CN111426667A - 一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于量子点‑核酸适配体‑氧化石墨烯建立的对β‑乳球蛋白检测的荧光方法。通过利用羧基修饰的水溶性量子点作为荧光团，氨基修饰的适配体(aptamer)作为识别分子，氧化石墨烯(GO)作为猝灭剂，构建了一种新型的复合纳米荧光探针，将反应物在紫外灯下拍摄成像并使用image J图像处理软件获得定量的检测数据，实现了对目标分子β‑乳球蛋白的高灵敏检测。
Description
技术领域
本发明属于生物纳米技术传感领域，具体涉及一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法。
背景技术
β-乳球蛋白(β-Lg)是由乳腺上皮细胞合成的乳特有蛋白，是反刍动物和猪等乳中的主要乳清蛋白成分。近年来研究表明：在人乳中也含有β-乳球蛋白，但是含量极少，且胃酸和胃蛋白酶不能将其消化水解，因此可通过胃肠道进入血液循环。β-乳球蛋白在牛乳乳清中占蛋白质总量的43.6％-50.0％，是乳清中含量最多的蛋白，在脱脂牛乳中的含量约为2.0-4.0g/L。牛乳中的β-乳球蛋白分子量在18400Da左右，等电点为5.1-5.3，一共由162个氨基残基组成，有两个遗传变异体。牛乳蛋白含有人体必需的氨基酸、丰富的钙磷，是人类重要的蛋白质来源。尤其对于婴幼儿来说，牛乳是除了母乳之外的重要营养物质，但是牛乳又是较易引起过敏的食物之一。牛乳过敏是由乳制品中的蛋白过敏原所引发的一种变态反应，它是由lgE介导或非lgE介导的免疫反应，在儿童中的发病率为0.1％-7.5％，且严重危害婴幼儿健康，主要见于较小的婴幼儿，一般是暂时性的，随着年龄的增长，会自动消失。绝大多数的牛乳蛋白都具有潜在的致敏性，但目前普遍认为酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白是主要的过敏原。有资料显示：约82％的牛乳过敏病人都对β-乳球蛋白产生过敏反应。
目前，国内外对食品中β-乳球蛋白的检测方法包括：以检测蛋白为基础的免疫化学检测方法，如放射性过敏原吸附抑制法、酶标记过敏原吸附抑制法、火箭免疫电泳法、免疫印迹法、酶联免疫吸附法(ELISA)；以检测DNA为基础的测试方法，如聚合酶链反应、组胺释放法以及生物传感器、质谱技术、多肽微阵列、生物芯片等新技术。随着ELISA法检测方法的成熟，目前市场上出现多种商业化试剂盒。虽然市场上也有检测牛奶过敏原的PCR试剂盒，但在实际样品检测中，由于鸡肉、牛肉容易造成假阳性反应，目前一般很少选取PCR方法检测牛奶过敏原。在实际检测工作中仍以酶联免疫法(ELISA)技术为主。ELISA技术测定的特异性强，但低灵敏度和精密度限制了其应用，且在检测β-乳球蛋白的同时也会检测到蛋白代谢物，因为它们具有相同的抗体表位，这会导致测得浓度常常被高估。因此，更高灵敏度、高选择性及低成本的β-乳球蛋白检测方法亟需开发。
本发明引用了CdTe量子点作为标记核酸适配体的荧光剂，实现了通过荧光强度的变化对β-乳球蛋白的高灵敏检测。量子点是由II-Ⅵ族元素或III-V族元素组成，且三个维度尺寸都小于100nm的纳米微晶体。由于其直径小于或接近激子波尔半径而表现出独特的物理性质，如量子尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应等。量子点以颜色丰富、光化学性质稳定、抗漂白能力强等优势备受关注。目前，在生物医学研究领域中，较为常用的同位素检测方法有酶联免疫法(ELISA)、电化学发光法、电化学方法以及荧光分析法，其中荧光分析法是一种重要的分析检测方法。为了解生物分子之间的复杂相互作用和运动，有效方法即为实时监测生物体内多样的蛋白和细胞间的相互作用。使用有机荧光染料标记细胞及生物分子的方法早已应用于此，但传统的有机荧光染料有着不可逾越的缺陷，如激发光谱窄：荧光染料的发射光谱很宽，荧光谱峰有时还有很长的拖尾，造成谱峰之间的重叠，限制了可同时应用的荧光探针数目；有机染料易光漂白和光解，光解产物对生物分子往往有杀伤作用；此外，每种有机荧光染料与生物分子之间的连接都需特定的方法。与有机荧光染料相比，量子点具有很宽的激发光谱，可以有效地激发和收集发射荧光。且量子点具有狭窄对称的荧光谱峰，可调的发射光谱，发射波长可以是单一的，也可以是多重的。可通过改变核心物质的数目而改变，也可通过改变核心物质某成分的数量调整其荧光强度。相对于有机荧光染料，量子点对化学物质和生理代谢的降解有很强的抵抗力，其光漂白阈值也高。量子点还具有稳定性强、标记的持久性强及与生物分子的连接方法单一易行等优点，可克服有机荧光染料的种种缺陷，作为有机荧光染料的合适替代物。
在该发明中，我们引入核酸适配体(Aptamer)作为识别元件来识别目标蛋白β-乳球蛋白，提高方法得选择性。核酸适配体是经指数富集配体系统进化技术(SELEX)体外筛选而获得，且能与靶物质特异并紧密结合的一小段RNA或DNA单链寡核苷酸序列。对蛋白质有很好的识别能力，核酸适配体对蛋白质的亲和力和特异性可与蛋白质的抗体相媲美。解离常数通常在纳摩尔到皮摩尔之间，且与抗体相比具有许多优越性。如核酸适配体是体外人工化学合成，合成简单，稳定性、重现性好，容易修饰，可以按需要对序列中的核苷酸定点标记各种官能团和报告基团，如荧光基团，各种酶，电活性物质等，便于核酸适配体的固定化和信号的检测，检测目标广泛等。目前，适配体被广泛应用于蛋白质研究、药物分析、病毒检测等领域。
适配体特异性识别靶物质后，本身并不具有将识别信息转换为可检测信号的能力，而荧光物质可作为标记物与适配体相结合，将信息转换为可检测信号。传统的荧光染料在检测过程中表现出易淬灭、瞬时即逝等缺点，量子点以独特的优势。弥补了传统荧光染料带来的不足，提高了分析检测的灵敏度，并实现了多组分的同时检测。因此，将量子点的光学特异性与适配体特异性识别技术相结合，提供了高效、简便、快速、灵敏、高通量的分析检测平台。
本发明通过引入氧化石墨烯(graphene oxide，GO)作为荧光猝灭剂，用于降低检测的背景信号，实现对β-乳球蛋白的高灵敏检测。氧化石墨烯是石墨烯的衍生物，是一种新型的单层二维纳米材料。近年来由于其制备成本低、易合成、具有独特的光学和催化特性，在食品分析、生物成像、生物医学、检测等领域受到广泛关注。GO具有较大的表面积及独特的sp2(sp2/sp3)键和网络，能够通过π-π堆积与单链DNA结合。此外，GO还可以作为能量转移体系中的能量受体，强烈吸收各种荧光团的光辐射导致其发生荧光猝灭，以构建基于荧光共振能量转移的传感器。在体系中添加一定量GO后，已通过特异性分子识别的部分与β-乳球蛋白结合的核酸适配体由于构象发生改变无法与GO结合，使得GO无法与核酸适配体结合；未能与β-乳球蛋白发生特异性识别的部分核酸适配体则通过π-π堆积作用与GO结合，与量子点发生能量共振转移，荧光猝灭。在本发明中，通过整合GO对量子点的高效猝灭作用和核酸适配体对β-乳球蛋白的高亲和力，构建了一种高灵敏、高特异性、低成本检测β-乳球蛋白的均相荧光分析新方法。
本发明通过引入Image J图像处理软件，对反应体系进行了高效准确的检测分析。Image J是一个基于java的公共的图像处理软件，用于处理和分析图像。在生物及医学图像分析中起着非常重要的作用。ImageJ是一个多功能软件，在生物医学领域主要应用于Western blot(蛋白印迹)的定量分析、细胞计数、范围内荧光强度变化\免疫组化分析、Sholl分析、傅里叶分析、定性表达共定位、三维图像的共定位等。具有测量数据准确有效，测量方法方便易行，能够满足质量检测图像分析处理需求等优点。与常规荧光检测使用的荧光分光光度计相比，极大提高了检测效率。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点，提供一种高灵敏、高特异性、低成本检测β-乳球蛋白的均相荧光分析新方法。
针对以上的问题和技术，本发明提供了一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯对牛乳中主要过敏原β-乳球蛋白的荧光检测新方法，包括以下步骤：
(1)将水溶性量子点上修饰的羧基基团进行活化：
将羧基修饰的水溶性量子点与EDC、NHs以1∶1∶1.5的比例溶于1mmol/L的MES缓冲液中，室温震荡活化20min；
(2)活化后的羧基量子点与氨基修饰的β-乳球蛋白核酸适配体连接形成荧光探针：
氨基修饰的β-乳球蛋白适配体溶于pH7.4的PBS缓冲液中，氨基修饰的β-乳球蛋白核酸适配体与活化后的羧基修饰的量子点按照质量比5-12∶1的比例混合，室温下摇床震荡45-50小时进行反应，量子点与适配体连接完成后，混合体系超滤提纯1-3次得到量子点-适配体荧光探针溶液；
(3)目标物与量子点-适配体荧光探针的结合：
在构建的量子点-适配体荧光探针溶液中以体积比5∶1的比例加入不同浓度β-乳球蛋白，室温下震荡孵育10-30min，β-乳球蛋白与核酸适配体发生特异性识别得到量子点-适配体与β-乳球蛋白的混合液；
(4)量子点-适配体-氧化石墨烯复合探针检测β-乳球蛋白的线性关系建立；
将氧化石墨烯溶液以体积比15的比例加入到量子点-适配体与β-乳球蛋白的混合液中，室温下震荡孵育10-30min，将反应物于紫外灯下进行拍摄并使用image J图像处理软件进行处理，检测并计算混合溶液荧光强度的变化与目标蛋白的关系，建立相应的荧光线性方程，所述的线性方程为Y＝0.93396X+2462.8，R2＝0.98472，对β-乳球蛋白的检测限为0.78125mg/L；其中Y为荧光强度，X为β-乳球蛋白的浓度，单位mg/L。
优选的，步骤(2)中，所述的β-乳球蛋白核酸适配体的碱基序列为5′-NH2-(CH2)12-CACACACGGATGGGCATGATGTTGGGGCT-3′。
优选的，步骤(2)中，氨基修饰的β-乳球蛋白核酸适配体与活化后的羧基修饰的量子点按照质量比10∶1的比例混合。
优选的，步骤(2)中，量子点与适配体连接完成后，混合体系超滤提纯2次。
优选的，步骤(4)中，所述的氧化石墨烯纳米片分散液的制备方法为将氧化石墨烯纳米片经超声分散于超纯水中，氧化石墨烯纳米分散液的浓度为3.125-800μg/mL。
优选的，步骤(4)中，所述的氧化石墨烯纳米片猝灭量子点标记的核酸适配体的最佳浓度为200μg/mL。
优选的，步骤(4)中将氧化石墨烯溶液以体积比1∶5的比例加入到量子点-适配体与β-乳球蛋白的混合液中，室温下震荡孵育20min。
采用本发明进行检测的优点是：
本发明引用了CdTe量子点作为标记核酸适配体的荧光剂。传统的荧光染料在检测过程中表现出易猝灭、瞬时即逝等缺点。量子点以独特的优势，弥补了传统荧光染料带来的不足，提高了分析检测的灵敏度，并实现了多组分的同时检测。与传统有机荧光染料相比，量子点具有很宽的激发光谱，可以有效地激发和收集发射荧光。且量子点具有狭窄对称的荧光谱峰，可调的发射光谱，发射波长可以是单一的，也可以是多重的。其荧光强度可通过改变核心物质的数目而改变，也可通过改变核心物质某成分的数量调整。相对于有机荧光染料，量子点对化学物质和生理代谢的降解有很强的抵抗力其光漂白阈值也高。量子点还具有稳定性强、标记的持久性强及与生物分子的连接方法单一易行等优点，可克服有机荧光染料的种种缺陷。
本发明我们引入核酸适配体作为识别元件来识别目标蛋白β-乳球蛋白，提高了方法的选择性。核酸适配体对蛋白质的亲和力和特异性可与蛋白质的抗体相媲美，有着″化学抗体″的美誉，但与抗体相比具有许多优越性。如核酸适配体是体外人工化学合成，合成简单，稳定性、重现性好，容易修饰，可以按需要对序列中的核苷酸定点标记各种官能团和报告基团，如荧光基团，各种酶，电活性物质等，便于核酸适配体的固定化和信号的检测，检测目标广泛等。
本发明通过引入氧化石墨烯作为荧光猝灭剂用于降低检测的背景信号，GO是通过FRET原理使体系中的荧光发生猝灭，GO能够作为能量转移体系中的能量受体，强烈吸收各种荧光团的光辐射，导致其发生荧光猝灭。且与其他猝灭剂相比，GO具有较大的表面积及独特的sp2(sp2/sp3)键和网络，能够通过π-π堆积作用与单链DNA结合，不需经过其他步骤，就能使GO与寡核苷酸适配体有效吸附结合。
本发明通过使用image J图像处理软件对荧光信号的变化进行分析，测量数据准确有效，测量方法方便易行，能够满足质量检测图像分析处理需求等优点。与常规荧光检测使用的荧光分光光度计相比，极大提高了检测效率。
本发明通过荧光信号变化的方法检测β-乳球蛋白并使用image J图像处理软件对荧光信号的变化进行分析，与传统检测方法相比，性质更稳定、操作更为简便、快速、成本低、灵敏度高、选择性好，有利于推广应用。
采用本发明所述的方法，测得β-乳球蛋白的浓度与荧光强度呈良好的线性关系(R2＝0.98472)，样品检出限为0.78125mg/L。
附图说明：
图1为不同浓度GO对量子点-核酸适配体荧光猝灭的趋势图；
图2为荧光强度相对于β-乳球蛋白浓度拟合的标准曲线；
以下结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。
以下实施例涉及的修饰氨基的β-LG适配体
5′-NH2-(CH2)12-CACACACGGATGGGCATGATGTTGGGGCT-3′直接购买于苏州金唯智生物科技有限公司。羧基修饰的水溶性量子点购买于武汉珈源量子点技术开发有限责任公司。氧化石墨烯粉末(CAS号：7440-44-0)购买于南京先丰纳米材料科技有限公司。
实施例1-9
一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法，包括如下步骤：水溶性量子点上修饰的羧基基团活化方法，步骤如下：
将羧基修饰的量子点与EDC、NHS以1∶1∶1.5的比例溶于1mmol/L的MES缓冲液中，室温震荡活化20min。
活化后的羧基量子点与氨基修饰的核酸适配体连接方法，步骤如下：
氨基修饰的适配体溶于PBS缓冲液中(pH7.4)，适配体：量子点＝10∶1，室温下摇床震荡48小时进行反应。量子点标记完成后，混合体系超滤提纯2次。
目标物与量子点-适配体荧光探针的结合方法，步骤如下：
在构建的量子点-适配体荧光探针中以体积比5∶1的比例加入不同浓度β-乳球蛋白，室温下震荡孵育20min，β-乳球蛋白与核酸适配体发生特异性识别。
量子点-适配体-氧化石墨烯复合探针检测β-乳球蛋白的线性关系建立方法，步骤如下：将不同浓度氧化石墨烯溶液以体积比1∶5的比例加入到量子点-适配体与β-乳球蛋白的混合液中，室温下震荡孵育20min，与β-乳球蛋白发生特异性结合的核酸适配体由于构象发生改变无法与GO结合；未能与β-乳球蛋白发生特异性结合的部分核酸适配体则通过π-π堆积作用与GO结合，并在与量子点发生能量共振转移，荧光猝灭。将反应物于紫外灯下进行拍摄并使用imageJ图像处理软件进行处理，检测并计算混合溶液荧光强度的变化与目标蛋白的关系，建立相应的荧光线性方程。
以下实施例其他条件相同，只是加入的GO浓度不同，加入浓度分别为(如表1)：
表1实施例与加入的GO的浓度
由图1可以看出混合液的荧光强度是随着GO浓度的增加而逐渐减弱的，选择200μg/mL为最佳浓度而不选择猝灭效果更好的浓度是因为加入大于200μg/mL浓度的GO可能会由于浓度过高导致体系溶液出现浑浊的现象而使检测结果不准确，所以200μg/mL浓度效果最好。
按照实施例7的方法进行检测，测得β-乳球蛋白的浓度与荧光强度的线性方程为Y＝9.3396X+2462.8(R2＝0.98472)，样品检出限为0.78125mg/L。
实施例10
一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法，包括如下步骤：
水溶性量子点上修饰的羧基基团活化方法，步骤如下：
将羧基修饰的量子点与EDC、NHS以1∶1∶1.5的比例溶于1mmol/L的MES缓冲液中，室温震荡活化20min。
活化后的羧基量子点与氨基修饰的核酸适配体连接方法，步骤如下：
氨基修饰的适配体溶于PBS缓冲液中(pH7.4)，适配体：量子点＝12∶1，室温下摇床震荡48小时进行反应。量子点标记完成后，混合体系超滤提纯3次。
目标物与量子点-适配体荧光探针的结合方法，步骤如下：
在构建的量子点-适配体荧光探针中以体积比5∶1的比例加入不同浓度β-乳球蛋白，室温下震荡孵育10min，β-乳球蛋白与核酸适配体发生特异性识别。
量子点-适配体-氧化石墨烯复合探针检测β-乳球蛋白的线性关系建立方法，步骤如下：将200μg/mL氧化石墨烯溶液以体积比1∶5的比例加入到量子点-适配体与β-乳球蛋白的混合液中，室温下震荡孵育20min，与β-乳球蛋白发生特异性结合的核酸适配体由于构象发生改变无法与GO结合；未能与β-乳球蛋白发生特异性结合的部分核酸适配体则通过π-π堆积作用与GO结合，并在与量子点发生能量共振转移，荧光猝灭。将反应物于紫外灯下进行拍摄并使用image J图像处理软件进行处理，检测并计算混合溶液荧光强度的变化与目标蛋白的关系，建立相应的荧光线性方程。
实施例11
一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法，包括如下步骤：
水溶性量子点上修饰的羧基基团活化方法，步骤如下：
将羧基修饰的量子点与EDC、NHS以1∶1∶1.5的比例溶于1mmol/L的MES缓冲液中，室温震荡活化20min。
活化后的羧基量子点与氨基修饰的核酸适配体连接方法，步骤如下：
氨基修饰的适配体溶于PBS缓冲液中(pH7.4)，适配体∶量子点＝5∶1，室温下摇床震荡48小时进行反应。量子点标记完成后，混合体系超滤提纯3次。
目标物与量子点-适配体荧光探针的结合方法，步骤如下：
在构建的量子点-适配体荧光探针中以体积比5∶1的比例加入不同浓度β-乳球蛋白，室温下震荡孵育30min，β-乳球蛋白与核酸适配体发生特异性识别。
量子点-适配体-氧化石墨烯复合探针检测β-乳球蛋白的线性关系建立方法，步骤如下：将200μg/mL氧化石墨烯溶液以体积比1∶5的比例加入到量子点-适配体与β-乳球蛋白的混合液中，室温下震荡孵育20min，与β-乳球蛋白发生特异性结合的核酸适配体由于构象发生改变无法与GO结合；未能与β-乳球蛋白发生特异性结合的部分核酸适配体则通过π-π堆积作用与GO结合，并在与量子点发生能量共振转移，荧光猝灭。将反应物于紫外灯下进行拍摄并使用image J图像处理软件进行处理，检测并计算混合溶液荧光强度的变化与目标蛋白的关系，建立相应的荧光线性方程。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将水溶性量子点上修饰的羧基基团进行活化：
将羧基修饰的水溶性量子点与EDC、NHS以1∶1∶1.5的比例溶于1mmol/L的MES缓冲液中，室温震荡活化20min；
(2)活化后的羧基水溶性量子点与氨基修饰的β-乳球蛋白核酸适配体连接形成荧光探针：
氨基修饰的β-乳球蛋白适配体溶于pH7.4的PBS缓冲液中，氨基修饰的β-乳球蛋白核酸适配体与活化后的羧基修饰的量子点按照质量比5-12∶1的比例混合，室温下摇床震荡45-50小时进行反应，量子点与适配体连接完成后，混合体系超滤提纯1-3次得到量子点-适配体荧光探针溶液；
(3)目标物与量子点-适配体荧光探针的结合：
在构建的量子点-适配体荧光探针溶液中以体积比5∶1的比例加入不同浓度β-乳球蛋白，室温下震荡孵育10-30min，β-乳球蛋白与核酸适配体发生特异性识别得到量子点-适配体与β-乳球蛋白的混合液；
(4)量子点-适配体-氧化石墨烯复合探针检测β-乳球蛋白的线性关系建立；
将氧化石墨烯溶液以体积比1∶5的比例加入到量子点-适配体与β-乳球蛋白的混合液中，室温下震荡孵育10-30min，将反应物于紫外灯下进行拍摄并使用image J图像处理软件进行处理，检测并计算混合溶液荧光强度的变化与目标蛋白的关系，建立相应的荧光线性方程，所述的线性方程为Y＝0.93396X+2462.8，R2＝0.98472，对β-乳球蛋白的检测限为0.78125mg/L；其中Y为荧光强度，X为β-乳球蛋白的浓度，单位mg/L。
2.根据权利要求1所述的一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的β-乳球蛋白核酸适配体的碱基序列为5′-NH2-(CH2)12-CACACACGGATGGGCATGATGTTGGGGCT-3′。
3.根据权利要求1所述的一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法，其特征在于，步骤(2)中，氨基修饰的β-乳球蛋白核酸适配体与活化后的羧基修饰的量子点按照质量比10∶1的比例混合。
4.根据权利要求1所述的一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法，其特征在于，步骤(2)中，量子点与适配体连接完成后，混合体系超滤提纯2次。
5.根据权利要求1所述的一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的氧化石墨烯纳米片分散液的制备方法为将氧化石墨烯纳米片经超声分散于超纯水中，氧化石墨烯纳米分散液的浓度为3.125-800μg/mL。
6.根据权利要求5所述的一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法，其特征在于，氧化石墨烯纳米片分散液浓度为200μg/mL。
7.根据权利要求1所述的一种基于量子点-核酸适配体-氧化石墨烯建立的对β-乳球蛋白检测的荧光方法，其特征在于，步骤(4)中将氧化石墨烯溶液以体积比1∶5的比例加入到量子点-适配体与β-乳球蛋白的混合液中，室温下震荡孵育20min。
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