CN104697968A - 基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，将核酸适配体共价偶联至荧光供体表面，将偶联有核酸适配体的荧光供体与所述免标记荧光受体混合，直至所述荧光供体的荧光猝灭，得到所述基于近红外荧光能量转移生物传感器，由于该传感器检测窗口位于近红外区域，可以很好的克服背景荧光，散射光和光吸收等光学干扰，提高了检测灵敏度，能够直接应用于复杂生物基质分析。

Description

基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法

技术领域

本发明涉及光谱应用技术领域，尤其涉及一种基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法。

背景技术

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer；FRET)是一种将荧光光谱与共振能量转移技术相结合的高灵敏，高空间分辨率，无损伤的均相检测技术。FRET是指荧光供受体在1-10nm范围内，当供体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定重叠时，由于偶极-偶极相互作用，供体激发态能量以非辐射的形式传递给受体。该技术应用于分析化学领域已有40多年，其在自身不断完善的同时，极大地促进了生物医学分析的发展。

但是，作为一种光谱技术，FRET具有一定局限性，其检测窗口常位于生物基质背景荧光很强的可见光区域（400-650nm），此时，散射光和光吸收等光学干扰较为严重，明显的降低了分析灵敏度或信噪比。然而，当检测窗口位于近红外区域（650-900nm）时，生物样本的本底荧光，散射光和光吸收等光学干扰大大减弱，分析灵敏度得到显著提高。因此，基于近红外的检测窗口是生物光分析的研究趋势。

湖南大学刘慧霞教授等构建了一种基于氧化石墨烯猝灭的胰岛素FRET传感器(Analyst,2011,136,4138)，该传感器以核酸适配体（Aptamer）修饰的荧光素染料为能量供体，通过π-π作用将能量供受体组装到一起，导致FRET的发生和荧光猝灭，当加入胰岛素后，由于aptamer与其具有很高的亲和力，从而导致aptamer修饰的荧光素远离石墨烯，FRET过程被抑制，供体荧光得以恢复。但是，该传感器的检测窗口位于可见光区域，导致灵敏度不高，不能应用于血液样本中胰岛素分析。此外，该传感器所采用的供体是荧光染料，具有光漂白性。该传感器不具备本发明中近红外量子点激发FRET能够应用于复杂血样中胰岛素的分析检测功能。

发明内容

本发明提供一种基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，该传感器检测窗口位于近红外区域，可以很好的克服背景荧光，散射光和光吸收等光学干扰，提高了检测灵敏度，能够直接应用于复杂生物基质分析。

一种基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，包括下述步骤：

步骤S10：将核酸适配体共价偶联至荧光供体表面；

步骤S20：提供一免标记荧光受体；

步骤S30：将偶联有核酸适配体的荧光供体与所述免标记荧光受体混合，直至所述荧光供体的荧光猝灭，得到所述基于近红外荧光能量转移生物传感器。

在一些实施例中，步骤S10，将核酸适配体共价偶联至荧光供体表面，包括下述步骤：

步骤S11：提供第一缓冲溶液；

步骤S12：在所述第一缓冲溶液中加入质量份数为（5-20）：（5-20）的荧光供体和偶联剂，得到第一反应液；

步骤S13：离心分离所述第一反应液，收集第一上层液体；

步骤S14：将所述第一上层液体添加到第二缓冲溶液中，并加入质量份数为（20-100）的氨基修饰的核酸适配体，得到第二反应液；

步骤S15：离心分离所述第二反应液，获取第二上层液体，并置于低温环境中保存备用。

在一些实施例中，步骤S10中，所述荧光供体为近红外量子点或纳米金或有机荧光染料。

在一些实施例中，步骤S20中，所述免标记荧光受体为氧化性碳纳米颗粒或芳香聚合物。

在一些实施例中，步骤S11中，所述第一缓冲溶液为MES溶液，所述MES溶液的pH=6.1，浓度为0.1mol/L。

在一些实施例中，步骤S12中，所述偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，N-羟基硫代琥珀酰亚胺。

在一些实施例中，步骤S14中，所述第二缓冲溶液为HEPES溶液，所述HEPES溶液的pH=7.2，浓度为0.02mol/L。

在一些实施例中，所述氧化性碳纳米颗粒的制备方法，包括下述步骤：

将质量份数为（5-20）的蜡烛灰加入到由硝酸和二甲基甲酰胺组成的混合溶剂中，得到第三反应液；

对所述第三反应液进行离心分离，收集底部沉淀物；

将所述沉淀物用纯水洗涤后，再超声分散至水溶液中得到所述氧化性碳纳米颗粒。

本发明提供的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，将核酸适配体共价偶联至荧光供体表面，将偶联有核酸适配体的荧光供体与所述免标记荧光受体混合，直至所述荧光供体的荧光猝灭，得到所述基于近红外荧光能量转移生物传感器，由于该传感器检测窗口位于近红外区域，可以很好的克服背景荧光，散射光和光吸收等光学干扰，提高了检测灵敏度，能够直接应用于复杂生物基质分析。

另外，本发明提供的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，以胰岛素为分析对象，建立了以aptamer修饰的近红外量子点为供体，免标记碳纳米颗粒为受体的FRET传感器，其对胰岛素具有很好的选择性，线性检测范围为0.001-2nM,由于其充分利用了供受体优异的光物理性质，大大提高了检测灵敏度，达到pM水平。

附图说明

图1为本发明提供的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法的步骤流程图；

图2为本发明提供的将核酸适配体共价偶联至荧光供体表面的步骤流程图；

图3为本发明提供的氧化性碳纳米颗粒的制备方法的步骤流程图；

图4为发明提供的将偶联有核酸适配体的荧光供体与所述免标记荧光受体作用后的荧光猝灭的曲线图；

图5，为本发明提供的生物传感器与加入不同浓度胰岛素后引起的荧光恢复的曲线图；

图6，为本发明提供的生物传感器对胰岛素的选择性曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明提供的近红外荧光共振能量转移（FRET）传感器以核酸适配体（Aptamer）修饰的近红外量子点（NIR-QDs）作为能量供体，氧化性碳纳米颗粒（OCNPs）作为免标记能量受体，通过π-π作用实现供受体的自组装。该传感器以FRET为技术基础，近红外光作为检测窗口，克服了以可见光为检测窗口时，背景荧光和散射光的干扰，所以该传感器能够直接应用于复杂生物基质，如血浆，可以实现均相检测，无需分离，大大提高分析效率；Aptamer共价偶联到一定量的近红外量子点表面，然后与一定浓度的OCNPs混合，反应一段时间后，量子点荧光猝灭；然后再向体系里面加入一定浓度的胰岛素，由于胰岛素与aptamer亲和力更强，导致供受体分离和FRET消失，从而量子点的荧光得以恢复，其荧光恢复与胰岛素的浓度在一定范围内成线性关系，这样达到定量检测胰岛素的目的。由于该传感器的检测窗口位于近红外，且充分利用量子点优异的光物理性质和OCNPs的高猝灭性能，其对胰岛素的检测灵敏度达到pM水平，可以直接应用于人血浆样本中胰岛素的检测。本发明提供的生物传感器正是通过上述原理进行胰岛素的的检测。

如图1，为本发明一实施方式的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法的步骤流程图，包括下述步骤：

步骤S10：将核酸适配体共价偶联至荧光供体表面；

进一步地，荧光供体为近红外量子点或纳米金或有机荧光染料。优选地，荧光供体为近红外量子点（NIR-QDs）。

可以理解，近红外量子点是一种受激后能够发出荧光的纳米晶，具有荧光量子产率高，宽激发，尺寸光谱可调，光稳定性好，Stokes位移大等优良的光物理性质，已经证实比有机荧光染料更适合充当FRET的能量供体。近红外量子点由于检测窗口位于近红外区域，应用于生物分析时能够很好地克服背景荧光，散射光和光吸收等干扰，极大地提高灵敏度。

可以理解，核酸适配体（Aptamer）是一段DNA（脱氧核糖核酸）或者RNA（核糖核酸）序列，是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。它能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域。当核酸适配体与目标物质发生特异性结合时，核酸适配体自身的构型会随之发生变化。其可以通过π-π堆积作用与上述纳米受体自组装，实现受体免标记，简化分析过程。

请参阅图2，本发明提供的将核酸适配体共价偶联至荧光供体表面的步骤流程图，包括下述步骤：

步骤S11：提供第一缓冲溶液；

优选地，第一缓冲溶液为MES溶液（即为2-(N-吗啡啉）乙磺酸溶液)，MES溶液的pH=6.1，浓度为0.1mol/L。

步骤S12：在第一缓冲溶液中加入质量份数为（5-20）：（5-20）的荧光供体和偶联剂，得到第一反应液；

优选地，偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)，N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)；

具体地，将质量份数为（5-20）份的NIR-QDs与质量份数为（5-20）份的偶联剂，添加至上述MES缓冲溶液中，并在摇床中低转速孵育反应30分钟,得到第一反应液。

步骤S13：离心分离第一反应液，收集第一上层液体；

具体地，将上述第一反应液用超滤管(截留分子量30kDa)进行离心分离，用超纯水洗涤2-3次，以除去多余的偶联剂，并收集超滤管上层液体，得到第一上层液体。

步骤S14：将第一上层液体添加到第二缓冲溶液中，并加入质量份数为（20-100）的氨基修饰的核酸适配体，得到第二反应液；

优选地，第二缓冲溶液为HEPES溶液(即为4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液)，HEPES溶液的pH=7.2，浓度为0.02mol/L。

具体地，将第一上层液体定容到上述HEPES溶液中，然后加入氨基修饰的胰岛素的aptamer(20-100份)，摇床中低转速反应2小时，得到第二反应液。

步骤S15：离心分离第二反应液，获取第二上层液体，并置于低温环境中保存备用。

具体地，将上述第二反应液用超滤管离心分离洗涤2-3次，最后溶解于HEPES缓冲溶液中，于4度冰箱保存备用。

可以理解，经过上述步骤S11～步骤S15，可以实现将核酸适配体共价偶联至荧光供体表面。

步骤S20：提供一免标记荧光受体；

具体地，免标记荧光受体为氧化性碳纳米颗粒或芳香聚合物。优选地，免标记荧光受体为氧化性碳纳米颗粒。

可以理解，氧化性碳纳米颗粒（OCNPs）是一种零维的碳材料，粒径为几十纳米，具有很好的水溶性，与二维的碳纳米管，石墨烯相比较而言，其在尺寸上与生物分子匹配，此外，OCNPs粒径分布均一，应用于FRET分析时，能够更好地提供稳定的光信号；OCNPs比氧化石墨烯受体合成更加简单方便，成本更加低廉。

请参阅图3，为本发明提供的氧化性碳纳米颗粒的制备方法的步骤流程图，包括下述步骤：

步骤S31：将质量份数为（5-20）的蜡烛灰加入到由硝酸和二甲基甲酰胺组成的混合溶剂中，得到第三反应液；

具体地，将质量份数为（5-20）份的蜡烛灰加入到由硝酸和DMF溶剂中，回流反应12-24个小时，待反应液冷却至室温后，得到第三反应液。

步骤S32：对所述第三反应液冷却至室离心分离，收集底部沉淀物；

步骤S33：将所述沉淀物用纯水洗涤后，再超声分散至水溶液中得到所述氧化性碳纳米颗粒。

可以理解，通过上述步骤S31～步骤S33可以制备得到所述氧化性碳纳米颗粒。

步骤S30：将偶联有核酸适配体的荧光供体与所述免标记荧光受体混合，直至所述荧光供体的荧光猝灭，得到所述基于近红外荧光能量转移生物传感器。

具体地，将质量分数为(5-20份)Aptamer修饰的量子点和质量份数为（5-20份）的OCNPs直接混合，在摇床中低速30度孵育反应0.5-2小时，让荧光得到充分的猝灭，得到上述近红外荧光能量转移生物传感器。

请参阅图4，为发明提供的将偶联有核酸适配体的荧光供体与所述免标记荧光受体作用后的荧光猝灭的曲线图，从图4中看出，随着免标记荧光受体的不断加入，荧光供体的荧光得以不断的猝灭，但是当荧光受体浓度增加到一定程度后，其达到猝灭平台，荧光猝灭效率达到平衡，由于荧光受体具有很好的光吸收性能，其对荧光供体的最大猝灭效率达到75%。由于受体具有免标记特性，无需标记，所以上述传感器构建很简单。

可以理解，经过上述步骤S10～步骤S30后，可以得到上述的生物传感器。

可以理解，将人血浆样本（稀释倍数20倍）加入到上述构建好的传感器中，并加入第一缓冲溶液，随后在摇床里面孵育反应0.5-2小时，让荧光得以充分的恢复，反应结束后，将样品进行近红外荧光测定，根据第一缓冲溶液中荧光增强与胰岛素浓度成线性范围的工作曲线来计算出血浆中胰岛素的含量。

实际中，可以将构建上述生物传感器分成若干份数，然后，再分别加入不同浓度的胰岛素，用第一缓冲溶液定容到相同的体积，随后在摇床里面孵育反应0.5-2小时，让荧光得以充分的恢复，反应结束后，将上述样品分别进行近红外荧光测定，通过荧光的恢复程度来进行胰岛素的定量测定，可以同时测定不同的胰岛素样本，提高了测试效率。

请参阅图5，为本发明提供的生物传感器与加入不同浓度胰岛素后引起的荧光恢复的曲线图。从图5中可以看出，随着胰岛素的不断加入，由于其与核酸适配体结合能力更强，从而导致免标记受体与荧光供体分离，FRET过程消失，荧光供体的荧光得以逐渐恢复，荧光恢复的程度与胰岛素的浓度在一定范围内成正比，且荧光供体的荧光恢复明显。

请参阅图6，为本发明提供的生物传感器对胰岛素的选择性曲线图。从图6中可以看出，上述生物传感器采用核酸适配体连接荧光供体和免标记受体，由于核酸适配体能与胰岛素目标物高特异性、高选择性地结合，所以传感器只有在加入胰岛素后，荧光供体的荧光才能够得到恢复，其对胰岛素具有很好的选择性。

本发明提供的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，将核酸适配体共价偶联至荧光供体表面，将偶联有核酸适配体的荧光供体与所述免标记荧光受体混合，直至所述荧光供体的荧光猝灭，得到所述基于近红外荧光能量转移生物传感器，由于该传感器检测窗口位于近红外区域，可以很好的克服背景荧光，散射光和光吸收等光学干扰，提高了检测灵敏度，能够直接应用于复杂生物基质分析。

另外，本发明提供的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，以胰岛素为分析对象，建立了以aptamer修饰的近红外量子点为供体，免标记碳纳米颗粒为受体的FRET传感器，其对胰岛素具有很好的选择性，线性检测范围为0.001-2nM,由于其充分利用了供受体优异的光物理性质，大大提高了检测灵敏度，达到pM水平。

此外，本发明提供的基于近红外量子点和氧化性碳纳米颗粒的FRET传感平台构建，适用于但不局限于胰岛素分析，其可以通过对量子点修饰上不同的aptamer或者功能配体，以达到对其他目标物的分析，其分析对象可以为任何具有aptamer或功能配体的目标物，如小分子，蛋白或酶，金属离子等。

可以理解的是，对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术构思做出其他各种相应的改变与变形，而所有这些改变与变形都应属于本发明权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，包括下述步骤：

步骤S10：将核酸适配体共价偶联至荧光供体表面；

步骤S20：提供一免标记荧光受体；

步骤S30：将偶联有核酸适配体的荧光供体与所述免标记荧光受体混合，直至所述荧光供体的荧光猝灭，得到所述基于近红外荧光能量转移生物传感器。

2.根据权利要求1所述的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤S10，将核酸适配体共价偶联至荧光供体表面，包括下述步骤：

步骤S11：提供第一缓冲溶液；

步骤S12：在所述第一缓冲溶液中加入质量份数为（5-20）：（5-20）的荧光供体和偶联剂，得到第一反应液；

步骤S13：离心分离所述第一反应液，收集第一上层液体；

步骤S14：将所述第一上层液体添加到第二缓冲溶液中，并加入质量份数为（20-100）的氨基修饰的核酸适配体，得到第二反应液；

步骤S15：离心分离所述第二反应液，获取第二上层液体，并置于低温环境中保存备用。

3.根据权利要求1所述的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤S10中，所述荧光供体为近红外量子点或纳米金或有机荧光染料。

4.根据权利要求1所述的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤S20中，所述免标记荧光受体为氧化性碳纳米颗粒或芳香聚合物。

5.根据权利要求2所述的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤S11中，所述第一缓冲溶液为MES溶液，所述MES溶液的pH=6.1，浓度为0.1mol/L。

6.根据权利要求2所述的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤S12中，所述偶联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，N-羟基硫代琥珀酰亚胺。

7.根据权利要求2所述的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，其特征在于，步骤S14中，所述第二缓冲溶液为HEPES溶液，所述HEPES溶液的pH=7.2，浓度为0.02mol/L。

8.根据权利要求4所述的基于近红外荧光能量转移生物传感器的构建方法，其特征在于，所述氧化性碳纳米颗粒的制备方法，包括下述步骤：

将质量份数为（5-20）的蜡烛灰加入到由硝酸和二甲基甲酰胺组成的混合溶剂中，得到第三反应液；

对所述第三反应液进行离心分离，收集底部沉淀物；

将所述沉淀物用纯水洗涤后，再超声分散至水溶液中得到所述氧化性碳纳米颗粒。