CN113552107B - 纤维素基碳量子点制备在有机磷农药检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及碳量子点技术领域，具体涉及一种纤维素基碳量子点的制备及其在有机磷农药(OPs)检测领域的应用。以微晶纤维素和天冬氨酸为原料，一步水热法合成氮掺杂的蓝色荧光碳点。通过透射电镜、紫外光谱及荧光光谱等手段进行表征。基于内部滤光效应(PER)，借助碱性磷酸酶(ALP)分解4‑硝基苯基磷酸钠(NPP)的酶促反应，以NPP为吸收体，使碳点荧光猝灭，随着产物4‑硝基苯酚(NTP)的不断产生，荧光恢复。本申请同时提供了一种新型的有机磷农药检测方法，当检测溶液中存在OPs时，会影响NPP的分解进度，使荧光恢复的水平存在不同程度的差异。通过荧光强度的变化，直观地判断出日用水或农产品中有无有机磷农药，以达到保护环境、维护身体健康的目的。
Description
技术领域
本发明涉及荧光探针技术领域，具体涉及一种可用于检测有机磷农药的荧光碳量子点的制备方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
碳量子点(CQDs)作为碳基荧光纳米材料家族中一颗冉冉的新星，近些年的相关研究报道呈指数增长的趋势，这主要是由于碳点所具备的众多优点，如低成本，简易的制备过程，良好的生物相容性，发光种类的多样性等。目前，碳点在许多领域已经展现了良好的应用前景，例如：光电能源类器件，信息加密与防伪，生物成像与医疗，传感检测等等。由于碳点的最适宜激发波长和紫外吸收是固定的，基于内部滤光效应，只要选择合适的吸收体就可以控制荧光的猝灭与恢复。目前CQDs已经发展到对金属离子的检测。然而，很少有基于CQDs的研究用于有机磷农药(OPs)的检测的报道。
有机磷农药(OPs)作为杀虫剂广泛用于农业生产过程中，来增加农作物产量并防止疾病传播。据统计，全球农药使用量的大约有38％是有机磷农药，尤其在发展中国家的使用量较高，如乐果、敌百虫等。同时，有机磷农药也造成了严重的环境污染。由于这类化合物的大规模生产和应用，在某些地区的土壤和水中发现的有机磷残留物量远高于有毒水平(5-500mg/kg)，这可能导致这些化合物通过生物累积渗透到食物链中。OPs的富集会通过抑制乙酰胆碱酯酶(哺乳动物神经系统中的一种关键酶)的活性而使乙酰胆碱积聚，以致引起烟碱样症状以及中枢神经系统症状，严重时可因肺水肿、脑水肿、呼吸麻痹而死亡。
内部滤光效应(IFE)作为荧光传感检测的一种常见手段，在各领域有着广泛的应用。该系统中，要求荧光团的激发波长与吸收体的吸收波长一致；这种辐射屏蔽引起入射光竞争，导致荧光发射强度降低，但此过程需要选择适当的荧光材料和相应的吸收体对。例如：4-硝基苯基磷酸钠(NPP)的紫外吸收峰在312nm处，若一个荧光激发波长与之相似的荧光团与之共混并以此波长激发时，NPP就会竞争掉部分激发波，导致荧光强度变弱。
碱性磷酸酶(ALP)是广泛分布于人体组织经肝脏向胆外排出的一种酶，能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，也可较精准的作用于含有磷酸基团的类似物质。而有机磷在结构上是一种醇和磷酸或其他有机酸酐磷酸盐化合物的混合物，通常含有三个磷酸酯键。当酶促反应的溶液中含有有机磷农药时，一方面OPs能够竞争掉一部分碱性磷酸酶而被水解，从而降低体系中NPP的水解速度；另一方面能降低ALP的活性而降低NPP的水解速度。
目前尚未研究出能够直接对水体环境中有机磷农药进行荧光检测的碳量子点。故本发明提出了一种新碳量子点和一种基于此碳点以及酶促反应平台实现检测有机磷农药的新方法。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提供了一种纤维素基荧光碳量子点和新型的检测方法，碳点在该过程中能够适用于水体环境中有机磷农药的检测，在国家标准的范围内有着良好的响应效果，大大拓宽了碳点作为传感材料的应用范围。另外，本申请还提供该碳点的制备方法和检测平台的构筑，该过程简便易行，原料成本低廉，应用于生产将具有良好的经济效益。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种纤维素基碳量子点的制备方法，包括：
以微晶纤维素和天门冬氨酸为原料，采用水热法制备纤维素基碳量子点。
研究发现：以醋酸纤维素和天门冬氨酸为基本原料合成荧光碳量子点后，以4-硝基苯基磷酸钠为吸收体(NPP)，在碱性磷酸酶(ALP)作用下可水解为4-硝基苯酚(NTP)，NPP的紫外吸收峰在312nm处，与本发明制备的碳量子点共混并激发时，通过内部滤光效应能够滤掉一部分激发波，导致荧光强度变得很弱。当体系中加入ALP时，NPP的紫外吸收变为NTP的420nm，相同激发波长下内部滤光效应减弱，荧光就会恢复。NPP与NTP的紫外吸收见附图4。
本发明的第二个方面，提供了任一上述的方法制备的纤维素基碳量子点。
本发明的第三个方面，提供了上述的纤维素基碳量子点在有机磷农药检测和未知水体检测中的应用。
本发明的第四个方面，提供了一种纤维素基碳量子点检测有机磷农药的方法，包括：
向4-硝基苯基磷酸钠NPP溶液中加入待测有机农药样品，与待测样品相同量的权利要求6所述的纤维素基碳量子点，加入碱性磷酸酶ALP孵育，作为待测样；
同时，以未加入待测样品的溶液为空白样；
当酶促反应的溶液中含有有机磷农药时，降低了NPP的水解速度。荧光恢复的速度，相同的作用时间下，利用肉眼准确明了地判断待测样品中是否含有有机磷农药并大致预估其含量变得可行。
对上述的待测样、空白样分别进行荧光检测，并通过图谱分析，判定待测样品是否为有机农药。
本发明的有益效果在于：
(1)本申请提供了一种新的荧光碳量子点，用于对有机磷农药的灵敏检测，同时对该碳点的作用机理做出了解释。
(2)本申请中提供的碳量子点已用于实际样品的检测，检测结果显示该碳点对多种有机磷农药有较强选择性。
(3)本申请的操作方法简单、成本低、具有普适性，易于规模化生产。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明碳量子点检测OPs的作用机理图示意图；
图2为实施例1制得的碳量子点的透射电子显微镜图；
图3为实施例1制得的碳量子点的傅里叶红外光谱图
图4为本发明中是NPP水解前后的紫外吸收谱图；
图5为本发明中实施例1制备的碳点荧光激发、荧光发射以及NPP紫外吸收的结合谱图；
图6为实施例3中碳点在NPP、NPP+ALP、NPP+ALP+OPs环境下的荧光强度对比图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术所介绍的，简便、低成本、灵敏的荧光材料对有机磷农药(OPs)的检测仍是一项迫切的任务。为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种新型的碳点对OPs灵敏检测的方法，具体包括：
本申请第一方面，提供一种掺杂氨基酸的纤维素基碳量子点的制备方法，本申请在纤维素为原料的基础上采用水热法制备了荧光碳量子点，并在制备过程中掺杂天门冬氨酸来提高碳点的含氮量使其表面带有-NH2。
步骤一：将微晶纤维素和天门冬氨酸混合研磨均匀溶于超纯水中。混合溶液包括两种粉末，超声，形成均匀溶液。
步骤二：将溶液转移至高压水热反应釜的聚四氟乙烯内衬中，烘箱提前预热，反应十二个小时。
步骤三：冷却至室温后，将溶液再次超声处理并取上清液，以7000rpm离心30min后通过0.22μm的过滤器过滤。最后，透析三天即可得到发蓝色荧光的碳量子点。
步骤四：将溶液放在冷冻干燥机中进行冷冻干燥，获得黑色粉末。
在一些实施例中，步骤一中反应原料的质量比为1:1，步骤二中的反应温度为190℃。
本申请的第二方面，提供上述碳点的猝灭与恢复机理。
将碳点溶液和少量提前配好10-3mol/L NPP母液溶于超纯水中。通过对NPP的紫外吸收谱图(图4)进行分析，其吸收峰在312nm处，再对申请中合成的碳点进行荧光光度分析，取碳点荧光激发图谱与NPP紫外吸收的交点处的波长对碳量子点进行激发，由于NPP起到了屏蔽辐射的作用，在荧光光谱图中可以看出其与空白组荧光强度的差异。向溶液中加入少量的碱性磷酸酶，荧光强度又会一定程度的恢复。
在一些实施例中，碳点荧光激发图谱(图5中点虚线)与NPP紫外吸收(图5中实线)的交点处波长为330nm，选这一波长激发是因为既能保证碳点具有较高的荧光发射强度，也使NPP具有较强的吸光度。
在一些实施例中，碱性磷酸酶的在溶液中的浓度为5U/L，需要在37℃的环境下孵育30min。
本申请第三方面，提供上述碳量子点对有机磷农药的实际样本检测。
以杀螟硫磷(Fen)为有机磷的农药样本，向第二方面中的NPP溶液中溶解少量的杀螟硫磷，溶解相同量的碳量子点，如上加入ALP孵育30min，进行荧光光度测试，通过图谱分析，含有Fen的溶液荧光稍弱于正常的荧光恢复程度。其中，杀螟硫磷的含量为0.5mg/L，符合多种农副产品残留量的国家标准。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1荧光碳量子点的制备
制备方法步骤如下：
分别取0.5g微晶纤维素和0.5g的天门冬氨酸置于研钵中，重复研磨并混合均匀。倒入烧杯中加入35mL超纯水，搅拌并超声30min，将充分分散的溶液转移至高压水热反应釜的聚四氟乙烯内衬中，烘箱提前预热至190℃，反应12h。反应结束后将反应釜冷却至室温，取出溶液再次超声处理30min并取上清液，所得水分散溶液在7000rpm 30min离心后通过0.22μm的过滤器过滤。在分子截留量为1000的透析袋中透析三天即可得到发蓝色荧光的碳量子点。最后，将透析好的溶液置于冷冻干燥机中进行冻干，获得黑色粉末。
实施例2两相结构荧光微凝胶的TEM
事先将实施例1制得的碳量子点溶液滴加在铜网上，置于恒温培养箱中12h。拍摄所得的TEM图如图2所示，碳量子点分布均匀，平均尺寸为10nm。图3为所制备碳点的红外光谱，如图3所示，3200cm-1的宽吸收峰值对应于N-H的弯曲振动。C＝O拉伸振动，对应1671cm-1处的强峰值；由于C-N伸缩振动，会在1375cm-1处出现峰值。表明碳量子点表明链接-NH2和-COOH等官能团。
对NPP的紫外吸收谱图(图4)进行分析，其吸收峰在312nm处。
对实施例1合成的碳点进行荧光光度分析，得到碳点荧光激发、发射图谱，并与NPP紫外吸收曲线相比较，如图5所示。
实施例3荧光碳量子点对杀螟硫磷的灵敏性检测
在这个检测过程中，设置了四个对照组。第一组，将实施例1中冷冻干燥的碳量子点以1mg/mL的浓度溶解在2mL超纯水中；第二组，取提前准备好的10-3mol/L的NPP溶液200μL和2mg碳点粉末溶于1.8mL的超纯水中；组三，在超净台上将碱性磷酸酶用PBS缓冲液(0.1mol/L)进行稀释，加入到与组二相同的溶液中，37℃水浴培养30min，其中ALP的浓度为3U/mL；第四组的操作步骤与第三组相似，区别在于，加入ALP前要向溶液中加入1μL 1mg/mL的杀螟硫磷标准液，加入ALP后37℃水浴培养30min。最后，对四组溶液在330nm激发波长下进行荧光光度分析，比较荧光强度的变化。
如图6所示，加入NPP后，由于辐射屏蔽，荧光强度出现了大幅度下降；加入碱性磷酸酶后，NPP的浓度降低，辐射屏蔽效果减弱，荧光强度会有一定程度的恢复；但若溶液中含有机磷农药杀螟硫磷后，相同条件下，荧光恢复的效果减弱。从而证明，此方法可以直观地判断出日用水或农产品中是否含有有机磷农药。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种纤维素基碳量子点在有机磷农药检测和未知水体检测中的应用，其特征在于，
所述纤维素基碳量子点以微晶纤维素和天门冬氨酸为原料，采用水热法制备；
具体应用方法为：
向4-硝基苯基磷酸钠NPP溶液中加入待测有机农药样品、与待测有机农药样品相同量的上述纤维素基碳量子点，加入碱性磷酸酶ALP孵育，作为待测样；
同时，以未加入待测样品的溶液为空白样；
对上述的待测样、空白样分别进行荧光检测，并通过图谱分析，判定待测样品是否为有机磷农药。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，采用水热法制备纤维素基碳量子点具体包括如下步骤：将微晶纤维素和天门冬氨酸混合均匀，溶于溶剂中，形成混合粉末溶液；
将所述混合粉末溶液进行水热反应，得到含碳量子点的溶液；
除去含碳量子点的溶液中的不溶性沉淀物和杂质、冻干，得到纤维素基碳量子点粉末。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微晶纤维素和天门冬氨酸的质量比为1~1.5：1~1.5。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述微晶纤维素和天门冬氨酸的质量比为1：1。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，水热反应的条件为：180~210℃下反应。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，水热反应的条件为：190℃下进行反应。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，除去溶液中的不溶性沉淀物和杂质的具体步骤为：将溶液超声后，取上清液，离心、过滤，透析；
离心的条件为：7000~8000rpm离心30~40 min；
过滤采用0.22μm的过滤器。
8.一种纤维素基碳量子点检测有机磷农药的方法，其特征在于，包括：
所述纤维素基碳量子点以微晶纤维素和天门冬氨酸为原料，采用水热法制备；
其次，向4-硝基苯基磷酸钠NPP溶液中加入待测有机农药样品，与待测有机农药样品相同量的纤维素基碳量子点，加入碱性磷酸酶ALP孵育，作为待测样；
同时，以未加入待测样品的溶液为空白样；
对上述的待测样、空白样分别进行荧光检测，并通过图谱分析，判定待测样品是否为有机磷农药。
9.如权利要求8所述的纤维素基碳量子点检测有机磷农药的方法，其特征在于，取碳点荧光激发图谱与NPP紫外吸收的交点处的波长对碳量子点进行激发。
10.如权利要求8所述的纤维素基碳量子点检测有机磷农药的方法，其特征在于，所述有机磷农药为杀螟硫磷。
11.如权利要求8所述的纤维素基碳量子点检测有机磷农药的方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶的在溶液中的浓度为3~8U/L，在37~37.5℃的环境下孵育30~40min。
12.如权利要求11所述的纤维素基碳量子点检测有机磷农药的方法，其特征在于，所述碱性磷酸酶的在溶液中的浓度为5U/L，需要在37℃的环境下孵育30min。
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