TGACAAGCAATATCAACTCAGATGG-3’
反向环引物 LB－RNA-2 5’- TGATCATCAGCCAACAACTTTCGAAG-3’。
用生物素和异硫氰酸荧光素分别标记正向环引物LF和反向环引物LB的5’端。
（2）反应体系（反应总体积为 25μl )见下表。
| 成分 | 母液浓度 | 用量（μl） | 终浓度 |
| 核酸模板 | － | 2.0 | － |
| F3－RNA-2 | 20μM | 1 | 0.8 μM |
| B3－RNA-2 | 20μM | 1 | 0.8 μM |
| FIP－RNA-2 | 40μM | 1 | 1.6 μM |
| BIP－RNA-2 | 40μM | 1 | 1.6 μM |
| LF－RNA-2 | 5μM | 1 | 0.2 μM |
| LB－RNA-2 | 5μM | 1 | 0.2 μM |
| 甜菜碱 | 5M | 5 | 1.0 M |
| dNTP | 150 mM | 3 | 1.2 mM |
| MgSO4 | 100 mM | 0.5 | 4 mM |
| Bst DNA Polymerase Buffer | 10× | 2.5 | － |
| Bst DNA Polymerase | 8U/μl | 1 | 0.32 U/μl |
| Reverse transcriptase | 0.25 U/μl | 1 | 0.01 U/μl |
| ddH2O | － | 4 | － |
（3）扩增反应 在温度为60℃ 的恒温水浴锅保温约 15分钟。
（4）产物检查 将固定有生物素亲和蛋白avidin的试纸条插入到上述反应体系中，层析5分钟，荧光灯下检测，检测试纸条显示红色检测印迹“”和对照印迹“
”，则检测结果为阳性，表示样品中含有罗氏沼虾诺达病毒的特异基因片段RNA-2。
．上述的双标记核酸恒温扩增检测试纸条
和实施例1基本相同，不同之处在于：图中支撑层1为不吸水薄片条，可采用不吸水硬质片材制成，测试端纤维层2使用尼龙膜，纤维素膜层3采用纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成，手柄端吸水材料层4采用滤纸制成，5为生物素亲和蛋白溶液在纤维素膜上印制检测印迹“”，6为异硫氰酸荧光素金标抗体溶液在纤维素膜上印制的对照印迹“
”， 两印迹组合为“
”。
检测反应原理：当分别标记有生物素和异硫氰酸荧光素的内引物或环引物与其他引物一起对模板进行环介导恒温扩增后，生物素和异硫氰酸荧光素被同时标记在核酸扩增产物上。当用上述试纸条进行检测时，由于生物素与其亲和蛋白的特异性结合，将同时带有异硫氰酸荧光素的核酸扩增产物结合在检测印迹“
”处，在荧光灯下直接显示红色检测印迹“”；而游离的带有异硫氰酸荧光素的引物由于没有标记生物素不能结合在检测印迹“
”处，通过异硫氰酸荧光素与其抗体的特异性反应而结合在对照印迹“”处，则显示红色对照印迹“
”。
实施例3：人及动物血液中布氏锥虫（Trypanosoma brucei gambiense）基因片段5.8S-ITS2的扩增方法及检测试纸条。
1．人及动物血液中布氏锥虫基因片段5.8S-ITS2的扩增方法
（1）引物设计及标记
通过查阅文献和用 BLAST 软件分析筛选出布氏锥虫（Trypanosoma brucei gambiense）基因片段5.8S-ITS2，针对该片段的六个位点设计出LAMP 引物并合成，引物设计通过LAMP专用引物设计软件完成，得到如下引物：
正向外引物 F3－5.8S-ITS2 5’- AAGCTCTCTCGAGCCATC-3’
反向外引物 B3－5.8S-ITS2 5’- TGACATACACAATATGTGCGA-3’
正向内引物 FIP－5.8S-ITS2
5’- GCGTTGAACAACACAAAATAGGTGATGCCACATTTCTCAGTGT-3’
反向内引物
BIP-5.8S-ITS2 5’-CCACCTCTTCTCCTCGTGTGGAAGAAAGAGATGAAAGATATCGTA-3’。
用生物素和异硫氰酸荧光素分别标记上述内引物FIP和BIP的5’端。
（2）反应体系（反应总体积为 25μl )见下表。
| 成分 | 母液浓度 | 用量（μl） | 终浓度 |
| 核酸模板 | － | 2.0 | － |
| F3－5.8S-ITS2 | 20μM | 1 | 0.8 μM |
| B3－5.8S-ITS2 | 20μM | 1 | 0.8 μM |
| FIP－5.8S-ITS2 | 40μM | 1 | 1.6 μM |
| BIP－5.8S-ITS2 | 40μM | 1 | 1.6 μM |
| LF－5.8S-ITS2 | 5μM | 1 | 0.2 μM |
| LB－5.8S-ITS2 | 5μM | 1 | 0.2 μM |
| 甜菜碱 | 5M | 5 | 1.0 M |
| dNTP | 150 mM | 3 | 1.2 mM |
| MgSO4 | 100 mM | 0.5 | 4 mM |
| Bst DNA Polymerase Buffer | 10× | 2.5 | － |
| Bst DNA Polymerase | 8U/μl | 1 | 0.32 U/μl |
| Reverse transcriptase | 0.25 U/μl | 1 | 0.01 U/μl |
| ddH2O | － | 5 | － |
（3）扩增反应 在60℃恒温水浴8分钟。
（4）产物检查 将固定有生物素亲和蛋白avidin的试纸条插入到上述反应体系中，层析5分钟，荧光灯下检测，检测线位置显示荧光“
”印迹，表示样品中含有布氏锥虫（Trypanosoma brucei gambiense）基因片段5.8S-ITS2。
上述的双标记核酸恒温扩增检测试纸条结构
和实施例1基本相同，不同之处在于：测试端纤维层2使用聚酯膜，纤维素膜层3采用羧化纤维素膜制成，5为生物素亲和蛋白溶液在纤维素膜上印制检测印迹“
”，6为异硫氰酸荧光素抗体溶液在纤维素膜上印制的对照印迹“”。
实施例4：食品中单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）特异性基因prfA的扩增方法及检测试纸条。
（1）引物设计及标记
通过查阅文献和用 BLAST 软件分析筛选出单增李斯特菌特异性基因prfA序列，针对该片段设计出LAMP 引物并合成，引物设计通过LAMP专用引物设计软件完成，得到如下引物：
正向外引物 F3-prfA 5’- CTGGTTACACTAAATATGTATTTGC -3’
反向外引物 B3-prfA 5’- GCCGTGGATGTTATCGTAT -3’
正向内引物
FIP-prfA 5’-AGGTTTTGCTTGAGATTCAGAGATTTTTTAATCTCCCTTCCACGTACT -3’
反向内引物
BIP－prfA 5’- TTGACTATGGTAGCGGAATTTCTCTTTTTTAACGCCATTGTCTTGC -3’
正向环引物LF－prfA 5’- GTAGTGCTAGCGTATTGTGCG -3’
反向环引物LB－prfA 5’- GGTATCTACGTTGGTAATGGTCAA -3’。
用生物素和异硫氰酸荧光素分别标记标记内引物FIP（或BIP）和环引物LF（或LB）的5’端。
（2）反应体系（反应总体积为 25μl )见下表。
| 成分 | 母液浓度 | 用量（μl） | 终浓度 |
| 核酸模板 | － | 2.0 | － |
| F3－prfA | 20μM | 1 | 0.8 μM |
| B3－prfA | 20μM | 1 | 0.8 μM |
| FIP－prfA | 40μM | 1 | 1.6 μM |
| BIP－prfA | 40μM | 1 | 1.6 μM |
| LF－prfA | 5μM | 1 | 0.2 μM |
| LB－prfA | 5μM | 1 | 0.2 μM |
| 甜菜碱 | 5M | 5 | 1.0 M |
| dNTP | 150 mM | 3 | 1.2 mM |
| MgSO4 | 100 mM | 0.5 | 4 mM |
| Bst DNA Polymerase Buffer | 10× | 2.5 | － |
| Bst DNA Polymerase | 8U/μl | 1 | 0.32 U/μl |
| ddH2O | － | 5 | － |
（3）扩增反应
在温度为 65℃ 的恒温水浴锅保温约 15分钟。
（4）产物检查
将固定有生物素亲和蛋白avidin的检测试纸条插入到上述反应体系中，层析5分钟，荧光灯下检测，检测线位置显示绿色荧光“
”印迹，表示样品中含有单增李斯特菌特异性基因prfA。
其中的检测试纸条同例1。
实施例5：食品中沙门氏菌（Salmonella）特异性基因invA的扩增方法和检测试纸条。
（1）引物设计及标记
通过查阅文献和用 BLAST 软件分析筛选出沙门氏菌特异性基因invA序列，针对该片段设计出LAMP 引物并合成，引物设计通过LAMP专用引物设计软件完成，得到如下引物：
正向外引物 F3－invA 5’- CTGGGCGTTTTTTTGTCCTG -3’
反向外引物 B3－invA 5’- GGGAAGGTTAAGGAGGGTGA -3’
正向内引物
FIP－invA 5’- GCGAGGTTTGGCGGCTGATATTTTTCGCGACGACAAAATCTGG -3’
反向内引物
BIP－invA 5’- AACTTTAGCGCAAGGTGCCTCTTTTTGCCGGTAAACTACACGATGA -3’
正向环引物LF－invA 5’- AGGCTTCGCGTACAGAGG -3’
反向环引物LB－invA 5’- CACGTCAGCAAAGCGTACC -3’
用生物素和异硫氰酸荧光素分别标记内引物FIP和BIP的5’端。
（2）反应体系（反应总体积为 25μl )见下表。
| 成分 | 母液浓度 | 用量（μl） | 终浓度 |
| 核酸模板 | － | 2.0 | － |
| F3－invA | 20μM | 1 | 0.8 μM |
| B3－invA | 20μM | 1 | 0.8 μM |
| FIP－invA | 40μM | 1 | 1.6 μM |
| BIP－invA | 40μM | 1 | 1.6 μM |
| LF－invA | 5μM | 1 | 0.2 μM |
| LB－invA | 5μM | 1 | 0.2 μM |
| 甜菜碱 | 5M | 5 | 1.0 M |
| dNTP | 150 mM | 3 | 1.2 mM |
| MgSO4 | 100 mM | 0.5 | 4 mM |
| Bst DNA Polymerase Buffer | 10× | 2.5 | － |
| Bst DNA Polymerase | 8U/μl | 1 | 0.32 U/μl |
| ddH2O | － | 5 | － |
（3）扩增反应 在温度为 60℃ 的恒温水浴锅保温20分钟。
（4）产物检查 将固定有生物素亲和蛋白avidin的试纸条插入到上述反应体系中，层析5分钟，荧光灯下检测，检测线位置显示绿色荧光“
”印迹，表示样品中含有沙门氏菌特异性基因invA。其中的检测试纸条同例1。
应说明的是：以上实施例仅用于说明而并非限制本发明，应当理解为本发明也可用于其他的核酸等温扩增及产物检测，包括但不限于滚环扩增、依赖解旋酶的等温扩增、链替代扩增和切刻内切酶核酸恒温扩增；同时，在不脱离本发明精神范围内的任何修改或常规的局部替换，均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院
<120> 双标记核酸恒温扩增方法及检测试纸条
<130> 核酸环介导恒温扩增技术
<160> 28
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 志贺氏菌（Shigella）
<400> 1
catggctgga aaaactcagt gc 22
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 志贺氏菌（Shigella）
<400> 2
gaggcggaac atttccctg 19
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 志贺氏菌（Shigella）
<400> 3
tcctcacagc tctcagtggc atttttctgc ggagcttcga cag 43
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 志贺氏菌（Shigella）
<400> 4
atctccggaa aaccctcctg gtttttagcg ccggtatcat tatcga 46
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 志贺氏菌（Shigella）
<400> 5
agcagcaaca gcgaaagact 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 志贺氏菌（Shigella）
<400> 6
ccatcaggca tcagaaggcc 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus）
<400> 7
ccaatatgaa ccgggagtg 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus）
<400> 8
gggttcaacc ttgagttcc 19
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus）
<400> 9
tcagcctaac tgctgcgtat ttttggttaa gagtggtagt ccaa 44
<210> 10
<211> 42
<212> DNA
<213> 罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus）
<400> 10
tggcttaagt ttcggcgacg ttttaccaag ttgttcgacg ac 42
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus）
<400> 11
tgacaagcaa tatcaactca gatgg 25
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus）
<400> 12
tgatcatcag ccaacaactt tcgaag 26
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 布氏锥虫（Trypanosoma brucei gambiense）
<400> 13
aagctctctc gagccatc 18
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 布氏锥虫（Trypanosoma brucei gambiense）
<400> 14
tgacatacac aatatgtgcg a 21
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 布氏锥虫（Trypanosoma brucei gambiense）
<400> 15
gcgttgaaca acacaaaata ggtgatgcca catttctcag tgt 43
<210> 16
<211> 45
<212> DNA
<213> 布氏锥虫（Trypanosoma brucei gambiense）
<400> 16
ccacctcttc tcctcgtgtg gaagaaagag atgaaagata tcgta 45
<210> 17
<211> 25
<212> DNA
<213> 单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）
<400> 17
ctggttacac taaatatgta tttgc 25
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）
<400> 18
gccgtggatg ttatcgtat 19
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> 单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）
<400> 19
aggttttgct tgagattcag agatttttta atctcccttc cacgtact 48
<210> 20
<211> 46
<212> DNA
<213> 单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）
<400> 20
ttgactatgg tagcggaatt tctctttttt aacgccattg tcttgc 46
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）
<400> 21
gtagtgctag cgtattgtgc g 21
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）
<400> 22
ggtatctacg ttggtaatgg tcaa 24
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 沙门氏菌（Salmonella）
<400> 23
ctgggcgttt ttttgtcctg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 沙门氏菌（Salmonella）
<400> 24
gggaaggtta aggagggtga 20
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> 沙门氏菌（Salmonella）
<400> 25
gcgaggtttg gcggctgata tttttcgcga cgacaaaatc tgg 43
<210> 26
<211> 46
<212> DNA
<213> 沙门氏菌（Salmonella）
<400> 26
aactttagcg caaggtgcct ctttttgccg gtaaactaca cgatga 46
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 沙门氏菌（Salmonella）
<400> 27
aggcttcgcg tacagagg 18
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 沙门氏菌（Salmonella）
<400> 28
cacgtcagca aagcgtacc 19
Claims (9)
1.一种双标记核酸恒温扩增方法，其特征在于：根据检测目标设计LAMP 引物，进行内引物、外引物和环引物的合成；用生物素和荧光素分别标记两种内引物，或分别标记两种环引物，或分别标记一种内引物和一种环引物，将标记引物加入LAMP反应体系中恒温扩增，得到双标记核酸恒温扩增产物。
2.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于：所述标记是标记内引物各引物的5’端。
3.根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于：所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明。
4.根据权利要求1-3任一项所述的扩增方法，其特征在于：所述恒温扩增是在59-65℃温度下、恒温扩增5-20min。
5.一种含有双标记核酸恒温扩增产物的检测试纸条，含有支撑层、吸附层，支撑层为不吸水薄片条，吸附层粘贴于支撑层上，所述吸附层从测试端依次为测试端纤维层、纤维素膜层和手柄端吸水材料层，其特征在于：所述纤维素膜层含有权利要求1所述的双标记核酸恒温扩增产物，用生物素亲和蛋白及荧光素抗体分别在纤维素膜层上印制检测印迹和对照印迹，或用生物素亲和蛋白及荧光素金标抗体分别在纤维素膜层上印制检测印迹和对照印迹，检测印迹和对照印迹平行排列为“ 
”。
6.根据权利要求5所述的检测试纸条，其特征在于：所述不吸水薄片条为硬质塑料片条或不吸水硬纸片条，所述纤维素膜层是用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成，所述手柄端吸水材料层是用吸水纸制成，所述测试端纤维层是用玻璃棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成。
7.根据权利要求5所述的检测试纸条，其特征在于：所述荧光素为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明或四甲基异硫氰酸罗丹明。
8.根据权利要求5-7任一项所述的检测试纸条，其特征在于：所述测试端吸附纤维层、吸水材料层上均覆盖有保护膜，在测试端纤维层的保护膜上印制有样品标记线，该标记线距离测试端0.5cm。
9.权利要求5所述的检测试纸条在检测各种致病性微生物或病原体的特异性基因中的应用。
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