CN104502597A - 基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条 - Google Patents

基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析检测试纸条及应用，本发明采用低噪声激发式荧光染料作为标记，采用免疫层析技术，制备靶向于诺如病毒衣壳蛋白的免疫层析试纸条，检测时，采用专用便携式低噪声激发式荧光扫描仪分别扫描质控线和检测线，以检测线荧光强度检测值实现样本的定性检测，该试纸条适用于食品及病理样本中诺如病毒即时检测，本发明具有快速、高敏、兼顾定性及精准定量及便携的特点。

Description

基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条
技术领域
本发明属于医学、食品安全检测领域，具体地说涉及一种基于低噪声激发式荧光染料标记的诺如病毒免疫层析试纸条及其制备方法与应用。
背景技术
诺如病毒作为致病菌检测的一项重要指标，在公共卫生、食品卫生、畜牧兽医和出入境检验检疫中均有重要的意义，同时也对诺如病毒的快速及高精度的定量检测提出了更高的要求。为探求快速、准确、高灵敏度、易操作且能够定量的检测方法，世界各国学者进行了大量研究，从以传统方法为基础发展到以免疫学、分子生物学为基础的快速检测方法，并在实践中不断取得新进展。
免疫层析技术是一项有效结合了层析法卓越分离能力和免疫反应高度特异性的新型免疫检测技术，当前在疾病快速诊断、环境污染物分析及致病生物因子检定等领域得到广泛应用。其原理是将特异抗原或抗体固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当迁移至交联标记抗体的特定区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合形成抗原-标记抗体复合物，经标记物的显色、发光或电化学反应而使该区域显示一定的信号，从而实现特异性免疫诊断。常用的标记物包括生色型探针(包括胶体金、胶体碳、着色微球等)和荧光分子(如有机荧光染料、量子点、稀土元素配合物、上转磷光颗粒等)。
然而上述的标记物却存在灵敏度有限且无法实现精确定量检测等缺陷，进而限制了免疫层析技术的广泛应用。如现有技术中常见的利用酶标记催化生色底物的酶促反应而显色，可用于抗原或抗体的直接检测，将该方法应用于食品中诺如病毒的检测，通过单克隆抗体大大降低假阳性率，但是该方法的灵敏度较分子生物学方法低，且必须经过增菌筛选纯培养步骤，因此难以在短时间内得到检测结果。
对于现有的胶体金免疫层析技术，通过胶体金等纳米颗粒的聚集反应而显色，从而实现结果判定。虽然该种方法具有便捷、快速、准确和无污染等特点被广泛应用于医学检测和临床诊断，在病原体检测方面，其敏感性、特异性具有其他免疫学方法无可比拟的优势，且无需特殊仪器设备，对检测人员的专业要求低，有良好的基层应用开发前景。但这种方法中存在标记物的稳定性较差，颜色单一，灵敏度较低，受基质的背景干扰大等缺陷，且只能定性检测，不能做到精确定量检测，上述标记灵敏度有限且无法实现精确定量，限制了免疫层析技术的应用。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中难于快速检测诺如病毒的问题，进而提供一种基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，并进一步公开了其应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，包括：
底板以及沿所述底板的长度方向上依次粘附在所述底板上的样品垫、结合垫、抗体承载膜和吸水垫，所述样品垫、结合垫、抗体承载膜和吸水垫之间，依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；所述抗体承载膜粘附于所述底板的中间部位，其上设置有相间隔的检测线和质控线，所述检测线靠近所述结合垫，所述质控线靠近所述吸水垫；
所述结合垫上喷涂低噪声激发式荧光染料标记的可与诺如病毒衣壳蛋白特异性结合的单克隆抗体；
所述检测线由可与所述诺如病毒衣壳蛋白特异性结合的多克隆抗体涂层形成；所述质控线由与所述诺如病毒以及所述可与诺如病毒特异性结合的多克隆抗体均无关的抗体涂层形成。
所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，所述结合垫上喷涂的所述可与诺如病毒特异性结合的单克隆抗体为鼠抗诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体(购自Pierce公司)。
所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，所述检测线上的可与诺如病毒特异性结合的多克隆抗体涂层为兔抗诺如病毒衣壳蛋白多克隆抗体(购自Abcam公司)。
所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，形成所述质控线的抗体为羊抗鼠IgG多克隆抗体。
所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，所述的低噪声激发式荧光染料为激发波长为777nm，发射波长为790nm的低噪声激发式荧光染料为DyLight800(由Thermofisher公司提供)。
所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，所述质控线与所述检测线平行设置，所述检测线和所述质控线间距0.5cm。
本发明提供了一种制备所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条的方法，包括如下步骤：
A)取以PBS(pH为7.4)缓冲液稀释10倍的所述低噪声激发式荧光染料(便于取样准确)，染料与诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体按1:10质量比混合均匀，室温条件下避光反应2小时，随后将所得的标记产物放入含有PBS缓冲液的透析袋中，4℃透析4小时，向所述标记好的标记产物中添加终浓度为1.5％BSA、0.15％Tween20和0.1‰叠氮化钠，4℃保存，备用；
B)在所述结合垫上喷涂以层析缓冲液稀释1000倍后的所述标记产物，然后室温风干，备用；
C)使用pH为7.4的含5％BSA，0.1％Tween 20的PBS缓冲液喷涂在所述样品垫上，室温风干后，备用；
D)分别取所述诺如病毒多克隆抗体与诺如病毒以及可与诺如病毒特异性结合的多克隆抗体均无关的抗体用划线机在所述抗体承载膜上划所述检测线和所述质控线，室温风干，备用；
E)将上述步骤获得的所述样品垫、所述结合垫、所述抗体承载膜和所述吸水垫沿所述底板的长度方向上依次粘附，然后切割成试纸条，即得；
本发明提供了一种由上述的制备方法制得的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条在定性检测诺如病毒领域中的用途。
本发明提供了一种利用所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条定性检测诺如病毒的方法，包括如下步骤：
a)以含5％BSA，0.1％Tween 20的PBS(pH为7.4)缓冲液稀释处理待测样品，取上清液作为待检样用所述的试纸条进行免疫层析；
b)荧光扫描所述检测线和所述质控线，分别测定所述检测线和所述质控线区域的荧光强度，若所述质控线区域出现荧光发射峰，则表明该试纸条有效，反之则无效；若所述检测线区域同时出现荧光发射峰则为阳性结果，反之则为阴性。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的基于基于低噪声激发式荧光标记的标记的诺如病毒免疫层析试纸条，其激发光谱位于低噪声激发式区域(波长为777nm)的基于低噪声激发式荧光标记的探针具有较高的信噪比，并由此保障了其高检测灵敏度，同时由于生物基体极少在低噪声激发式光谱区自发荧光，使得基于此类探针标记的分析检测免受背景荧光干扰；因散射光强度与波长的四次方成反比，发射光位于长波区的基于低噪声激发式荧光标记的探针受其干扰小。与常用的胶体金免疫层析试纸条相比，基于低噪声激发式荧光染料标记的免疫层析体系对靶标病毒的灵敏度与实时荧光PCR法相近。
(2)本发明所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条定性检测诺如病毒的方法具有便携的优势，适用于现场、即时、快速检测，本方法所涉的免疫层析试纸条及低噪声激发式荧光扫描仪均属于便携可移动装置，且整个检测过程可在30分钟内完成，适用于现场、即时、快速检测，相对于实时荧光定量PCR法等分子生物学方法在仪器的检测速度、便携性及现场适用性上呈现明显优势。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是实施例1中所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条的示意图；
图2是实施例2中所述的诺如病毒低噪声激发式荧光检测图；
图中附图标记表示为：1-样品垫，2-结合垫，3-硝酸纤维素膜，4-检测线，5-质控线，6-吸水垫，7-底板。
具体实施方式
实施例1
本实施例所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条如图1所示，其包括，底板7以及沿所述底板7的长度方向上依次粘附在所述底板上的样品垫1、结合垫2、抗体承载膜3和吸水垫6且所述样品垫1、结合垫2、抗体承载膜3和吸水垫6之间，依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；所述抗体承载膜3上粘附于所述底板7的中间部位，其上设置有相间隔的检测线4的质控线5，所述检测线4靠近所述结合垫2，所述质控线5靠近所述吸水垫6；所述质控线4与所述检测线5平行设置，所述检测线和所述质控线间距0.5cm。
所述结合垫2上喷涂所述的可与诺如病毒特异性结合的单克隆抗体鼠抗诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体(购自Pierce公司)；所述检测线4由可与所述诺如病毒特异性结合的多克隆抗体兔抗诺如病毒衣壳蛋白多克隆抗体(购自Abcam公司)涂层形成；所述质控线5由与所述诺如病毒以及所述可与诺如病毒特异性结合的多克隆抗体均无关的羊抗鼠IgG多克隆抗体(购自北京华大蛋白质公司)涂层形成。
所述的低噪声激发式荧光染料为发射波长为777nm，发射光波长为790nm的NHS活化的低噪声激发式荧光染料DyLight800作为荧光分子。
上述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条的制备方法，包括如下步骤：
A)取以PBS(pH为7.4)缓冲液稀释10倍的所述低噪声激发式荧光染料(便于取样准确)，染料与诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体按1:10质量比混合均匀，室温条件下避光反应2小时，随后将所得的标记产物放入含有PBS缓冲液的透析袋中，4℃透析4小时，向所述标记好的标记产物中添加终浓度为1.5％BSA、0.15％Tween20和0.1‰叠氮化钠，4℃保存，备用；
B)在所述结合垫上喷涂以层析缓冲液稀释1000倍后的所述标记产物，然后室温风干，备用；
C)选取纤维素膜为所述样品垫1，使用含5％BSA，0.1％Tween 20的PBS(pH为7.4)缓冲液喷涂在所述样品垫1上，室温风干后，备用；
D)选取硝酸纤维素膜为所述抗体承载膜3，分别取所述诺如病毒多克隆抗体和所述羊抗鼠IgG(购自北京华大蛋白质公司)多克隆抗体用划线机在所述抗体承载膜3上划所述检测线4和所述质控线5，室温风干，备用；
E)将上述步骤获得的所述样品垫1、所述结合垫2、所述抗体承载膜3和所述吸水垫6沿所述底板7的长度方向上依次粘附，具体为在底板7中间先铺设抗体承载膜3，然后在抗体承载膜3的与质控线5相临近的一端铺吸水垫6，使吸水垫6与抗体承载膜3部分重叠，然后在抗体承载膜3的与所述检测线4相临近的一端铺所述结合垫2，使所述抗体承载膜3与所述结合垫2的一端部分重叠，随后在所述结合垫2的另一端再部分重叠的铺设所述样品垫1，最后切割成0.5cm宽，即得试纸条。
实施例2
本实施例提供了一种利用上述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条定性检测诺如病毒的方法，包括如下步骤：
a)取牡蛎肉质部分25g，剪碎，用225mL含5％BSA，0.1％Tween 20的PBS(pH为7.4)缓冲液稀释样本，取洗脱液作为检样，吸取50μL检样滴加到样品垫1上，待吸收干后再滴加50μL所述PBS缓冲液，另取所述缓冲液作为阴性对照，用所述的试纸条进行免疫层析；
b)室温放置10min后，用便携式低噪声激发式荧光扫描仪(北京博润福得科技发展有限公司)分别测定所述检测线4和所述质控线5区域的荧光强度，若所述质控线5区域出现荧光发射峰，则表明该试纸条有效，反之则无效；若所述检测线区域同时出现荧光发射峰则为阳性结果，反之则为阴性。附图2给出了对上述样品的定性检测结果。可见，本发明所述试纸条可有效对诺如病毒进行定性的检测之用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，其特征在于，包括：
底板(7)以及沿所述底板(7)的长度方向上依次粘附在所述底板上的样品垫(1)、结合垫(2)、抗体承载膜(3)和吸水垫(6)，且所述样品垫(1)、结合垫(2)、抗体承载膜(3)和吸水垫(6)之间，依次与且仅与相邻部位相接触且部分重叠；所述抗体承载膜(3)粘附于所述底板(7)的中间部位，其上设置有相间隔的检测线(4)和质控线(5)，所述检测线(4)靠近所述结合垫(2)，所述质控线(5)靠近所述吸水垫(6)；
所述结合垫(2)上喷涂有低噪声激发式荧光染料标记的可与所述诺如病毒衣壳蛋白特异性结合的单克隆抗体；
所述检测线(4)由可与所述诺如病毒衣壳蛋白特异性结合的多克隆抗体涂层形成；所述质控线(5)由与所述诺如病毒以及所述可与诺如病毒衣壳蛋白特异性结合的多克隆抗体均无关的抗体涂层形成。
2.根据权利要求1所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合垫(2)上喷涂的所述可与诺如病毒特异性结合的单克隆抗体为鼠抗诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体。
3.根据权利要求1或2所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，其特征在于，形成所述检测线(4)的所述可与诺如病毒特异性结合的多克隆抗体为兔抗诺如病毒衣壳蛋白多克隆抗体。
4.根据权利要求1-3任一所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，其特征在于，形成所述质控线(5)的抗体为羊抗鼠IgG多克隆抗体。
5.根据权利要求1-4任一所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，其特征在于，所述的低噪声激发式荧光染料为激发波长波长为777nm，发射波长为790nm的荧光分子。
6.根据权利要求5所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条，其特征在于，所述的低噪声激发式荧光染料为NHS活化的低噪声激发式荧光染料DyLight800。
7.一种制备权利要求1-6任一所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条的方法，其特征在于，包括如下步骤：
A)取以pH为7.4的PBS缓冲液稀释10倍的所述低噪声激发式荧光染料，染料与诺如病毒衣壳蛋白单克隆抗体按1:10质量比混合均匀，室温条件下避光反应2小时，随后将所得的标记产物放入含有PBS缓冲液的透析袋中，4℃透析4小时，向所述标记好的标记产物中添加终浓度为1.5％BSA、0.15％Tween20和0.1‰叠氮化钠，4℃保存，备用；
B)在所述结合垫(2)上喷涂以层析缓冲液稀释1000倍后的上述步骤A)中的所述标记产物，然后室温风干，备用；
C)使用pH为7.4的含5％BSA，0.1％Tween 20的PBS缓冲液喷涂在所述样品垫(1)上，室温风干后，备用；
D)分别取所述诺如病毒衣壳蛋白多克隆抗体和所述与诺如病毒以及可与诺如病毒特异性结合的多克隆抗体均无关的抗体用划线机在所述抗体承载膜(3)上划所述检测线(4)和所述质控线(5)，室温风干，备用；
E)将上述步骤获得的所述样品垫(1)、所述结合垫(2)、所述抗体承载膜(3)和所述吸水垫(6)沿所述底板(7)的长度方向上依次粘附，然后切割成试纸条，即得。
8.权利要求1-6任一所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条在定性检测诺如病毒领域中的用途。
9.一种利用权利要求1-6任一所述的基于低噪声激发式荧光标记的诺如病毒免疫层析试纸条检测诺如病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)以pH为7.4的含5％BSA，0.1％Tween 20的PBS缓冲液稀释处理待测样品，取上清液作为待检样以利用权利要求1-6任一所述的试纸条进行 免疫层析检测；
b)荧光扫描所述检测线(4)和所述质控线(5)，分别测定所述检测线(4)和所述质控线(5)区域的荧光强度，若所述质控线(5)区域出现荧光发射峰，则表明该试纸条有效，反之则无效；若所述检测线(4)区域同时出现荧光发射峰则为阳性结果，反之则为阴性。
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