CN106896094B - 一种同时检测cle、rac和sbl的方法及其专用纸芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测CLE、RAC和SBL的方法及其专用纸芯片。该纸芯片包括纸芯片本体；所述纸芯片本体上设有一样品垫；以所述样品垫为中心向外延伸出盐酸克伦特罗检测区、莱克多巴胺检测区和沙丁胺醇检测区。本发明采用纸芯片技术，可实现对一个样本同时检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇，大大降低了检测时间和检测成本，比单检技术更有优势，这方法既简便又可靠，可以实现现场即时检测，是一种值得推广的定性定量筛选方法，可作为液相色谱等仪器法的补充；采用荧光强度高且稳定的量子点作为探针荧光来源，相比较胶体金免疫层析法，其不仅能够提供一个量化检测指标，而且还能够缩短检测时间和提高测量的稳定性和重复性。

Description

一种同时检测CLE、RAC和SBL的方法及其专用纸芯片
技术领域
本发明涉及食品安全快速检测技术领域，特别涉及一种同时检测CLE、RAC和SBL的方法及其专用纸芯片。
背景技术
盐酸克伦特罗(CLE)、莱克多巴胺(RAC)和沙丁胺醇(SBL)，都是人工化学合成的β2-肾上腺素受体激动剂，属于拟肾上腺素类药物，曾经用于治疗支气管哮喘，但随后美国的研究人员发现，当它们的使用剂量超过治疗剂量5～10倍时，即有显著的营养“再分配效应”——促进动物体内蛋白质的合成、促进脂肪分解代谢同时抑制脂肪沉积，显著提高胴体的瘦肉率和提高饲料转化率，获得很好的经济效益。因此，美国首先开始将它们作为添加剂加入到饲料中用于养殖业，并逐渐推广到其他国家。我国也曾一度在饲料及养殖业中应用这类药物，由于其对提高动物瘦肉率的效果非常明显，故被形象地成为“瘦肉精”。
但是，CLE、RAC和SBL作为动物生长调节剂时，使用的剂量一般较高(为正常治疗哮喘时剂量的10倍左右)，并且用药时间较长(一般连续使用20天以上)，而且CLE、RAC和SBL在动物体内代谢较为缓慢，容易在动物组织(内脏器官、肌肉、眼角膜和毛发等)中造成较高浓度的残留，而且CLE、RAC和SBL化学性质稳定，家庭中一般的烹饪方法很难将其破坏除去(172℃，1h才能够将其破坏，260℃油煎5min才会破坏一半左右)。当人们长期食用残留有CLE、RAC和SBL的动物性食品时，能够对人体健康造成损害，引起心跳过快、出现肌肉颤抖、心慌、头疼、恶心、呕吐、失眠等症状，还可能导致染色体畸变，诱发恶性肿瘤，特别是对患有心脏病和高血压等疾病的人危害更大。若一次性大量摄入，可能会引起急性中毒事件，甚至造成死亡。因此，我国禁止将CLE、RAC和SBL用于饲料工业，但受到经济利益驱使，CLE、RAC和SBL滥用现象在我国仍很普遍。
目前，国内外CLE、RAC和SBL的检测方法主要分为确证分析方法和快速筛查方法。确证分析方法以色谱技术为主，是检测CLE、RAC和SBL的经典方法，主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气相-质谱联用、高效液相色谱-质谱联用和毛细管电泳法等。虽然这些方法能够准确、高效的检测出动物组织中CLE、RAC和SBL的残留量，但样品处理繁琐费时，成本高，而且需要有经过专门训练的专业人员来操作复杂的仪器设备，因此限制了其广泛应用。快速筛查方法通常以免疫学分析方法为原理，目前，胶体金免疫层析技术应用比较广泛，其特点是操作简便、检测速度快、成本较低，但是这种方法中的标记物稳定性较差，颜色单一，灵敏度低，受基质的背景干扰大，且只能用作定性检测或半定量检测，极大地限制了它的应用范围。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时检测CLE、RAC和SBL的方法及其专用纸芯片，该方法及其专用纸芯片利用量子点标记的CLE抗体、RAC抗体和SBL抗体分别作为指示CLE、RAC和SBL的荧光探针，根据量子点的荧光性质和待测物质浓度之间的关系，制备一种用于同时检测三种“瘦肉精”的多功能多靶点免疫层析纸芯片，不仅能够实现对一个样本同时检测三种指标，而且还能够提供一个量化检测指标。
本发明提供的一种用于同时检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的纸芯片，它包括纸芯片本体；所述纸芯片本体上设有一样品垫；以所述样品垫为中心向外延伸出盐酸克伦特罗检测区、莱克多巴胺检测区和沙丁胺醇检测区；
沿着所述延伸的方向，所述盐酸克伦特罗检测区依次设有结合垫Ⅰ、检测线T1、质控线C和吸水纸；所述结合垫Ⅰ上负载有量子点标记的盐酸克伦特罗抗体；所述检测线T1上包被有盐酸克伦特罗抗原；所述质控线C上包被有能与盐酸克伦特罗抗体结合的二抗；
沿着所述延伸的方向，所述莱克多巴胺检测区依次设有结合垫Ⅱ、检测线T2、质控线C和吸水纸；所述结合垫Ⅱ上负载有量子点标记的莱克多巴胺抗体；所述检测线T2上包被有莱克多巴胺抗原；所述质控线C上包被有能与莱克多巴胺抗体结合的二抗；
沿着所述延伸的方向，所述沙丁胺醇检测区依次设有结合垫Ⅲ、检测线T3、质控线C和吸水纸；所述结合垫Ⅲ上负载有量子点标记的沙丁胺醇抗体；所述检测线T3上包被有沙丁胺醇抗原；所述质控线C上包被有能与沙丁胺醇抗体结合的二抗。
上述的纸芯片中，所述延伸具体为辐射状延伸。
上述的纸芯片中，所述能与盐酸克伦特罗抗体结合的二抗具体可为羊抗鼠二抗；所述能与莱克多巴胺抗体结合的二抗具体可为羊抗鼠二抗；所述能与沙丁胺醇抗体结合的二抗具体可为羊抗鼠二抗。
上述的纸芯片中，所述纸芯片还可包括用于封装所述纸芯片本体的壳体；所述壳体包括上壳体和下壳体；所述上壳体上设有进样口和荧光检测口；所述进样口与所述样品垫的位置上下对应；所述上壳体能够相对于所述下壳体旋转，以使所述荧光检测口对应于不同的检测区。
上述的纸芯片中，所述量子点可为CdTe/ZnSe核壳量子点。
上述的纸芯片中，所述纸芯片本体可为定性滤纸、定量滤纸或硝酸纤维素膜。
上述的纸芯片中，所述壳体的材质可为塑料，如PVC。
上述的纸芯片中，所述样品垫和所述结合垫可为玻璃纤维素膜。
上述的纸芯片中，所述盐酸克伦特罗检测区中，所述T1线与所述C线的距离不小于4mm，如4～5mm；
所述莱克多巴胺检测区中，所述T2线与所述C线的距离不小于4mm，如4～5mm；
所述沙丁胺醇检测区中，所述T3线与所述C线的距离不小于4mm，如4～5mm。
本发明进一步提供了上述任一项所述的纸芯片的制备方法，它包括如下步骤：
(1)在所述盐酸克伦特罗检测区内，在所述检测线T1上将盐酸克伦特罗抗原包被在所述检测线T1上，在所述质控线C上将能与盐酸克伦特罗抗体结合的二抗包被在所述质控线C上；
在所述莱克多巴胺检测区内，在所述检测线T2上将莱克多巴胺抗原包被在所述检测线T2上，在所述质控线C上将能与莱克多巴胺抗体结合的二抗包被在所述质控线C上；
在所述沙丁胺醇检测区内，在所述检测线T2上将沙丁胺醇抗原包被在所述检测线T3上，在所述质控线C上将能与沙丁胺醇抗体结合的二抗包被在所述质控线C上；
(2)将量子点标记的盐酸克伦特罗抗体的溶液涂覆在所述结合垫Ⅰ上，干燥；
将量子点标记的莱克多巴胺抗体的溶液涂覆在所述结合垫Ⅱ上，干燥；
将量子点标记的沙丁胺醇抗体的溶液涂覆在所述结合垫Ⅲ上，干燥；
(3)将样品垫、经过步骤(2)处理的结合垫以及吸水纸固定经步骤(1)处理的纸芯片本体上，即可得到所述纸芯片。
上述的制备方法，所述方法在步骤(1)前还包括对纸芯片本体上所述盐酸克伦特罗检测区、所述莱克多巴胺检测区和所述沙丁胺醇检测区以外的区域进行疏水处理的步骤。所述纸芯片本体上的所述盐酸克伦特罗检测区、所述莱克多巴胺检测区和所述沙丁胺醇检测区本身均为亲水性，无需再进行处理。
上述的制备方法，步骤(1)中，所述包被具体可通过画线的方式。
上述的制备方法，所述方法在步骤(2)之前还包括将所述样品垫、所述结合垫Ⅰ、所述结合垫Ⅱ和所述结合垫Ⅲ分别浸入处理液中，取出干燥的步骤；所述处理液为含0.5％～2％牛血清蛋白、0.2％～0.8％Tween-20以及0.01％～0.08％叠氮钠的PBS缓冲液，pH＝7.0(如1％牛血清蛋白、0.5％Tween-20以及0.05％叠氮钠的PBS缓冲液，pH＝7.0)。
上述的制备方法，步骤(2)中，所述量子点标记的盐酸克伦特罗抗体的溶液、所述量子点标记的莱克多巴胺抗体的溶液和所述量子点标记的沙丁胺醇抗体的溶液在所述涂覆之前均采用处理液进行稀释；所述处理液为含0.5％～2％牛血清蛋白、0.2％～0.8％Tween-20以及0.01％～0.08％叠氮钠的PBS缓冲液，pH＝7.0(如1％牛血清蛋白、0.5％Tween-20以及0.05％叠氮钠的PBS缓冲液，pH＝7.0)。
上述的制备方法中，所述方法还包括将所述纸芯片本体装入所述壳体的步骤。
本发明还提供了一种利用上述任一项所述的纸芯片同时检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的方法。待测样品可为动物肌肉组织样本、尿液或饲料，如猪尿。
所述检测方法可为荧光免疫层析方法中常规的定性检测方法或定量检测方法。
所述定性检测可根据所述空白样品溶液的荧光强度和所述待测样品溶液的荧光强度的强弱进行检测，在C带显现荧光带的前提下，T带的荧光带强度与空白对照，荧光越弱，代表待测溶液中含被检物的浓度越高。
所述定性检测方法可包括如下步骤：
(1)将空白样品溶液(不含CLE、RAC和SBL的样品溶液)滴加到所述样品垫上，分别检测所述检测线T1、所述检测线T2和所述检测线T3的荧光强度；
(2)将待测样品溶液滴加在所述样品垫上，分别检测所述检测线T1、所述检测线T2和所述检测线T3的荧光强度；
(3)通过对比步骤(1)所述的荧光强度和步骤(2)所述的荧光强度，即可实现盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的同时检测。
具体地，可根据所述待测样品溶液的荧光强度和所述空白样品溶液的荧光强度是否具有显著差别来进行定性检测，判断标准如下：
(1)T1线、T2线和T3线的荧光强度与空白对照均无显著差别，说明样品溶液中CLE、RAC和SBL的含量在检测限以下，检测结果均为阴性；
(2)T1线的荧光强度与空白对照有显著差别，T2线和T3线的荧光强度与空白对照无显著差别，说明样品溶液中CLE的含量在检测限以上，RAC和SBL的含量在检测限以下，检测结果CLE为阳性，RAC和SBL为阴性；
(3)T1线和T3线的荧光强度与空白对照无显著差别，T2线的荧光强度与空白对照有显著差别，说明样品溶液中CLE和SBL的含量在检测限以下，RAC的含量在检测限以上，检测结果CLE和SBL为阴性，RAC为阳性；
(4)T1线和T2线的荧光强度与空白对照无显著差别，T3线的荧光强度与空白对照有显著差别，说明样品溶液中CLE和RAC的含量在检测限以下，SBL的含量在检测限以上，检测结果CLE和RAC为阴性，SBL为阳性；
(5)T1线和T2线的荧光强度与空白对照有显著差别，T3线的荧光强度与空白对照无显著差别，说明样品溶液中CLE和RAC的含量在检测限以上，SBL的含量在检测限以下，检测结果CLE和RAC为阳性，SBL为阴性；
(6)T1线和T3线的荧光强度与空白对照有显著差别，T2线的荧光强度与空白对照无显著差别，说明样品溶液中CLE和SBL的含量在检测限以上，RAC的含量在检测限以下，检测结果CLE和SBL为阳性，RAC为阴性；
(7)T2线和T3线的荧光强度与空白对照有显著差别，T1线的荧光强度与空白对照无显著差别，说明样品溶液中RAC和SBL的含量在检测限以上，CLE的含量在检测限以下，检测结果RAC和SBL为阳性，CLE为阴性；
(8)T2线、T2线和T3线的荧光强度与空白对照均有显著差别，说明样品溶液中CLE、RAC和SBL的含量在检测限以上，检测结果均为阳性。
所述(1)-(8)中的显著差别是指空白对照T线的荧光强度和样品T线的荧光强度在0.05水平上具备显著性差异。
所述定量检测可先制备被检物的标准溶液，分别测定不同浓度的所述标准溶液的荧光强度，建立该被检物的标准曲线，根据待测样品溶液中被检物的荧光强度和所述标准曲线，即可得到所述样品溶液中被检物的含量。
本发明方法的检测原理为竞争性免疫层析法，具体如下：样品加入样品垫，样品中待测抗原首先与结合垫中含有的量子点标记的鼠源性单克隆抗体结合，形成抗原-抗体量子点复合物，并靠毛细作用向检测线T移动，在硝酸纤维薄膜的检测线T上固定有抗原，从结合垫中泳动过来的过量量子点标记的鼠源性单克隆抗体层析至检测线T时，可以与固定在T线上的抗原结合形成抗原-抗体量子点复合物，并在检测线T上聚积显现出一条在紫外光条件下发光的荧光条带。量子点的量反映了待测抗原的量，即量子点的量越少，荧光强度越弱则表示样品中待测抗原含量越高。从样品垫中泳动过来的抗原-抗体量子点复合物，均可被固定于C线的羊抗鼠抗体所捕获，形成另外一条在紫外光条件下发光的荧光条带，这种反应代表了整个反应体系是正确的。
本发明具有如下有益效果：
1、采用纸芯片技术，实现对一个样本同时检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇，大大降低了检测时间和检测成本，比单检技术更有优势，这方法既简便又可靠,可以实现现场即时检测，是一种值得推广的定性定量筛选方法，可作为液相色谱等仪器法的补充。
2、采用荧光强度高且稳定的量子点作为探针荧光来源，相比较胶体金免疫层析法，其不仅能够提供一个量化检测指标，而且还能够缩短检测时间和提高测量的稳定性和重复性。
附图说明
图1本发明中的量子点免疫层析纸芯片示意图。
图1中，各标记如下：
1纸芯片本体、2样品垫、3结合垫Ⅰ、4检测线T1、5质控线C、6吸水纸、7结合垫Ⅱ、8检测线T2、9结合垫Ⅲ、10检测线T3、11上壳体、12下壳体、13进样口、14荧光检测口。
图2为实施例中的CdTe/ZnSe量子点与抗体偶联的琼脂糖电泳结果图，其中，1为量子点-盐酸克伦特罗单克隆抗体复合物，2为量子点-莱克多巴胺单克隆抗体复合物，3为量子点。
图3实施例中的荧光探针和游离量子点的荧光图。
图4含有三种“瘦肉精”的样品在纸芯片上检测得到的荧光图。
图5为实施例中制作得到的CLE的标准曲线、RAC的标准曲线和SBL的标准曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的量子点均为CdTe/ZnSe核壳量子点，购自PlasmaChemGmbH，产品目录号为PL-QDN-620-100mg，激发波长为325nm，发射波长为620±5nm。
下述实施例中的盐酸克伦特罗抗体、莱克多巴胺抗体和沙丁胺醇抗体均委托上海杰一生物技术有限公司制备得到；盐酸克伦特罗抗原、莱克多巴胺抗原和沙丁胺醇抗原均委托上海杰一生物技术有限公司制备得到。
下述实施例中的PBS缓冲溶液的配方为磷酸二氢钾0.27g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8g，氯化钾0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.0，最后定容到1L。
下面结合说明书附图对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于下述实施例。
实施例1、基于量子点的多功能多靶点免疫层析纸芯片
一、结构
如图1所示，本发明提供的基于量子点的多功能多靶点免疫层析纸芯片，它包括纸芯片本体(1)和用于封装纸芯片本体的壳体；
纸芯片本体(1)为硝酸纤维素膜，其中心设有一样品垫(2)；以样品垫(2)为中心以辐射状向外延伸出盐酸克伦特罗检测区、莱克多巴胺检测区和沙丁胺醇检测区；
沿着延伸的方向，盐酸克伦特罗检测区依次设有负载有CdTe/ZnSe核壳量子点标记的盐酸克伦特罗抗体的结合垫Ⅰ(3)、包被有盐酸克伦特罗抗原的检测线T1(4)、包被有羊抗鼠二抗的质控线C(5)和吸水纸(6)；检测线T1(4)和质控线C(5)的间距为4～5mm；
沿着延伸的方向，莱克多巴胺检测区依次设有负载有CdTe/ZnSe核壳量子点标记的莱克多巴胺抗体的结合垫Ⅱ(7)、包被有莱克多巴胺抗原的检测线T2(8)、包被有羊抗鼠二抗的质控线C(5)和吸水纸(6)；检测线T2(8)和质控线C(5)的间距为4～5mm；
沿着延伸的方向，沙丁胺醇检测区依次设有负载有CdTe/ZnSe核壳量子点标记的沙丁胺醇抗体的结合垫Ⅲ(9)、包被有沙丁胺醇抗原的检测线T3(10)、包被有羊抗鼠二抗的质控线C(5)和吸水纸(6)；检测线T3(10)和质控线C(5)的间距为4～5mm；
样品垫、结合垫Ⅰ、结合垫Ⅱ、结合垫Ⅲ均为玻璃纤维素膜；
壳体包括PVC上壳体(11)和PVC下壳体(12)，上壳体上设有进样口(13)和荧光检测口(14)；进样口(13)与样品垫(2)的位置上下对应；上壳体(11)能够相对于下壳体(12)旋转，以使荧光检测口(14)对应于不同的检测区。
二、制作方法
按照如下步骤制作基于量子点的多功能多靶点免疫层析纸芯片：
1.纸芯片的制作
纸芯片所用材料为滤纸，并采用喷蜡打印的方法制作纸质微流控芯片，有蜡的部分(三个检测区以外的区域)为疏水区，无蜡的部分为亲水区(检测区)。
2.量子点偶联抗体
(1)首先分别将QDs625nm溶于PBS缓冲溶液中，制成浓度为100μg/ml的量子点溶液；然后将量子点溶液和偶联剂(EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)的混合溶液(摩尔比为2:5)按照摩尔比1：100(偶联剂：量子点)比例混合加入反应器，在旋转混合架上活化量子点的羧基10min，活化结束后加入2-巯基乙醇去除反应过量的EDC，离心得到免疫量子点；
(2)将活化的量子点、CLE抗体按照摩尔比为1：1比例混合于PBS缓冲液中，将混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2小时，反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液清洗三次以除去游离的抗体，得到CLE荧光探针，最后将产物分散在含有牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液(浓度为0.01mol/L)中，4℃静置过夜。偶联结果如图2所示(电泳条件如下：凝胶为0.5％的琼脂糖，电压为100V，电泳时间为8min)。由图2可以看出，量子点与CLE抗体成功偶联。测量QBs-Anti-CLE的荧光发射光谱，激发波长为325nm，同时以相同浓度的QBs溶液作为对照，实验结果如图3所示，进一步说明量子点与CLE抗体成功偶联。
(3)将活化的量子点、RAC抗体按照摩尔比为1：1比例混合于PBS缓冲液中，将混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2小时，反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液清洗三次以除去游离的抗体，得到RAC荧光探针，最后将产物分散在含有牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液(浓度为0.01mol/L)中，4℃静置过夜，偶联结果如图2所示(电泳条件如下：凝胶为0.5％的琼脂糖，电压为100V，电泳时间为8min)。由图2可以看出，量子点与RAC抗体成功偶联。
(4)将活化的量子点、SBL抗体按照摩尔比为1：1比例混合于PBS缓冲液中，将混合溶液置于旋转混合架上，室温下反应2小时，反应结束后，采用离心分离进行纯化，用PBS缓冲液清洗三次以除去游离的抗体，得到RAC荧光探针，最后将产物分散在含有牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液(浓度为0.025mol/L)中，4℃静置过夜。
3、CLE抗原、RAC抗原、SBL抗原和羊抗鼠二抗的固定
(1)将盐酸克伦特罗抗原以及羊抗鼠二抗用PBS缓冲液稀释到1mg/mL，用手动画膜工具在纸芯片检测区域Ⅰ上以形成T1线和C线，线与线之间的间隔4mm，室温晾干。
(2)将莱克多巴胺抗原以及羊抗鼠二抗用PBS缓冲液稀释到1mg/mL，用手动画膜工具在纸芯片检测区域Ⅱ上以形成T2线和C线，线与线之间的间隔4mm，室温晾干。
(3)将沙丁胺醇抗原以及羊抗鼠二抗用PBS缓冲液稀释到1mg/mL，用手动画膜工具在纸芯片检测区域Ⅲ上以形成T3线和C线，线与线之间的间隔4mm，室温晾干。
(4)将画好T线和C线的纸芯片放入PBS缓冲溶液中，37℃封闭，干燥后4℃保存。
4、样品垫、结合垫的预处理以及荧光探针的固化
用含1％BSA、0.5％Tween-20以及0.05％叠氮钠的PBS缓冲液(pH＝7.0)浸泡处理样品垫和结合垫10min，于37℃恒温干燥箱中干燥3小时，然后将所得三种荧光探针分别用处理液稀释10倍，均匀涂覆在上述已处理的结合垫上，静置10min后于37℃恒温干燥箱中干燥3小时，置于4℃保存备用。
5.按一定顺序将样品垫、结合垫和吸水纸粘在纸芯片本体上的三个检测区域组装好后装入塑料外壳，置于锡箔袋中加干燥剂并密封保存于4℃备用。
三、CLE、RAC和SBL的同时检测
A、定性检测
按照如下步骤对含有三种“瘦肉精”的猪尿样品中的CLE、RAC和SBL同时进行检测：
1、将空白猪尿样品(不含待测抗原)滴加在所制备纸芯片的样品垫上，反应5min后，将纸芯片放入量子点免疫荧光检测仪中分别检测T1线、T2线和T3线的荧光强度，作为空白对照。C线显示荧光带判断该数据有效。
2、将待测猪尿样品溶液滴加在所制备试纸条的样品垫上，反应5min后，将纸芯片放入量子点免疫荧光检测仪中检测T1线、T2线和T3线的荧光强度：C线显示荧光带判断该数据有效。
结果判断标准如下：
(1)T1线、T2线和T3线的荧光强度与空白对照均无显著差别，说明样品溶液中CLE、RAC和SBL的含量在检测限以下，检测结果均为阴性；
(2)T1线的荧光强度与空白对照有显著差别，T2线和T3线的荧光强度与空白对照无显著差别，说明样品溶液中CLE的含量在检测限以上，RAC和SBL的含量在检测限以下，检测结果CLE为阳性，RAC和SBL为阴性；
(3)T1线和T3线的荧光强度与空白对照无显著差别，T2线的荧光强度与空白对照有显著差别，说明样品溶液中CLE和SBL的含量在检测限以下，RAC的含量在检测限以上，检测结果CLE和SBL为阴性，RAC为阳性；
(4)T1线和T2线的荧光强度与空白对照无显著差别，T3线的荧光强度与空白对照有显著差别，说明样品溶液中CLE和RAC的含量在检测限以下，SBL的含量在检测限以上，检测结果CLE和RAC为阴性，SBL为阳性；
(5)T1线和T2线的荧光强度与空白对照有显著差别，T3线的荧光强度与空白对照无显著差别，说明样品溶液中CLE和RAC的含量在检测限以上，SBL的含量在检测限以下，检测结果CLE和RAC为阳性，SBL为阴性；
(6)T1线和T3线的荧光强度与空白对照有显著差别，T2线的荧光强度与空白对照无显著差别，说明样品溶液中CLE和SBL的含量在检测限以上，RAC的含量在检测限以下，检测结果CLE和SBL为阳性，RAC为阴性；
(7)T2线和T3线的荧光强度与空白对照有显著差别，T1线的荧光强度与空白对照无显著差别，说明样品溶液中RAC和SBL的含量在检测限以上，CLE的含量在检测限以下，检测结果RAC和SBL为阳性，CLE为阴性；
(8)T2线、T2线和T3线的荧光强度与空白对照均有显著差别，说明样品溶液中CLE、RAC和SBL的含量在检测限以上，检测结果均为阳性。
显著差别为空白对照T线的荧光强度和样品T线的荧光强度在0.05水平上具备显著性差异。
实验结果如图4所示，CLE和RAC两个检测区中T线的荧光强度与空白对照有显著差别，而且CLE测区中T线的荧光强度与空白对照的差异更显著，说明样品溶液中CLE和RAC的含量在检测限以上，检测结果CLE和RAC为阳性，且待测样品中CLE的含量更高。T3线的荧光强度与空白对照无显著差别，说明样品溶液中SBL的含量在检测限以下，SBL为阴性。
B、定量检测
(1)标准曲线的制作
在优化的实验条件下，分别对不同浓度的CLE、RAC和SBL单独进行检测，具体操作如下：将不同浓度的CLE分别滴加在所制备试纸条的样品垫上，反应5min后，将纸芯片放入量子点免疫荧光检测仪中检测不同浓度的CLE的T1线的荧光强度；C线显示荧光带判断该数据有效。RAC和SBL同CLE。
制作三种不同β-受体激动剂的标准曲线，具体结果如图5所示。
a.CLE的浓度在0.05-1.0mg/mL范围内与荧光强度呈良好的线性关系，其线性回归方程为：y＝4402.4-4206.2x(x为CLE浓度，单位为mg/mL)，相关性系数(r)为0.9908。
b.RAC的浓度在0.1-4.0mg/mL范围内与荧光强度呈良好的线性关系，其线性回归方程为：y＝4337.4-1033.1x(x为RAC浓度，单位为mg/mL)，相关性系数(r)为0.9909。
c.SBL的浓度在0.3-6.0mg/mL范围内与荧光强度呈良好的线性关系，其线性回归方程为：y＝4393.2-708.31x(x为SBL浓度，单位为mg/mL)，相关性系数(r)为0.992。
(2)回收率的测定
将所制作的纸芯片应用于猪尿中CLE、RAC和SBL的测定，并进行标准加入回收试验，实验结果见表1。可见，CLE、RAC和SBL在猪尿中的加标回收率在81％～112％，RSD(n＝6)不大于5.7％，因此本实验方法可用于猪尿中CLE、RAC和SBL的含量的分析检测。
表1猪尿中CLE、RAC和SBL的分析及回收率测定结果
Figure BDA0001266782640000101

Claims (8)

1.一种用于同时检测盐酸克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的纸芯片，其特征在于：它包括纸芯片本体；所述纸芯片本体上设有一样品垫；以所述样品垫为中心向外延伸出盐酸克伦特罗检测区、莱克多巴胺检测区和沙丁胺醇检测区；
沿着所述延伸的方向，所述盐酸克伦特罗检测区依次设有结合垫Ⅰ、检测线T1、质控线C和吸水纸；所述结合垫Ⅰ上负载有量子点标记的盐酸克伦特罗抗体；所述检测线T1上包被有盐酸克伦特罗抗原；所述质控线C上包被有能与盐酸克伦特罗抗体结合的二抗；
沿着所述延伸的方向，所述莱克多巴胺检测区依次设有结合垫Ⅱ、检测线T2、质控线C和吸水纸；所述结合垫Ⅱ上负载有量子点标记的莱克多巴胺抗体；所述检测线T2上包被有莱克多巴胺抗原；所述质控线C上包被有能与莱克多巴胺抗体结合的二抗；
沿着所述延伸的方向，所述沙丁胺醇检测区依次设有结合垫Ⅲ、检测线T3、质控线C和吸水纸；所述结合垫Ⅲ上负载有量子点标记的沙丁胺醇抗体；所述检测线T3上包被有沙丁胺醇抗原；所述质控线C上包被有能与沙丁胺醇抗体结合的二抗；
所述量子点为CdTe/ZnSe核壳量子点；
所述纸芯片所用材料为滤纸，并采用喷蜡打印的方法制作纸质微流控芯片，有蜡的部分为疏水区，无蜡的部分为亲水区。
2.根据权利要求1所述的纸芯片，其特征在于：所述纸芯片还包括用于封装所述纸芯片本体的壳体；所述壳体包括上壳体和下壳体；所述上壳体上设有进样口和荧光检测口；所述进样口与所述样品垫的位置上下对应；所述上壳体能够相对于所述下壳体旋转，以使所述荧光检测口对应于不同的检测区。
3.根据权利要求1或2所述的纸芯片，其特征在于：所述纸芯片本体为定性滤纸、定量滤纸或硝酸纤维素膜。
4.根据权利要求1或2所述的纸芯片，其特征在于：壳体的材质为塑料。
5.根据权利要求1或2所述的纸芯片，其特征在于：所述样品垫和所述结合垫为玻璃纤维素膜。
6.根据权利要求1或2所述的纸芯片，其特征在于：所述盐酸克伦特罗检测区中，所述T1线与所述C线的距离不小于4mm；
所述莱克多巴胺检测区中，所述T2线与所述C线的距离不小于4mm；
所述沙丁胺醇检测区中，所述T3线与所述C线的距离不小于4mm。
7.权利要求1-6中任一项所述的纸芯片的制备方法，它包括如下步骤：
（1）在所述盐酸克伦特罗检测区内，在所述检测线T1上将盐酸克伦特罗抗原包被在所述检测线T1上，在所述质控线C上将能与盐酸克伦特罗抗体结合的二抗包被在所述质控线C上；
在所述莱克多巴胺检测区内，在所述检测线T2上将莱克多巴胺抗原包被在所述检测线T2上，在所述质控线C上将能与莱克多巴胺抗体结合的二抗包被在所述质控线C上；
在所述沙丁胺醇检测区内，在所述检测线T2上将沙丁胺醇抗原包被在所述检测线T3上，在所述质控线C上将能与沙丁胺醇抗体结合的二抗包被在所述质控线C上；（2）将量子点标记的盐酸克伦特罗抗体的溶液涂覆在所述结合垫Ⅰ上，干燥；
将量子点标记的莱克多巴胺抗体的溶液涂覆在所述结合垫Ⅱ上，干燥；
将量子点标记的沙丁胺醇抗体的溶液涂覆在所述结合垫Ⅲ上，干燥；
（3）将样品垫、经过步骤（2）处理的结合垫以及吸水纸固定经步骤（1）处理的纸芯片本体上，即可得到所述纸芯片。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述方法还包括将所述纸芯片本体装入壳体的步骤。
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