CN106248644B - 一种基于碳点荧光“猝灭-恢复”的碱性磷酸酶测定方法 - Google Patents

一种基于碳点荧光“猝灭-恢复”的碱性磷酸酶测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于碳点荧光“猝灭‑恢复”的碱性磷酸酶的灵敏检测方法。利用简单的水热法制备的碳点毒性低且具有良好的水溶性和荧光性质。在高锰酸钾存在下，碳点荧光发生猝灭；而碱性磷酸酶(ALP)的水解产物抗坏血酸或对氨基苯酚能使猝灭的荧光重新得到恢复。利用ALP的高催化活性建立了一种新型荧光分析法实现了ALP的高灵敏检测。此方法原理新颖、灵敏度高、选择性好、操作简便快速且避免了荧光猝灭法中虚假信号的干扰，为基于碳点的生物检测应用拓宽了方向。

Description

一种基于碳点荧光“猝灭-恢复”的碱性磷酸酶测定方法
技术领域：
本发明涉及纳米材料生物分析检测领域，尤其涉及新型荧光碳纳米材料–碳点在碱性磷酸酶活性检测中的应用。
背景技术：
碱性磷酸酶(ALP)是一种广泛存在于生物体组织中的膜结合酶,其中在肝脏、骨骼和肾脏中含量较多，其具有广泛的底物特异性，可以催化各种磷酸盐化合物水解。血清中ALP水平的异常与骨骼疾病、糖尿病和肝功能不全等各种疾病密切相关[Colombatto P.；Randone A.；Civitico G.；Gorin J.M.；Dolci L.；Medaina N.；Oliveri F.；Verme G.；Marchiaro G.；Pagni R.；Karayiannis P.；Thomas H.C.；Hess G.；Bonino F.；BrunettoM.R.J.Viral Hepatitis 1996,3,301-306]。此外，ALP也是生物学研究中常用的标记试剂之一，其作为酶联免疫分析的标记物时，相对于广泛使用的辣根过氧化物酶而言具有高稳定，高灵敏的优点[Xian Y.L.；Wang Z.；Jiang X.Y.ACS Nano 2014,8,12741–12747]。同时，ALP也可作为一个量化指标用于基因表达研究中。因此，建立灵敏的ALP检测方法具有非常重要的意义。
目前，ALP的检测方法主要有比色法[Zhou C.H.；Zhao J.Y.；Pang D.W.；ZhangZ.L.Anal.Chem.2014,86,2752–2759]、电化学法[Ding J.；Wang X.；Qin W.ACSAppl.Mater.Interfaces 2013,5,9488–9493]、电化学发光法[Jiang H.；WangX.M.Anal.Chem.2012,84,6986–6993]等，但是这些方法往往存在灵敏度不够高、操作复杂或重现性较差等缺点。荧光分析法由于具有成本低、操作简单、响应快速且灵敏等优点，在生物检测领域备受青睐。虽然目前已经出现了一些荧光检测ALP的方法，但是有的是利用荧光共振能量转移(FRET)原理建立的分析方法，这必须对荧光材料进行标记以及对另一个荧光供体或受体进行标记，使得检测过程既复杂又耗时[Liu J.M.；Lin L.P.；Jiao L.；CuiM.L.；Wang X.X.；Zhang L.H.；Zheng Z.Y.Talanta,2012,98,137–144]。还有一些文献报道用到有机染料的荧光信号进行检测，但荧光有机染料一般毒性较大，生物相容性不好，光不稳定且易发生荧光猝灭，这些缺点给检测造成了困扰[Wang K.；Cui J.H.；Xing S.Y.；DouH.X.Org.Biomol.Chem.2016,14,2684–2690]。随着荧光纳米材料的发展，各种具有良好发光性能的新型纳米材料逐渐兴起，尤其是近年来，环境友好型的荧光碳纳米材料凭借其具备的多种优点正越来越多的引起了研究者们的广泛关注。
碳点作为荧光碳纳米材料中的新成员，由于具有价廉易得、荧光性质优良、生物相容性好、毒性低、化学稳定性强等优越性能而成为一种颇受欢迎的荧光纳米材料。目前利用碳点作为荧光探针用于构建生物分子检测的方法大多是基于电子转移或能量转移原理的荧光猝灭法[Ren X.L.；Wei J.F.；Ren J.；Qiang L.；Tang F.；MengX.Colloid.Surface.B,2015,125,90-95；Wang Y.；Zhang L.；Liang R.P.；Bai J.M.；QiuJ.D.Anal.Chem.,2013,85,9148-9155]，而猝灭荧光法不仅检测背景高，选择性较差，并且容易受虚假信号的干扰。因此建立灵敏度高、选择性好的基于碳点的荧光信号增强的分析方法具有更大的理论和实践意义。本发明中，我们发现强氧化剂高锰酸钾能使碳点的表面基团发生氧化，从而表面结构改变进而导致其荧光猝灭；而碱性磷酸酶(ALP)的磷酸酯底物的水解产物如抗坏血酸、对氨基苯酚能使被高锰酸钾氧化的碳点表面状态恢复，从而被猝灭的荧光重新得到恢复。基于ALP的高效催化作用建立了一种新型的基于碳点的荧光信号增强的分析方法，成功实现了对ALP的高灵敏、高选择性测定。本发明的特点在于发现通过氧化还原反应调控碳点的表面状态从而调控碳点的荧光猝灭及恢复；利用ALP的高效催化作用，成功将碳点应用于ALP活性检测中。据我们所知，尚未发现利用氧化还原作用调控碳点的发光从而进行分析测定的报道。该方法具有思路新颖、操作简便、灵敏度高、选择性好等优点，为建立基于碳点荧光的增强型分析法在生物检测方面的应用拓宽了方向。
发明内容：
本发明的目的是提供一种基于碳点荧光猝灭“猝灭-恢复”的碱性磷酸酶测定方法，该方法利用化学氧化还原反应调控碳点荧光的猝灭及恢复；结合碱性磷酸酶高效催化作用可以方便、灵敏地检测碱性磷酸酶。
本发明的目的可通过如下技术措施来实现：
a、碳点的制备：将一定量的碳源与超纯水混合，搅拌形成均匀的溶液后转移至反应釜中，在180℃下加热一段时间，冷却后用二氯甲烷进行萃取或用微孔过滤器过滤得到的溶液用超纯水透析24h作为荧光探针；
b、碱性磷酸酶的测定：50μL 0.1mol/L的碱性磷酸酶底物溶液和50μL不同浓度的碱性磷酸酶溶液加入到400μL pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液中，混合并反应25分钟后加入100μL含有10μM高锰酸钾和0.35mg/mL碳点的混合液；继续反应2min后测定体系的荧光强度。
本发明所制备的碳点表面能被高猛酸钾氧化导致表面的羟基变为羧基，进而荧光猝灭；被改变的表面结构能在一些还原物质如抗坏血酸或对氨基苯酚存在下得以恢复从羧基变回羟基，从而荧光恢复至原来的状态；本发明利用磷酸酯类底物在碱性磷酸酶的催化作用下水解产生抗坏血酸或对氨基苯酚，使得被高锰酸钾猝灭的碳点的荧光得到恢复，且其恢复程度与碱性磷酸酶浓度之间呈良好的线性关系。
本发明的目的还可通过如下技术措施来实现：
所述的碳点合成时使用的碳源选自抗坏血酸、牛奶；其中抗坏血酸的浓度为0.01–0.15g/mL，牛奶与超纯水的体积比为1:1–1.25:1；混合液在反应釜中加热的时间为2–4h；碱性磷酸酶的催化底物选自抗坏血酸磷酸三钠盐、对氨基苯磷酸盐。
附图说明：
图1是发明制备的碳点的(A)红外光谱图及(B)透射电镜图。
图2是不同物质的混合溶液的荧光光谱图：(a)碳点；(b)碳点与高锰酸钾的混合物；(c)碳点与高锰酸钾的混合物中加入抗坏血酸。
图3是以抗坏血酸磷酸三钠盐为碱性磷酸酶的底物时，不同浓度碱性磷酸酶的荧光响应及测定碱性磷酸酶的线性关系图。
图4是发明的方法检测碱性磷酸酶的选择性，碱性磷酸酶浓度为0.05μg/L，其余干扰物的浓度为5μg/L。
具体实施方式：
实施实例1：
a、称取1.1g的抗坏血酸溶于25mL乙醇溶液，再与25mL超纯水混合，搅拌形成均匀溶液后转移至反应釜中，在180℃下加热4h，冷却后得到的深褐色溶液用二氯甲烷进行萃取，得到的溶液用超纯水透析24h作为荧光探针；
b、50μL 0.1mol/L的抗坏血酸三钠盐溶液和50μL不同浓度的碱性磷酸酶溶液加入到400μL pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液中，反应25min后加入100μL含有高锰酸钾(0.01mmol/L)与0.35mg/mL碳点的混合液(荧光强度记做F0)，反应2min后测定荧光强度。
实施实例2：
a、将25mL牛奶加入到20mL超纯水中，搅拌成均匀溶液后转移至反应釜中，在180℃下加热2h，冷却后用微孔过滤器过滤，得到的溶液用超纯水透析24h作为荧光探针；
b、50μL 0.1mol/L的对氨基苯磷酸钠盐溶液和50μL不同浓度的碱性磷酸酶溶液加入到400μL pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液中，反应25min后加入100μL含有高锰酸钾(0.01mmol/L)与0.35mg/mL碳点的混合液(荧光强度记做F0)，反应2min后测定荧光强度。

Claims (2)

1.一种基于碳点荧光“猝灭-恢复”的碱性磷酸酶测定方法，其特征在于：
a、碳点的制备：将一定量的抗坏血酸或牛奶作为碳源与超纯水混合，这其中抗坏血酸的浓度为0.01–0.15 g/mL，牛奶与超纯水的体积比为1:1–1.25:1，搅拌形成均匀的溶液后转移至反应釜中，在180 ℃下加热一段时间，冷却后用二氯甲烷进行萃取或用微孔过滤器过滤得到的溶液用超纯水透析24 h作为荧光探针；
b、碱性磷酸酶的测定：50 μL 0.1 mol/L的选自抗坏血酸磷酸三钠盐或对氨基苯磷酸钠盐的碱性磷酸酶底物溶液和50 μL不同浓度的碱性磷酸酶溶液加入到400 μL pH=8.5的Tris-HCl缓冲液中，混合并反应25分钟后加入100 μL含有10 μM高锰酸钾和0.35 mg/L碳点的混合液；继续反应2 min后测定体系的荧光强度。
2.根据权利要求1所述的一种基于碳点荧光“猝灭-恢复”的碱性磷酸酶测定方法，其特征在于所述碳点的制备时，混合液在反应釜中加热的时间为2–4 h。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106872433B (zh) * 2017-03-31 2019-03-08 中国农业大学 β-环糊精功能化碳点材料及其应用于检测睾酮的方法
CN108562564B (zh) * 2018-03-29 2021-04-02 青岛大学 一种用于菊糖酶活度检测的碳量子点及制备方法和应用
CN108827948A (zh) * 2018-08-08 2018-11-16 福建医科大学 基于金纳米团簇探针的酸性磷酸酶电致化学发光测定方法
CN108896769B (zh) * 2018-08-08 2020-05-22 福建医科大学 基于金纳米团簇的人β2-微球蛋白检测方法及其试剂盒
CN108872209A (zh) * 2018-08-08 2018-11-23 福建医科大学 基于纳米金簇电致化学发光探针的碱性磷酸酶测定方法
CN109270041B (zh) * 2018-10-29 2021-05-11 济南大学 一种定量检测碱性磷酸酶活性的方法
CN110501317B (zh) * 2019-08-27 2020-11-17 中国科学院长春应用化学研究所 一种碱性磷酸酶活性的荧光检测方法
CN110501318B (zh) * 2019-08-27 2020-11-13 中国科学院长春应用化学研究所 一种检测碱性磷酸酶活性的荧光方法
CN110596065B (zh) * 2019-09-25 2021-10-15 福建医科大学 基于半胱胺-n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇荧光材料的酸性磷酸酶检测方法
CN111504971B (zh) * 2020-05-11 2021-11-05 吉林大学 基于目标响应式3d打印模型与智能手机集成的2,4-二氯苯氧乙酸现场定量检测平台
CN113552107B (zh) * 2021-07-30 2023-05-26 齐鲁工业大学 纤维素基碳量子点制备在有机磷农药检测中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104267012A (zh) * 2014-06-26 2015-01-07 广西师范学院 一种利用石墨烯量子点荧光猝灭检测高锰酸钾的方法
CN104549234A (zh) * 2014-12-11 2015-04-29 江南大学 一种具有过氧化氢酶催化特性的CDs-Pt纳米材料
CN104597018A (zh) * 2015-01-22 2015-05-06 广西师范学院 一种利用荧光碳点探针检测高锰酸钾的方法
CN104597019A (zh) * 2015-01-26 2015-05-06 郑州大学 一种基于碳量子点/二氧化锰纳米片层的原位复合体系及其用于检测谷胱甘肽含量的使用方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104267012A (zh) * 2014-06-26 2015-01-07 广西师范学院 一种利用石墨烯量子点荧光猝灭检测高锰酸钾的方法
CN104549234A (zh) * 2014-12-11 2015-04-29 江南大学 一种具有过氧化氢酶催化特性的CDs-Pt纳米材料
CN104597018A (zh) * 2015-01-22 2015-05-06 广西师范学院 一种利用荧光碳点探针检测高锰酸钾的方法
CN104597019A (zh) * 2015-01-26 2015-05-06 郑州大学 一种基于碳量子点/二氧化锰纳米片层的原位复合体系及其用于检测谷胱甘肽含量的使用方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A rapid fluorescence "switch-on" assay for glutathione detection by using carbondots–MnO2 nanocomposites;Qi-YongCai et al;《Biosensors and Bioelectronics》;20150424;第72卷;第32页右栏倒数第2段至第33页右栏第3段以及示意图1
Juanjuan Liu et al."Switch-On" Fluorescent Sensing of Ascorbic Acid in Food SamplesBased on Carbon Quantum Dots−MnO2 Probe.《J. Agric. Food Chem》.2015,第64卷

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