CN103364550A

CN103364550A - 用量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的方法及装置

Info

Publication number: CN103364550A
Application number: CN2013102992365A
Authority: CN
Inventors: 常津; 李雪; 杨秋花; 刘俊庆
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2013-07-16
Filing date: 2013-07-16
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明涉及用量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的方法及装置，用量子点取代胶体金颗粒作为信号标记物，与待测肿瘤标志物相应抗体偶联后喷涂或者直接涂布于结合物释放垫上，该肿瘤标志物所对应的另一位点的抗体以及二抗包被于硝酸纤维素膜上，分别形成T线和C线；通过将样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫按一定顺序组装制成免疫层析试纸条。根据T线和C线上是否出现荧光条带以及荧光的强弱进行定性和定量检测。同时提供量子点荧光免疫检测装置。本发明检测装置简单，操作简单快速，检测耗时短，结果判读容易，特别适合家庭，社区，医院等场所对于肿瘤标志物的早期筛查、诊断、判断预告和转归，评价治疗效果和高危人群的跟踪观察。

Description

用量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的方法及装置

技术领域

本发明涉及一种用量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的方法及装置，属于检测技术领域。

背景技术

免疫层析法是将免疫标记技术与层析技术结合的一种新型检测技术，利用标记物的显色特性，对待测物进行定性、半定量或者定量检测。它是以微孔滤膜为固相载体，待测液为流动相，通过微孔滤膜的毛细作用和虹吸作用使待测液向前流动，同时待测液中的相关成分与固定在膜上的抗原或抗体发生特异的免疫反应，从而使免疫复合物滞留在检测带上从而得到直观的检测结果。免疫层析技术具有一系列其他检测方法所不具备的特点：操作简单快速，检测时间短，勿需对样品进行复杂的前处理，反应结果直观不需要任何后处理，操作人员不用进行专业培训，任何人都可以随时随地进行检测，免疫层析技术现已广泛应用于各个检测领域中。

现已商品化的免疫层析试纸条多用胶体金作为标记物，虽然检测结果通过肉眼可见，但是胶体金作为标记物只能进行定性检测或者半定量检测，无法完成定量检测；而某些抗原或者抗体浓度低的样本检测条带颜色太浅无法用肉眼识别。量子点（QDs）是一种半导体纳米晶，它激发光谱宽，呈连续分布，而发射光谱窄，单色性好且颜色可调，荧光强度是传统有机荧光素的20～50倍，并且具有持久的光化学稳定性，其独特的光学性质使其作为一种新型的荧光探针而得到广泛关注。用量子点取代传统的胶体金作为标记物可以弥补胶体金标记的不足。

发明内容

鉴于量子点作为新型荧光标记物在临床医学检测中的重要作用，本发明的目的在于用量子点取代胶体金作为免疫层析试纸条的标记物，提供一种量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的方法。量子点做为标记物较之胶体金具有更高的灵敏度，并且能完成定性检测，半定量以及定量检测，这是胶体金免疫层析试纸条所不能及的。

一种量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的方法，如图1所示，是用量子点取代胶体金颗粒作为信号标记物，与待测肿瘤标志物相应抗体偶联后喷涂或者直接涂布于结合物释放垫上，通过将样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫按一定顺序组装制成免疫层析试纸条。进行临床检测时，在紫外灯的照射下通过观察T线和C线上是否出现荧光条带以及荧光的强弱从而判断检测结果。本发明还提供一种用于对上述试纸条进行定量检测的量子点荧光免疫检测仪器。

本发明的技术方案如下：

一种用量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的方法，试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组装而成，样品垫用于滴加样品，结合垫表面涂有量子点标记的肿瘤标志物相应抗体，硝酸纤维素膜包被有该肿瘤标志物所对应的另一位点的抗体及二抗，分别形成T线即检测线和C线即质控线，吸水垫提供待测液流动的动力。

量子点作为信号标记物将肿瘤标志物抗原和抗体的免疫反应则转化为可被识别的荧光信号，信号强弱与免疫反应的量成正比；量子点与抗体通过乙基-（3-二甲基丙基）碳化二亚胺盐酸（EDC）连接；肿瘤标志物可为AFP，CA125，CEA，hCG，NSE，PSA等任意一种。

本发明的量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的检测方法，免疫层析试纸条的组装制备方法，步骤如下：

以下对本发明的技术方案做进一步说明：

1.量子点偶联肿瘤标志物相关抗体

原料质量份数比配比为：水溶性量子点：肿瘤标志物相关抗体=30～60：2～15；水溶性量子点：EDC=12～24：1～4。

(1)将水溶性量子点、肿瘤标志物相关抗体混合于磷酸缓冲液（PBS缓冲液）中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后在涡旋条件下加入EDC；将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2～3小时；

(2)反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液清洗以除去未反应的抗体和EDC，最后将产物分散在含有0.5～5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液中，4℃静置过夜后置于4℃保存。

2.硝酸纤维素膜的处理和蛋白的固定

(1)将同一肿瘤标志物所对应的另一位点的一抗体以及二抗（第一抗体就是能和抗原特异性结合的蛋白，也就是T线，用来检测抗原的量；二抗能和抗体结合，形成C线，主要用来说明试纸条的有效性）用PBS缓冲液稀释到0.5～3mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，然后置于37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时。

(2)所得硝酸纤维素膜浸入含有0.5～5%BSA的PBS缓冲液中，静置20～60min后用含有0.1%～1%Tween-20的PBST缓冲液冲洗，然后置于37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时，封袋置于4℃保存备用。

3.样品垫、结合物释放垫的预处理以及量子点标记物的固化

(1)将样品垫浸入含TritonX-1000.1%～2%的PBS缓冲液中静置20～60min，然后放入37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时，封袋置于4℃保存备用。

(2)结合物释放垫浸入含0.1%～10%的BSA、聚乙二醇(PEG)、TritonX-100、蔗糖的PBS缓冲液中，静置20～60min，然后置于37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时，封袋置于4℃保存备用。

(3)将所得量子点与肿瘤标志物抗体复合物用含0.1%～10%的BSA、PEG、TritonX-100、蔗糖的PBS缓冲液稀释5～30倍，涂布在结合物释放垫上，静置5～10min后于37℃恒温干燥箱中干燥干燥2～4小时，封袋置于4℃保存备用。

4.试纸条的组装

(1)所得硝酸纤维素膜固定于单面塑胶板上，所得样品垫，结合物释放垫按顺序贴在硝酸纤维素膜上，最后在硝酸纤维素膜的另一端贴上吸水垫，各个垫和膜之间相互之间重叠1～3mm，试纸条组装完成。

(2)用自动切膜机将完成组装的试纸条进行切割，宽度约为4mm，并将其装入塑料板中，最后将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。

定性和半定量方法如下：

用于激发量子点的紫外灯波长范围为320nm～420nm的普通紫外灯；根据双抗夹心的原理，当待测样本中含有该肿瘤标志物的相关抗原时，复合物将同时被T线和C线捕获，紫外灯照射下出现两条荧光条带，检测结果为阳性；反之，检测样本中不含相关抗原时，则只在C线位置出现荧光条带，检测结果为阴性；如果T线和C线都不出荧光现条带则说明检测无效，条带颜色越深说明待测样本中含有的肿瘤标志物相关病原含量越高；反之，条带颜色越浅说明相关病原含量越少。

定量检测方法如下：

配置一系列浓度梯度的肿瘤标志物抗原标准液，滴加到免疫层析试纸条上，5～20min后用检测仪读取T线和C线的荧光强度，分别将T/C的荧光强度及对应的抗原浓度做标准曲线，得到荧光强度与浓度对应的公式，将该公式输入到平板电脑内后，可根据待测样品对应的荧光强度得到样品中肿瘤标志物的浓度。

本发明的量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的检测装置，检测仪包括显示屏，电源指示灯，试纸条读取插入口，打印结果输出部分，电源总开关，LED紫外灯开关，LED紫外灯工作指示灯部分；其中试纸条读取插入口用于放置成品试纸条，由内部的步进电机控制器保证试纸条匀速前进进入仪器内部；LED紫外灯置于仪器内部，用于激发检测条带的荧光，内部的光纤光谱仪用于检测T线和C线上荧光的强度，检测结果可输出到显示屏并可以选择是否通过迷你打印机打印。

本发明的有益效果：

发明涉及一种量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的方法及装置，用量子点取代胶体金颗粒作为信号标记物，与待测肿瘤标志物相应抗体偶联后喷涂或者直接涂布于结合物释放垫上，该肿瘤标志物所对应的另一位点的抗体以及二抗包被于硝酸纤维素膜上，分别形成T线（检测线）和C线（质控线）；通过将样品垫、结合垫、反应膜、吸水垫按一定顺序组装制成免疫层析试纸条。进行临床检测时，根据T线和C线上是否出现荧光条带以及荧光的强弱进行定性和定量检测。本发明还提供一种用于对上述试纸条进行定量检测的量子点荧光免疫检测装置。本发明的试纸条检测灵敏度高于商品化的胶体金免疫试纸条，检测装置简单，操作简单快速，检测耗时短，结果判读容易，特别适合家庭，社区，医院等场所对于肿瘤标志物的早期筛查、诊断、判断预告和转归，评价治疗效果和高危人群的跟踪观察。

附图说明

图1：免疫层析试纸条工作原理图；

图2：免疫层析试纸条结构图；

图3：量子点免疫荧光检测仪的外部主观图；

图4：量子点免疫荧光检测仪的内部结构图；

图5：HCG抗原浓度标准曲线；

图6：CEA抗原浓度标准曲线；

图7：AFP抗原浓度标准曲线。

图中：

A.阴性结果、B.阳性结果；

1.待测物；2.捕获抗体；3.量子点和抗体复合物；4.样品垫；5.硝酸纤维素膜；6.吸水垫；7.结合物释放垫；8.T线（检测线）；9.C线（质控线）；10.显示屏（平板电脑）；11.打印结果输出；12.电源开关；13.LED紫外灯开关；14.LED紫外工作指示灯；15.试纸条读取插入口；16；电源指示灯。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。

本发明所述的量子点可为II族和VI族元素组成的化合物，如BaS，BaSe，BaTe，CdS，CdSe，CaTe，MgSe，MgTe，SrSe，SrTe，ZnS，ZnSe，ZnTe，等；可为III族和V族元素组成的化合物，如GaAs，GaSb，InAs，InP，InGaAs，InAlAs等，以及其他核壳型量子点的任意一种。

本发明所述的肿瘤标志物可为AFP，CA125，CEA，hCG，NSE，PSA等任意一种。

本发明所述的量子点可以采用任何方法制备，也可以采用如下方法制备：

本发明所述的CdZnSe量子点按照孙康等提供的方法（申请（专利）号：200710046471.6）进行称取0.26g（2mmoL）CdO置于三颈瓶A中，并加入3.2mL（10mmoL）油酸和6.8mL液体石蜡，加热到150℃使CdO完全溶解，得到Cd前体储备溶液。称取0.81g（1.28mmoL）硬脂酸锌置于三颈瓶B完全溶解，得到Zn前体准备溶液。称取0.064g（0.8mmoL）Se粉置于三颈瓶C中，并加入15.4mL液体石蜡、4.5mLTOP和0.9mL油胺，使Se与TOP的摩尔比为1:15，与油胺的摩尔比为1:5，在氮气保护下超声震荡，使Se完全溶解，得到Se前体储备溶液。在氮气保护下，将Se前体的储备溶液加热到220℃。将2mLZn前体溶液和1.6mLCd前体溶液同时快速注入到Se前体的高温溶液中，使混合反应溶液中，Cd前体、Zn前体和Se前体的摩尔浓度比为4:1:2.5，同时伴以强力机械搅拌，反应30分钟后，将溶液快速冷却到室温；将上述反应后溶液中加入甲醇，静置使CdZnSe量子点形成絮状沉淀，离心，去掉上层清液后将流体状的CdZnSe沉淀溶解在四氢呋喃中，再次离心后去掉下层沉淀，得到均匀分散在四氢呋喃中的CdZnSe量子点。

本发明所述的CdTe/ZnSe量子点按照胡德红等提供的方法（申请（专利）号：201010275996.9）进行。Te前体溶液的制备：在手套箱将0.0128gTe单质、0.0576g三丁基膦以及3.5g十八烯分别加入20mL玻璃瓶中，密封后从手套箱中取出，在超声作用下溶解。Se前体的制备：在手套箱中将0.038gSe单质、1mL三辛基膦和7.95g十八烯分别加入20mL的玻璃瓶中，封闭玻璃瓶并从手套箱中取出，在超声的作用下使Se单质完全溶解。Zn前体溶液的制备：在25mL三口圆底烧瓶中分别加入0.03g的ZnO、0.9g的油酸和7.08g的十八烯，密封并通入氮气，加热至250℃并搅拌，待溶液变澄清后冷却至60℃，将得到的Zn前体溶液转入20mL带橡胶塞的玻璃瓶中，室温保存。Cd溶液的制备：在50mL三口圆底瓶中分别加入0.0128g的CdO、0.1125g的油酸和3.5g的十八烯，通入氮气并加热至200℃，使含CdO完全溶解。向加热至300℃的Cd溶液注入1mLTe前体溶液，并降低至260℃，得到CdTe量子点。在200℃的温度条件下，向CdTe量子点注射1mL Zn前体溶液，5min后再注射1mLSe前体溶液，升温至260℃反应0.5h，得到CdTe/ZnSe量子点。最后，将CdTe/ZnSe量子点冷却至室温，以1:2的体积比例加入正己烷和甲醇，在离心分离的作用下吸出上层溶液，加入丙酮再次以4000转/分离心分离5min后将沉淀取出并在25℃，0.08MPa的条件下真空干燥。

本发明所述的ZnCuInS₃按照常津等提供的方法（申请（专利）号：201210137687）进行。制备称取29.2mg（0.1mmol）In（Ac）₃，19.1mg（0.1mmol）CuI，21.9mg（0.1mmol）Zn（Ac）₂于一个25ml四口烧瓶中，并加入482ul（2mmol）十二烷基硫醇，126ul（0.4mmol）油酸，5ml的十八烯，先抽真空再回充氩气保护条件下加热得到Zn²⁺、Cu+、In³⁺阳离子前体溶液；称取38.4mg（1.2mmol）单质S于一单口圆底瓶，加入4ml（12mmol）油胺、2ml的十八烯，超声溶解得到澄清的S前体液。在氩气保护下，将Zn²⁺、Cu+、In³⁺阳离子前体溶液在180℃条件下，迅速注入S前体溶液，反应15min后移去热源冷却至室温，离心纯化得到四元ZnCuInS₃量子点。

本发明所述的量子点可以采用任何方法改性，也可以采用如下方法改性，其制备过程中各组分的含量为量子点50～200mg，巯基乙酸100～500uL。其制备过程如下：取所制备的量子点10～100mg，溶于5mL二氯甲烷溶液中，在磁力搅拌下加入巯基乙酸100～500μl，避光反应6小时。反应结束后进行离心分离纯化，用PBS缓冲液清洗三次以除去未反应的巯基乙酸。之后冻干即得水溶性量子点。

本发明的检查装置如图3所示：检测仪包括显示屏（10），打印结果输出部分（11），电源开关（12），LED紫外灯开关（13），试纸条读取插入口（15），LED紫外灯工作指示灯（14）；电源指示灯（16），其中试纸条读取插入口用于放置成品试纸条，由内部的步进控制器保证试纸条匀速前进进入仪器内部；优选采用405nm的LED紫外灯激发量子点，内部的光纤光谱仪用于检测量子点的荧光，检测结果可输出到显示屏并可以选择是否通过迷你打印机打印。用光纤光谱仪进行检测荧光。

实施例1：

量子点标记的免疫层析试纸条的制备组装过程。所用量子点为CdZnSe量子点，发射波长为530nm；所用肿瘤标志物抗体为β-hCG单克隆抗体，量子点与抗体质量份数配比为30:2；所用化学偶联剂为乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸（EDC），量子点与EDC质量份数配比为12:1。

1.量子点偶联肿瘤标志物相关抗体

(1)称取0.5mg EDC，溶于1mL去离子水中，待用；取6mg量子点分散于1mL PBS缓冲液中，待用；取0.4mgβ-hCG单克隆抗体加入量子点溶液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，涡旋过程中量子点溶液中加入EDC水溶液，上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2小时。

(2)采用离心分离纯化，用PBS缓冲液清洗三次以出去未反应的抗体和EDC，即获得量子点与hCG肿瘤标志物抗体复合物，然后将其分散在含有0.5%BSA的PBS缓冲液中，4℃静置过夜后置于4℃保存。

2.硝酸纤维素膜的处理和蛋白的固定

(1)将α-hCG单克隆抗体以及羊抗鼠二抗用PBS缓冲液稀释到0.5mg/mL，用点样仪分别点于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，置于37℃恒温干燥箱中干燥2小时，封袋置于4℃保存备用。

(2)将上述硝酸纤维素膜浸入含有0.5%BSA的PBS缓冲液中静置20min，然后用0.1%Tween-20的PBST缓冲液冲洗三次，置于37℃恒温干燥箱中干燥2小时，封袋置于4℃保存备用。

3.样品垫、结合物释放垫的预处理以及量子点标记物的固化

(1)将样品垫浸入含TritonX-1000.1%的PBS缓冲液中静置20min，然后放入37℃恒温干燥箱中干燥2小时，封袋置于4℃下保存备用。

(2)结合物释放垫浸入含0.1%的BSA，PEG，TritonX-100，蔗糖的PBS缓冲液中，静置20min，然后置于37℃恒温干燥箱中干燥2小时，封袋置于4℃保存备用。

(3)所得量子点与β-hCG抗体复合物用含0.1%的BSA，PEG，TritonX-100，蔗糖的PBS缓冲液稀释5倍，按照12cm/mL的用量均匀喷涂在结合物释放垫上，静置20min后置于37℃恒温干燥箱中干燥2小时，封袋置于4℃保存备用。

4.试纸条的组装

(1)将干燥后的硝酸纤维素膜固定于单面塑胶板上，贴上处理好的结合物释放垫，最后将样品垫和吸水垫分别固定于头尾两端，相互之前重叠1mm。

5.样品的测试和结果判读

配置一系列浓度梯度的HCG抗原标准液，如：15.625ng/mL，31.25ng/mL，62.5ng/mL，125ng/mL，250ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL滴加到样品槽上，5～20min后用检测仪读取T线和C线的荧光强度，分别将T/C的荧光强度及对应的抗原浓度做标准曲线（如图5所示），得到荧光强度与浓度对应的公式，将该公式输入到平板电脑。

将待测样本滴加在样品槽上，或将样品槽浸入待测样本中，5～20min后可以直接在紫外灯下观察T线C线有无荧光及荧光强弱，荧光条带明显，肉眼即可分辨；或用量子点免疫荧光检测仪读取实验结果。该方法检测灵敏度为1ng/mL，批间重复性好，可放置至少一年，适用于批量生产。

实施例2：

量子点标记的免疫层析试纸条的制备组装过程。所用量子点为CdTe/ZnSe量子点，发射波长为634nm，所用肿瘤标志物抗体为CEA单克隆抗体，量子点与抗体质量份数配比为9：2，所用化学偶联剂为乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸（EDC），量子点与EDC比例为16:3。

1.量子点偶联肿瘤标志物相关抗体

(1)称取0.9mg EDC，溶于1mL去离子水中，待用；取9mg量子点分散于1mL PBS缓冲液中，待用；取2mg CEA单克隆抗体加入量子点溶液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，涡旋过程中量子点溶液中加入EDC水溶液。上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2.5小时。

(2)采用离心分离纯化，用PBS缓冲液清洗三次以出去未反应的抗体和EDC，即获得量子点与CEA单克隆抗体复合物，然后将其分散在含有3%BSA的PBS缓冲液中，4℃静置过夜后置于4℃保存。

2.硝酸纤维素膜的处理和蛋白的固定

(1)将CEA另一位点的单克隆抗体以及羊抗鼠二抗用PBS缓冲液稀释到2mg/mL，用点样仪分别点于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，置于37℃恒温干燥箱中干燥3小时，封袋置于4℃保存备用。

(2)将上述硝酸纤维素膜浸入含有2%BSA的PBS缓冲液中静置30min，然后用0.5%Tween-20的PBST缓冲液冲洗三次，置于37℃恒温干燥箱中干燥3小时，封袋置于4℃保存备用。

3.样品垫、结合物释放垫的预处理以及量子点标记物的固化

(1)将样品垫浸入含TritonX-1001%的PBS缓冲液中静置30min，然后放入37℃恒温干燥箱中干燥3小时，封袋置于4℃下保存备用。

(2)结合物释放垫浸入含1%的BSA，PEG，TritonX-100，蔗糖的PBS缓冲液中，静置30min，然后置于37℃恒温干燥箱中干燥3小时，封袋置于4℃保存备用。

(3)将量子点与CEA单克隆抗体复合物用含1%的BSA，PEG，TritonX-100，蔗糖的PBS缓冲液中稀释15倍，按照12cm/mL的用量均匀喷涂在结合物释放垫上，静置30min后置于37℃恒温干燥箱中干燥3小时，置于4℃保存备用。

4.试纸条的组装

(1)将干燥后的硝酸纤维素膜固定于单面塑胶板上，贴上处理后的结合物释放垫，最后将样品垫和吸水垫分别固定于头尾两端，相互之前重叠2mm。

5.样品的测试和结果判读

配置一系列浓度梯度的CEA抗原标准液，如：15.625ng/mL，31.25ng/mL，62.5ng/mL，125ng/mL，250ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL滴加到样品槽上，5～20min后用检测仪读取T线和C线的荧光强度，分别将T/C的荧光强度及对应的抗原浓度做标准曲线（如图6所示），得到荧光强度与浓度对应的公式，将该公式输入到平板电脑。

将待测样本滴加在样品槽上，或将样品槽浸入待测样本中。5～20min后可以直接在紫外灯下观察T线C线有无荧光及荧光强弱，荧光条带明显，肉眼即可分辨；或用量子点免疫荧光检测仪读取实验结果。该方法检测灵敏度为1ng/mL，批间重复性好，可放置至少一年。

实施例3：

量子点标记的免疫层析试纸条的制备组装过程。所用量子点为ZnCuInS₃量子点，发射波长为720nm；所用肿瘤标志物抗体为AFP单克隆抗体，量子点与抗体质量分数配比为4:1；所用化学偶联剂为乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸（EDC），量子点与EDC质量分数配比为6:1。

1.量子点偶联肿瘤标志物相关抗体

(1)称2mg EDC，溶于1mL去离子水中，待用；取12mg量子点分散于1mL PBS缓冲液中，待用；取3mg AFP单克隆抗体加入量子点溶液中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，涡旋过程中量子点溶液中加入EDC水溶液。上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应4小时。

(2)采用离心分离纯化，用PBS缓冲液清洗三次以出去未反应的抗体和EDC，即获得量子点与肿瘤标志物抗体复合物，然后将其分散在含有5%BSA的PBS缓冲液中，4℃静置过夜后置于4℃保存。

2.硝酸纤维素膜的处理和蛋白的固定

(1)将AFP另一位点的单克隆抗体以及羊抗鼠二抗用PBS缓冲液稀释到3mg/mL，用点样仪分别点于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，置于37℃恒温干燥箱中干燥4小时，封袋置于4℃保存备用。

(2)将上述硝酸纤维素膜浸入含有5%BSA的PBS缓冲液中静置60min然后用1%Tween-20的PBST缓冲液冲洗三次，37℃恒温干燥箱中干燥4小时，封袋置于4℃保存备用。

3.样品垫、结合物释放垫的预处理以及量子点标记物的固化

(1)将样品垫浸入含TritonX-1002%的PBS缓冲液中静置60min，然后放入37℃恒温干燥箱中干燥4小时，封袋置于4℃下保存备用。

(2)结合物释放垫浸入含10%的BSA，PEG，TritonX-100，蔗糖的PBS缓冲液中，静置60min，然后置于37℃恒温干燥箱中干燥4小时，封袋置于4℃保存备用。

(3)将量子点与AFP单克隆抗体复合物用含10%的BSA，PEG，TritonX-100，蔗糖的PBS缓冲液稀释30倍，按照12cm/mL的用量均匀喷涂在结合物释放垫上，静置数分钟候后置于37℃恒温干燥箱中干燥4小时后，封袋置于4℃保存备用。

4.试纸条的组装

(1)将干燥后的硝酸纤维素膜固定于单面塑胶板上，贴上涂有量子点与AFP肿瘤标志物抗体复合物的结合物释放垫，最后将样品垫和吸水垫分别固定于头尾两端，相互之前重叠3mm。

5.样品的测试和结果判读

配置一系列浓度梯度的AFP抗原标准液，如：15.625ng/mL，31.25ng/mL，62.5ng/mL，125ng/mL，250ng/mL，500ng/mL，1000ng/mL滴加到样品槽上，5～20min后用检测仪读取T线和C线的荧光强度，分别将T/C的荧光强度及对应的抗原浓度做标准曲线（如图7所示），得到荧光强度与浓度对应的公式，将该公式输入到平板电脑。

将待测样本滴加在样品槽上，或将样品槽浸入待测样本中。5～20min后可以直接用手持式紫外灯观察T线C线有无荧光及荧光强弱，荧光条带明显，肉眼即可分辨；或用量子点免疫荧光检测仪读取实验结果。该方法检测灵敏度为1ng/mL，批间重复性好，可放置至少一年。

Claims

1.一种用量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的方法，其特征是：试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组装而成，样品垫用于滴加样品，结合垫表面涂有量子点标记的肿瘤标志物相应抗体，硝酸纤维素膜包被有该肿瘤标志物所对应的另一位点的抗体及二抗，分别形成T线即检测线和C线即质控线，吸水垫提供待测液流动的动力。

2.根据权利要求1所述检测方法，其特征是：量子点作为信号标记物将肿瘤标志物抗原和抗体的免疫反应则转化为可被识别的荧光信号，信号强弱与免疫反应的量成正比；量子点与抗体通过乙基-（3-二甲基丙基）碳化二亚胺盐酸（EDC）连接；肿瘤标志物可为AFP，CA125，CEA，hCG，NSE，PSA等任意一种。

3.根据权利要求1所述检测方法，其特征是：定性和半定量方法如下：

4.根据权利要求1所述检测方法，其特征是：定量检测方法如下：

5.根据权利要求1所述检测方法，其特征是所述的免疫层析试纸条的组装步骤如下：

(1)量子点偶联肿瘤标志物相关抗体

原料质量份数比配比为：水溶性量子点：肿瘤标志物相关抗体=30～60：2～15；水溶性量子点：EDC=12～24：1～4；

1）将水溶性量子点、肿瘤标志物相关抗体混合于磷酸缓冲液（PBS缓冲液）中，涡旋仪上低速旋转使其混匀，然后在涡旋条件下加入EDC；将上述混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2～3小时；

2）反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液清洗三次以除去未反应的抗体和EDC，最后将产物分散在含有0.5～5%BSA的PBS缓冲液中，4℃静置过夜后置于4℃保存；

(2)硝酸纤维素膜的处理和蛋白的固定

1)将同一肿瘤标志物所对应的另一位点的抗体以及二抗用PBS缓冲液稀释到0.5～3mg/mL，用点样仪喷于硝酸纤维素膜上以形成T线和C线，然后置于37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时；

2)所得硝酸纤维素膜浸入含有0.5～5%BSA的PBS缓冲液中，静置20～60min后用含有0.1%～1%Tween-20的PBST缓冲液冲洗三次，然后置于37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时，封袋置于4℃保存备用；

(3)样品垫、结合物释放垫的预处理以及量子点标记物的固化

1）将样品垫浸入含TritonX-1000.1%～2%的PBS缓冲液中静置20～60min，然后放入37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时，封袋置于4℃下保存备用；

2）结合物释放垫浸入含0.1%～10%的BSA，PEG，TritonX-100，蔗糖的PBS缓冲液中，静置20～60min，然后置于37℃恒温干燥箱中干燥2～4小时，封袋置于4℃保存备用；

3）将所得量子点与肿瘤标志物抗体复合物用含0.1%～10%的BSA、PEG、TritonX-100、蔗糖的PBS缓冲液稀释5～30倍，涂布在结合物释放垫上，静置5～10min后于37℃恒温干燥箱中干燥干燥2～4小时，封袋置于4℃保存备用。

（4）组装：

将所得硝酸纤维素膜固定于单面塑胶板上，所得到的样品垫，结合物释放垫按顺序贴在硝酸纤维素膜上，最后在硝酸纤维素膜的另一端贴上吸水垫，各个垫和膜相互之间重叠1～3mm，试纸条组装完成；用自动切膜机将其进行切割，宽度约为4mm，并装入塑料板中，最后与干燥剂一起装入铝箔袋内密封储存。

6.用于权利要求1的量子点标记的免疫层析试纸条快速定量检测肿瘤标志物的检测装置，其特征是检测仪包括显示屏，电源指示灯，试纸条读取插入口，打印结果输出部分，电源总开关，LED紫外灯开关，LED紫外灯工作指示灯部分；其中试纸条读取插入口用于放置成品试纸条，由内部的步进电机控制器保证试纸条匀速前进进入仪器内部；LED紫外灯置于仪器内部，用于激发检测条带的荧光，内部的光纤光谱仪用于检测T线和C线上荧光的强度，检测结果可输出到显示屏并可以选择是否通过迷你打印机打印。

7.如权利要求6所述的检测装置，其特征是采用405nm的LED激发量子点，用光纤光谱仪进行检测量子点的荧光。