CN104263717B - β‑葡萄糖苷酶磁性分子印迹材料及其在知母皂苷BII转化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种β‑葡萄糖苷酶磁性分子印迹材料，以β‑葡萄糖苷酶为模板分子，聚乙烯‑乙烯醇为交联剂，通过聚乙烯‑乙烯醇相转化法制备。制备方法简单，避免了繁琐的直接聚合方法，制备过程可控，水解效率明显提高。本发明还提供一种转化知母皂苷BII的方法，其使用所述的β‑葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物水解知母皂苷BII为知母皂苷AⅢ。

Description

β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹材料及其在知母皂苷BII转化中 的应用

技术领域

本发明涉及一种高分子聚合物材料，具体地涉及识别β-葡萄糖苷酶的磁性分子印迹聚合物。

本发明还涉及该高分子印迹聚合物材料的应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)(β-glucosidase)，属于水解酶类，又称β-D-葡萄糖苷水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶和苦杏仁苷酶。它可催化水解结合于末端非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出配基与葡萄糖体。

β-葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中，它可以来源于植物、微生物，也可来源于动物。β-葡萄糖苷酶按其底物特异性可以分为三类：第一类是能水解烃基-β-葡萄糖苷或芳香基-β-葡萄糖苷的酶，此类β-葡萄糖苷酶能水解的底物有纤维二糖、对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等；第二类是只能水解烃基-β-葡萄糖苷的酶，这类β-葡萄糖苷酶能水解纤维二糖等；第三类是只能水解芳香基-β-葡萄糖苷的酶，这类酶能水解对硝基苯-β-D-葡萄糖苷等类似物。

分子印迹技术(molecular imprinting technology，MIT)是近十几年来才发展起来的一门边缘科学技术，它结合了高分子化学、生物化学等学科，是模拟抗体-抗原相互作用的一种新技术，具有选择性识别位点的性质。在合适的溶剂中模板分子与功能单体依靠分子间作用力形成主客体配合物，再加入交联剂和引发剂，引发聚合形成稳定的高分子聚合物，即分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers,MIPs)，被广泛用来选择性富集复杂基质中目标分子。MIPs现已广泛应用于色谱分离、抗体和受体模拟物、固相萃取、生物传感器等领域，分子印迹技术已扩大到环境的分析甚至反应介质的领域中，也可用应用于生物遥感、生物分离以及靶向药物等领域。

蛋白质的成功印迹使得MIPs可有效识别大分子物质。一般来说，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，天然抗体可以用来定量蛋白质在MIPs中的吸附量。由于抗体只识别特定结构(抗原决定基)，由此可以认为许多具有特定结构的目标蛋白质毫无损伤的与MIPs结合。这样，印迹蛋白质在大多数情况下便可保持其生物活性，例如当与β-葡萄糖苷酶结合时便保持其催化活性。然而，在MIPs 的制备过程中可能会使蛋白质发生变性从而影响MIPs整体的活性。例如，近期研究发现，二甲亚砜(DMSO)可以使溶解酵素失活(Voets,I.K.,Cruz,W.A.,Moitzi,C.,Lindner,P.,Schurtenberger,[J].Phys.Chem.B 2010,114,11875-11883.)。海登发明了胰蛋白酶MIPs，固定于石英晶体监控器芯片上用于监测天然的和变性的胰蛋白酶。因此，固定酶的分子印迹材料的酶活性研究是合理并且必要的。

葡萄糖苷酶催化水解产生葡萄糖在生物资源技术领域非常重要。研究葡萄糖苷酶的固定化对于工业应用中减少酶的消耗有着十分重要的意义。通常情况下，运用生物材料固定葡萄糖苷酶对于酶活性有较大影响，并且在酶的补充过程影响葡萄糖生产操作的连续性。现有酶固定化方式主要运用温度敏感的细胞膜、天然大分子聚合物、壳聚糖材料、羟磷灰石、纤维素纤维、玻璃微球、氧化锆以及最新发现的藻朊酸盐等。由于300～400nm级的磁性壳聚糖微球可以降低分散的浓度梯度以及提高水解速率，磁性壳聚糖微球也已经用于固定化酶来提高酶的催化效能。

目前，磁性纳米颗粒结合MIPs应用于大分子靶向物质的相关研究工作已有报道。如已经成功制备了白蛋白、溶解酵素、血红蛋白和核糖核酸酶等磁性MIPs，干涉吸附试验使用非目标蛋白质等。并且许多文献已报道MIPs的可重复性研究，但是却没有对其重复利用的活性作深入探讨。在分子印迹过程中可能会导致目标蛋白的变性从而使其失去原有功能，或者是使用的溶剂，或者是功能单体，聚合物以及模板之间分子间强作用力的影响。鉴于此种情况，抗原决定基也一直是与印迹蛋白反应，因此，印迹分子蛋白应该具有一定催化活性。

Fe₃O₄磁性纳米粒子具有特殊的磁导向性、超顺磁性及表面可连接生化活性功能基团，可以有效地利用磁性纳米粒子的磁性和分子印迹的特异识别性来进行目标分子的快速磁分离。在外加磁场下，含有磁性的核壳结构分子印迹纳米球，可对目标物实现快速磁分离等特性，因此，在磁性粒子表面进行分子印迹，合成磁性分子印迹聚合物核壳微球，使其兼具良好的超顺磁性和高选择吸附性两大优点。

中药知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodel ides Begs.的干燥根茎，具有清热泻火、滋阴清肺、生津润燥等功效。知母皂苷BⅡ为中药知母中提取出来的含两个糖链的水溶性皂苷，以知母皂苷AⅢ为母核的知母皂苷BⅡ的含量很高，2010年版《中国药典》一部规定，知母药材中知母皂苷BⅡ的含量≥3％， 文献报道药材中知母皂苷BⅡ含量多在5％左右，最高可达10.25％，但知母皂苷AⅢ在知母药材中含量较低(约0.3％)。

药理研究表明，知母皂苷BⅡ具有抑制血栓形成、改善大脑缺血再灌注损伤引起的记忆及学习功能障碍及对原代大鼠神经细胞损伤的保护作用，而知母皂苷AⅢ具有抗血小板聚集、抗老年痴呆、抗肿瘤和降糖等作用。尤其在抗肿瘤方面，知母皂苷AⅢ表现出很强的药理活性，对结肠癌、宫颈癌、乳腺癌等均有抑制作用。可见知母皂苷AⅢ的药理活性要比知母皂苷BⅡ的高。

β－葡萄糖苷酶(beta glycosidase)，属于水解酶类，又纤维二糖酶。它的特性是可水解结合于末端、非还原性的β-D-糖苷键，同时释放β-D-葡萄糖和相应的配基。但是用β－葡萄糖苷酶水解知母皂苷BⅡ，得到的产物不易与β－葡萄糖苷酶分离。

英文缩写：

1.MMIPs磁性分子印迹聚合物；2.MNIPs磁性非分子印迹聚合物；3.EVAL乙烯/乙烯醇共聚物；4.SDS十二烷基硫酸钠；5.MNP磁性纳米Fe₃O₄；6.SEM扫描电镜图；7.TEM透射电镜图。

发明内容

本发明提供一种磁性分子印迹聚合物(MMIPs)，经改进后的聚乙烯-乙烯醇印迹的β-葡萄糖苷酶的活性用水解水杨苷来表征，并进行重吸附。为了能够使固定酶的印迹聚合物与反应物和产物快速分离，用磁性粒子包覆在分子印迹聚合物上。

本发明还提供应用上述β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物水解转化知母皂苷BII的方法。

根据本发明的一方面，提供一种β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹材料，以β-葡萄糖苷酶为模板分子，聚乙烯-乙烯醇为交联剂，通过聚乙烯-乙烯醇相转化法制备。

所述的β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物，优选地，以下述方法制备：

1)制备Fe3O4磁性纳米粒子，并用油酸改性。

2)在聚乙烯-乙烯醇交联剂存在下，将β-葡萄糖苷酶分子固定于Fe₃O₄磁性纳米粒子上。

所述的β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物，其中所述制备方法包括：

a)制备Fe3O4磁性纳米粒子；

b)将获得的Fe₃O₄磁性纳米粒子用油酸进行表面改性；

c)在聚乙烯-乙烯醇交联剂存在下，将β-葡萄糖苷酶分子固定于Fe₃O₄磁性纳米粒子上；

d)重吸附并在磁场条件下分离获得β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物。

所述的β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物，更优选地，以下述方法制备：

v)在乙二醇中溶解Fe₃O₄·6H₂O形成黄色溶液，在上述溶液中加入乙酸钠和聚乙二醇2000，200℃下反应，至反应完成后，用无水乙醇和去离子水分别洗涤后干燥后得Fe₃O₄磁性纳米粒子；

vi)将步骤i)的磁性纳米粒子加热加入油酸对Fe₃O₄磁性纳米粒子进行改性，反应完成后将溶液冷却至室温，用蒸馏水反复洗涤油酸包裹的Fe₃O₄直至pH＝7，然后在200℃真空下干燥，即得黑色的油酸改性的Fe₃O₄磁性纳米粒子；

vii)取以DMSO为溶剂的聚乙烯-乙烯醇澄清溶液，将β-葡萄糖苷酶溶解在上述溶液中，然后加入步骤ii)制备的Fe₃O₄磁性纳米粒子，室温下搅拌混匀；每次取0.5mL含有酶的DMSO/EVAL溶液分散在10mL的分散剂中，所述分散剂组成为：用4mL的去离子水和6mL的异丙醇组成水-异丙醇混合液为分散剂，可得磁性分子印迹聚合物；

viii)用0.1％的SDS溶液和去离子水洗步骤iii)获得的磁性分子印迹聚合物，在pH＝4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中进行重吸附，然后在磁场条件下分离获得固定β-葡萄糖苷酶的磁性分子印迹聚合物。

根据本发明的另一方面，提供一种转化知母皂苷BII的方法，其使用所述的β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物水解知母皂苷BII为知母皂苷AⅢ。

所述的方法，优选的水解反应温度为55℃，时间为2小时。

本发明将β-葡萄糖苷酶与Fe₃O₄磁性纳米粒子结合，形成β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物，在制备MMIPs中使用聚乙烯-乙烯醇为交联剂，并进行重吸附过程，制备方法简单，避免了繁琐的直接聚合方法，制备过程可控。重吸附后去除了对水解有影响的溶剂，水解效率明显提高。使用本发明的β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物可有效将知母皂苷BII水解转化为知母皂苷AⅢ。

附图简述

图1为固定β-葡萄糖苷酶的MMIPs水解水杨苷过程示意；

图2为固定β-葡萄糖苷酶的MMIPs(a)和MNIPs(b)的扫描电子显微镜照片；

图3为磁性纳米Fe₃O₄(MNP)(a)、固定β-葡萄糖苷酶的MMIPs(b)和MNIPs(c)的透射电子显微镜照片；

图4为红外光谱图：(a)油酸改性后的Fe₃O₄磁性纳米粒子，(b)MNIPs和(c)MMIPs；

图5为葡萄糖的标准曲线；

图6(a)牛白蛋白的标准曲线，(b)β-葡萄糖苷酶的标准曲线，(c)MMIPs对β-葡萄糖苷酶和牛白蛋白的吸附量；

图7为β-葡萄糖苷酶MMIPs水解水杨苷的重复性水解率；

图8为知母皂苷AⅢ和BⅡ的结构式；

图9知母皂苷BII样品的转化率；

图10为β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物水解的最佳温度；

图11为β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物水解的最佳反应时间

图12为固定β-葡萄糖苷酶MMIPs的重复使用及其对催化知母皂苷BⅡ水解性能的影响。

具体实施方式

仪器与试剂

所有仪器与配制试剂原料均为商购。

知母皂苷BⅡ，知母皂苷AⅢ：上海融禾医药科技有限公司,批号100420,纯度>98％。

DNS试剂：准确称取酒石酸钾钠300.0g完全溶于500mL蒸馏水中，标记为A试液。准确称取氢氧化钠16.0g完全溶于250mL蒸馏水中，标记为B试液。准确称取3,5-二硝基水杨酸10.0g完全溶于B试液中，标记为C试液。将C试液和A试液混合用蒸馏水定容至1000mL，标记为DNS试剂。DNS试剂用棕色瓶放置7天后，用细纱布过滤蔽光保存。

醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1mol.L,pH＝4.8)：溶液A—量取冰醋酸6mL，定容至1000mL，制成0.1mol L^-1醋酸溶液；溶液B-称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000mL，制成0.1molL^-1醋酸钠溶液。使用是以A:B＝4:6的比例混合，低温冷藏备用。

葡萄糖对照品溶液：精密称取70℃干燥至恒重的葡萄糖0.2000g，用去离子水溶解并定容至100mL，即得0.2％的葡萄糖标准溶液。

知母皂苷水解样品的制备：取四份0.5％知母皂苷各5mL分别加入到放置了未洗去葡萄糖苷酶的MMIPs、MNIPs、重吸附葡萄糖苷酶的MMIPs及不含酶的磁性纳米粒子的烧杯中，并置于55℃下，水解20min，水浴蒸干后，甲醇复溶，定容至12.5mL，用于皂苷成分的分析。

知母皂苷BⅡ的对照品溶液：取5mg的知母皂苷BⅡ定容至10mL的容量瓶中，即得0.5mg/mL的对照品溶液。

β-葡萄糖苷酶水解样品的制备：称取知母皂苷BⅡ5mg，一定量的β-葡萄糖苷酶12U，加入10mL醋酸-醋酸钠缓冲液缓冲液，于55℃反应3h，85℃水浴加热5min，灭活。水浴蒸干后，甲醇复溶，定容至12.5mL，用于皂苷成分的分析。

Ehrlish试剂：对盐酸二甲氨基苯甲醛试剂(1g对二氨基苯甲醛+30mL乙醇+30mL浓盐酸)。

β-葡萄糖苷酶的活力测定：取0.5mL酶液，加入0.5mL0.5％的水杨苷(溶剂为pH＝4.8缓冲溶液)于55℃下保存20min，然后加入1mL DNS试剂混合于沸水中保存5min，冷却后加蒸馏水至10mL，在510nm下测其吸光度值。以加热灭活的酶按同样方法处理作空白(酶活单位：每1min产生1μmol葡萄糖所需酶量为1U)。

实施例1、β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹材料的制备和性能测定

1.磁性分子印迹微球的制备

1.1磁性Fe₃O₄的制备

在40mL的乙二醇中溶解1.35g FeCl₃·6H₂O形成黄色溶液，在上述溶液中加入3.60g乙酸钠和0.10g聚乙二醇2000，搅拌30min，继而转移到聚四氟乙烯衬底的全自动不锈钢高压反应釜中。将反应釜密封并在200℃下反应8h。反应完成后，用无水乙醇和去离子水分别洗涤6次。后在真空干燥箱中60℃烘干12h。干燥后得产物。

1.2磁性纳米粒子的表面改性处理

将磁性纳米粒子加热到60℃时，逐滴加入油酸对Fe₃O₄磁性纳米粒子进行改性，搅拌反应1h,反应停止后，溶液冷却至室温，用蒸馏水反复洗涤油酸包裹的Fe₃O₄直至pH＝7，然后在200℃真空下干燥，即得黑色的油酸改性的Fe₃O₄磁性纳米粒子。

1.3酶的固定化

取20mL以DMSO为溶剂的EVAL澄清溶液(EVAL/DMSO＝1.0wt％)，将1mg/mL的β-葡萄糖苷酶溶解在上述溶液中，然后加入25mg磁性纳米粒子，室温下搅拌混匀。然后，每次取0.5mL的EVAL溶液分散在在10mL的分散剂水-异丙醇混合液中(用4mL的去离子水和6mL的异丙醇)。非印迹磁性分子的制备与上述步骤相同，只是在酶的固定化中不加入β-葡萄糖苷酶。

1.4MIPs重新吸附β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶的去除：用0.1％的SDS溶液和去离子水各洗三次。

重新吸附：重吸附在pH＝4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中进行，在30min时达到最大吸附，然后在磁场条件下分离MMIPs。将所制得的材料于低温下冻干。

2.分子印迹材料的性能检测

2.1葡萄糖标准曲线的制定

分别吸0.2％的葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管1,2,3,4,5,6号中，再加2.0mL DNS试剂，用蒸馏水将每支试管加水到10.0mL，混合后在沸水中煮沸20min，冷却后用蒸馏水稀释至25.0mL。以空白为参比溶液，用分光光度计在波长510nm下测定吸光度值。

2.1MMIPs的水解性能检测

2.2.1β-葡萄糖苷酶-MMIPs的性能检测

取0.5％水杨苷10mL分别加入到盛有重吸附β-葡萄糖苷酶的MMIPs及MNIPs、MMIPs(未脱除模板)、MMIPs(脱除模板)和MNIPs各10mg的5个50mL具塞三角瓶中，并置于55℃保持20min。经过磁性分离后，分别加入1mL DNS试剂，混匀并置于沸水中显色20min后，冷却，加蒸馏水至25mL，在510nm下测定其吸光度值。

2.3对β-葡萄糖苷酶的选择性

分别取用pH＝4.8的缓冲溶液配制的浓度均为100mg/L的β-葡萄糖苷酶和牛白蛋白的溶液各10.0mL，分别加入一定量洗去模板的MMIPs颗粒，室温下震荡12h，加入磁场分离后，用紫外-可见分光光度计分别测量上层清液的吸光度。

2.4重吸附利用率测定

将重吸附的MMIPs按2.2.1水解步骤反复实验，测量每次的吸光度，计算出水解率。

3.结果和讨论

3.1水解过程

β-葡萄糖苷酶的MMIPs对水杨苷(2-(Hydroxymethyl)phenyl-beta-D-glucopyranoside)的水解过程如图1所示。左上方烧杯为水杨苷溶液，下方烧杯内为β-葡萄糖苷酶-MMIPs(MNP为磁性纳米粒子，MMIPs为固定β-葡萄糖苷酶的MMIPs)。将固定β-葡萄糖苷酶的MMIPs加入水杨苷溶液中，MMIPs表面吸附的酶催化溶液中水杨苷发生水解反应，1分子的水杨苷生成1分子的葡萄糖和1分子水杨酸。

3.2磁性材料表征

3.2.1SEM

图2为固定β-葡萄糖苷酶的MMIPs以及MNIPs的扫描电镜图(SEM)。固定β-葡萄糖苷酶的MMIPs(图2a)表面相对于MNIPs(图2b)表面更为均匀，主要是在制备MMIPs的过程中，由于酶分子的作用使得乙烯/乙烯醇聚物包覆于磁球表面并形成均匀的空穴。

3.2.2TEM

图3为MNP、MMIPs和MNIPs的透射电镜图(TEM)。从图3a可以看出，磁性Fe₃O₄粒子基本呈球形且大小较为均匀，经测量其平均粒径大约在500nm以下；图3b和从图3c整个微球中未出现明显的分相，说明MMIPs与MNIPs均有有较高的Fe₃O₄含量，并且MMIPs和MNIPs中的MNP能够被EVAL所完全包覆，若干MNP成聚集状态。

3.2.3FTIR

图4a为油酸改性后的Fe₃O₄磁性纳米粒子的红外图谱。Fe₃O₄的吸收峰在580cm^-1附近，但由于纳米粒子的尺寸效应，基团频率发生位移。572.53cm^-1处 应是Fe₃O₄中的Fe-O的伸缩及弯曲振动而引起的特征峰。从图中可知磁性印迹聚合物具有Fe₃O₄的特征吸收峰，存在磁性微粒；3435.41cm^-1附近对应的宽吸收带是羧基O-H伸缩振动的吸收峰，2921.45和2851.76cm^-1对应为油酸分子中CH2-的伸缩振动吸收峰，2025.02cm^-1处的强吸收峰和2050cm^-1处的弱吸收峰为油酸中碳碳双键的伸缩振动。由此可以证明，油酸成功的包覆在Fe₃O₄磁性纳米粒子表面。

图4b为MNIPs的红外图谱，图4c为固定β-葡萄糖苷酶的MMIPs的红外图谱。对比可见，图4c在3422.41cm^-1处有一宽吸收带且较图4a和图4b的出峰位置蓝移，很可能是由羧基的O-H伸缩振动及聚乙烯-乙烯醇的羟基伸缩振动重叠导致出峰位置蓝移。另外，在1065.99cm^-1处的吸收峰是由聚乙烯-乙烯醇中的C-O伸缩振动所形成的，由此推断在MNP表面存在聚乙烯-乙烯醇分子。

3.3葡萄糖的标准曲线建立

图5所示为葡萄糖的标准吸附曲线，由图可知，吸光度随葡萄糖浓度呈线性变化，其中吸光度A与葡萄糖浓度c(g/mL)的关系式为A＝26.157c-0.0659，其相关系数R＝0.989。

3.4磁性印迹材料水解性能检测

重吸附β-葡萄糖苷酶的MMIPs和MNIPs、MMIPs以及MNIPs的水解率如表1所示，可知，重吸附β-葡萄糖苷酶的MMIPs对水杨苷的水解率最高，为66.4％，重吸附β-葡萄糖苷酶的MNIPs和MMIPs水解率均在20％以下，MNIPs的水解率在10％左右。由此可见，重吸附的MMIPs的水解效能最高，而在制备MMIPs的过程中由于β-葡萄糖苷酶溶解在DMSO中，其水解活性仅与重吸附β-葡萄糖苷酶的MNIPs相当，表明DMSO能破坏β-葡萄糖苷酶的结构，从而使其失去催化水解活性。

表1、MMIPs及MNIPs的吸光度和水解率

3.5印迹材料的特异性吸附

分别绘制在0.001g/L～0.01g/L的牛白蛋白和β-葡萄糖苷酶的标准曲线，如图6a与b所示，相关系数均大于0.95，表明其相关性良好。为进一步验证制备得到的β-葡萄糖苷酶MMIPs的印迹效果，考察了其对β-葡萄糖苷酶及其结构类似物的吸附效果，结果见图6c，可以明显看出，所制备的β-葡萄糖苷酶MMIPs对β-葡萄糖苷酶具有很好的选择性，而对牛白蛋白有极小的吸附能力，这主要是由于牛白蛋白与MMIPs不匹配，不能与其中的位点特异结合。

3.6重吸附的MIPs水解次数测定

图7为水解率随水解次数的变化图，可明显看出，在11次以前β-葡萄糖苷酶的水解率没有发生明显的下降，保持在在70％左右，第12次使用此印迹聚合物时，水解率下降到50％，随后几次使用一直稳定在30％左右。由此可以得出，固定β-葡萄糖苷酶的MMIPs大约可以重复使用11次左右。

4.结论

研究了MMIPs的制备方法和MMIPs对β-葡萄糖苷酶固定作用，并对所制备的MMIPs材料的水解性能进行了研究。实验结果表明，MMIPs对β-葡萄糖苷酶具有较好的特异性吸附性能，β-葡萄糖苷重吸附MMIPs表面时其对水杨苷的催化水解活性几乎未受影响，并且重复使用11次仍能保持较高的水解活性，而DMSO可使β-葡萄糖苷酶失去活性。因此，这对于发展酶固定化新技术，提高催化酶的利用率，降低生产成本和提高生产率具有重要意义。

实施例2、用MMIPs转化知母皂苷BII

1、MMIPs的催化水解实验

吸取5mL 0.05mg/mL知母皂苷BⅡ加入到按照实施例1制备的分子印迹材料：重吸附β-葡萄糖苷酶的MMIPs、MMIPs(未脱除模板)、MMIPs(脱除模板)和MNIPs中，并置于55℃保存20min。水解完成后，将溶液静置，用磁铁分离出磁性材料，将溶液注入比色管中，加入DNS2mL，水3mL，显色总体积为10mL，混合后在沸水中煮沸20min，冷却后用蒸馏水稀释至25mL，静置20min注入比色皿，以空白溶液为参比，在510nm波长处测定吸光度。

2、知母皂苷BⅡ的水解鉴定

做知母皂苷BⅡ的水解鉴定之前，我们必须知道知母皂苷BⅡ和AⅢ的化学结构，明白水解的原理，以此为根据才能进行后续的步骤，这是非常关键的。它们的结构如图8。

从图8可以清楚的看到知母皂苷BⅡ和AⅢ的化学结构上的区别。甾体皂苷的皂苷元基本骨架属于螺甾烷的衍生物，依照螺甾烷结构中C-25的构型和F环的环合状态，可将其分为四种类型：1.螺甾烷醇类C-25为S构型；2.异螺甾烷醇类C-25为R构型；3.呋甾烷醇类，F环为开链型衍生物；4.变形螺甾烷醇类F环为五元四氢呋喃环。

知母皂苷BⅡ，是F环开裂衍生的苷，属于呋甾烷醇类，为双糖链皂苷，C-26位的易被β-葡萄糖苷酶水解，失去葡萄糖，同时F环重新环合，转为具有正常螺甾烷侧链的知母皂苷AⅢ，分子中C-3位或其他位置上的羟基所形成的甘健仍保留甘健结合的状态。而知母皂苷AⅢ属于螺甾烷醇类，为单糖链皂苷。

分别精密吸取知母皂苷BⅡ的对照品和供试品溶液各0.5ml，分别置具塞试管中，挥干溶剂，加入Ehrlish试剂0.5ml摇匀，与100℃水浴中保温15min，取出立即置冰水浴中5min，取出后加入无水乙醇甲醇3ml摇匀。可以看到两个试管中的溶液颜色有明显的区别。一个试管显微红色，另一个试管不显色，显色的是知母皂苷BⅡ的标准品，几乎不显色的是被β-葡萄糖苷酶水解的知母皂苷BⅡ样品。由此可知，知母皂苷BⅡ能被β-葡萄糖苷酶水解发生转化。因为β-葡萄糖苷酶能水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基，并结合上述的结构分析，可知母皂苷BⅡ能够转化为知母皂苷AⅢ，且在Ehrlish试剂中不显色。

3.印迹材料和非印迹材料的催化水解能力比较

取四份0.5％知母皂苷BⅡ各5mL分别加入到盛有重吸附β-葡萄糖苷酶的MMIPs、MMIPs(未脱除模板)、MMIPs(脱除模板)和MNIPs的四个烧杯中，并置于55℃保存20min。

将四种样品溶液静置，用磁铁分离出磁性材料，将溶液注入比色管中，加入DNS2mL，水3mL,显色总体积为10mL，混合后在沸水中煮沸20min，冷却后用蒸馏水稀释至25mL，静置20min注入比色皿，以水为参比，在510nm波长处测定吸光度，并计算各样品的水解度。结果见图9。

由图9分析可知：非印迹聚合物的水解效率为1.5％，未脱除模板的印迹聚 合物水解效率为21.8％，脱除模板的印迹聚合物水解效率为2.0％，重吸附酶的分子印迹聚合物水解效率为55.1％。印迹聚合物的水解效率比非印迹的水解效率好，是因为在制备印迹聚合物的过程中葡萄糖苷酶一部分已经变性失活；脱除模板的印迹聚合物、非印迹聚合物的水解效率差不多，是因为非印迹聚合物没有吸附酶，不存在酶的催化作用；重新吸附β-葡萄糖苷酶的印迹聚合物水解效率明显提高，是因为β-葡萄糖苷酶重新吸附到印迹聚合物表面其生物活性几乎未受影响，仍具有较高的催化水解能力。

4.β-葡萄糖苷酶磁性印迹纳米材料的催化水解条件

4.1水解的最佳温度

称取知母皂苷BⅡ20mg，β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物25mg，加入pH 4.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液20mL，分别于37℃，45℃，55℃，60℃，70℃，80℃反应2h。经计算得知母皂苷AⅢ的转化率分别为49.0％，56.6％，62.0％，61.0％，60.2％，42.6％。

如图10表明酶解反应在55℃时转化率最高，之后随温度升高至80℃，转化率降低明显，说明温度太高可能会使酶活性减弱。

4.2水解的最佳反应时间

称取知母皂苷BⅡ20mg，β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物25mg，加入pH 4.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液20mL，分别于55℃反应0.5h，1.0h，1.5h，2.0h，2.5h，3.0h。经计算得知母苷AⅢ转化率分别为40.0％，52.3％，60.0％，71.9％，59.8％，50.0％。

如图11表明酶解反应在2h时转化率最高，之后随时间延长，转化率降低明显，说明时间太长可能会使酶活性减弱。

4.3.固定酶MMIPs的重复使用及其对催化水解性能的影响

取0.05mg/mL知母皂苷BⅡ5mL加入到含有固定酶MMIPs的玻璃容器中，并置于55℃保存20min，将溶液静置，用磁铁分离出磁性材料，将溶液注入比色管中，加入DNS 2mL，水3mL，显色总体积为10mL，混合后在沸水中煮沸20min，冷却后用蒸馏水稀释至25mL，静置20min注入比色皿，以空白溶液为参比，在510nm波长处测定吸光度。如此反复进行多次实验，图12中n代表：水解次数。

从图12中可看出，水解次数在12次之前，吸光度没有明显的变化，水解 效率一直维持在50％以上，水解次数在13次的时候，吸光度有明显的下降，下降到40％；水解14次之后，水解效率已下降到20％，然后随后几次一直维持在20％左右。因此，根据MIPs水解能力的测定的实验，可知MIPs具有高度的稳定性和相当长的使用寿命，使用12次之后，性能有明显的减弱，同时提高酶的利用效率。

4结语

利用新制备的重吸附β-葡萄糖苷酶的MMIPs、MMIPs(未脱除模板)、MMIPs(脱除模板)和MNIPs研究了知母皂苷BⅡ的水解度并对其催化水解活性进行了评价。通过实验得到以下结论：重新吸附葡萄糖苷酶MMIPs的催化水解性能优于MMIPs(未脱除模板)和MMIPs(脱除模板)；重新吸附葡萄糖苷酶MMIPs的多次重复使用表明，通过重吸附方式将β-葡萄糖苷酶固定在MMIPs表面具有很高的稳定性和较长的使用寿命，重复使用12次之久，水解能力仍没有明显减弱；最佳条件下，重新吸附葡萄糖苷酶MMIPs将知母皂苷BⅡ水解转化为知母皂苷AⅢ的水解率为71.9％。因此，分子印迹技术与磁性材料的结合将是绿色化学领域强有力工具之一。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均属于本发明的范围。

Claims (1)

1.一种转化知母皂苷BII的方法，其特征在于使用β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物水解知母皂苷BII为知母皂苷AⅢ,所述转化的步骤为：

称取知母皂苷BII 20mg，β-葡萄糖苷酶的磁性分子印迹聚合物25mg，加入pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液20mL，于55℃反应2h；

所述β-葡萄糖苷酶磁性分子印迹聚合物的制备方法为：

i)在乙二醇中溶解FeCl₃·6H₂O形成黄色溶液，在上述溶液中加入乙酸钠和聚乙二醇2000，200℃下反应，至反应完成后，用无水乙醇和去离子水分别洗涤后干燥后得Fe₃O₄磁性纳米粒子；

ii)将步骤i)的磁性纳米粒子加热加入油酸对Fe₃O₄磁性纳米粒子进行改性，反应完成后将溶液冷却至室温，用蒸馏水反复洗涤油酸包裹的Fe₃O₄直至pH＝7，然后在200℃真空下干燥，即得黑色的油酸改性的Fe₃O₄磁性纳米粒子；

iii)取以DMSO为溶剂的聚乙烯-乙烯醇澄清溶液，将β-葡萄糖苷酶溶解在上述溶液中，然后加入步骤ii)制备的Fe₃O₄磁性纳米粒子，室温下搅拌混匀；每次取0.5mL含有酶的DMSO/EVAL溶液分散在10mL的分散剂中，所述分散剂组成为：用4mL的去离子水和6mL的异丙醇组成水-异丙醇混合液为分散剂，可得磁性分子印迹聚合物；

iv)用0.1％的SDS溶液和去离子水洗步骤iii)获得的磁性分子印迹聚合物，在pH＝4.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中进行重吸附，然后在磁场条件下分离获得固定β-葡萄糖苷酶的磁性分子印迹聚合物。