CN109593523A - 一种真菌菌丝氮硫自掺杂碳点的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

一种真菌菌丝氮硫自掺杂碳点的制备方法及应用，属于荧光碳纳米材料的研究领域。制备步骤如下：(1)首先利用生物合成技术制备真菌菌丝，先将菌丝在PDA固体培养基中恒温培养，然后将菌丝接种于改性PDA液体培养基中，于恒温振荡器中培养，最后对菌丝进行纯化；(2)以上述菌丝为原料，在水热条件下一步合成氮硫自掺杂碳点(N,S‑CDs)。本发明首次采用生物合成与水热相结合的方法，制备了性能优异的N,S‑CDs。N,S‑CDs可对四环素类抗生素(TCs)进行高选择性、高灵敏性检测，当TC浓度在0.5～38.46μM时，线性相关系数为0.991，对TC检出限为0.041μM。利用该N,S‑CDs制备荧光检测试纸可对养殖废水中的TCs进行快速检测。而N,S‑CDs不会影响细胞的存活率，使其在细胞成像领域具有很大的应用潜力。

Description

一种真菌菌丝氮硫自掺杂碳点的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及荧光碳纳米材料，具体涉及一种真菌菌丝氮硫自掺杂碳点的制备方法，及将制备的真菌菌丝氮硫自掺杂碳点应用于TCs的检测和细胞成像。
背景技术
随着水产品需求的日益增长，高密度集约型的水产养殖方式逐渐形成。抗生素被广泛应用于预防和治疗鱼类疾病或促进鱼类生长和繁殖，尤其是四环素类抗生素，作为一种广谱性抗生素，广泛使用在水产养殖中用于治疗革兰式阳性菌和阴性菌感染。四环素类抗生素主要包括TC、CTC、OTC和强力霉素(DOXC)，水产养殖中使用最多的主要是前三种。而不合理地使用四环素会导致不安全的残留物水平，并且残留物还可促进细菌耐药性的增加。因此，在养殖废水排放之前对其中的TCs进行检测显得尤为重要。然而，由于水产养殖废水成分复杂，在TCs的检测过程中可能会受到其他成分的干扰。传统的检测方法，如高效液相色谱法、液相色谱-质谱连用法、化学发光法和比色分析法等因仪器昂贵、检测极限较高、测试过程复杂等缺点，加上复杂的仪器和检测过程以及复杂的样品制作过程，限制了这些方法的使用。因而，开发出一种简单、可靠以及直观的检测方法依然迫在眉睫。
碳量子点(CDs)是一种新型的纳米材料，具有强烈的荧光性能，在传感、荧光生物成像、催化、药物输送和光电子等领域备受关注。其最广泛的应用是CDs作为荧光探针检测多种化合物，这些应用是基于分析物与CDs表面官能团的相互作用，导致CDs荧光的猝灭或增强来实现的。因此，对CDs表面进行处理是十分重要的，杂原子掺杂(氮、磷、硫、硼和氟等)是最有效的方法之一。目前已经有很多文献报道了CDs中杂原子的掺杂，但他们大都需要外来化学试剂的修饰。通过生物合成技术制备的真菌菌丝是一种富含蛋白质、氨基酸、多糖和维生素的丝状物质。由于真菌菌丝的组成及内部蓬松的结构，使其很容易碳化成具有强光致发光性能的N,S-CDs。此外，真菌菌丝的营养物质在生长过程中合成，加之生物合成工艺简单、廉价环保，非常适合大批量生产。利用生物合成的真菌菌丝制备的N,S-CDs具有良好的水溶性、优异的生物相容性、稳定性和理想的荧光发射，在细胞成像和环境检测等领域都有潜在的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用生物合成技术和水热合成方法结合的方式制备真菌菌丝自掺杂N,S-CDs的制备方法，该方法制备的N,S-CDs中N和S元素的含量较高，荧光量子产率可达28.11％，对TCs具有特异性荧光猝灭效果，可用于养殖废水中TCs的检测及生物成像分析。
本发明一种真菌菌丝氮硫自掺杂碳点的制备方法及应用，具体按下述步骤进行：(1)利用生物合成技术合成真菌菌丝。将真菌菌丝在PDA固体培养基中25℃环境条件下恒温培养，待菌丝长满表面，然后将上述菌丝接种于改性PDA液体培养基中，置于恒温振荡器中培养，最后用稀碱液对真菌菌丝进行纯化，煮沸，去离子水洗涤至中性，冷冻干燥备用；(2)以上述生物合成的真菌菌丝为原料，取1～5g真菌菌丝加入到25mL的去离子水中磁力搅拌，形成均匀的混合物；(3)将混合物转移至50mL的水热反应釜中，在均相反应器中下反应；(4)待反应结束以后，将其自然冷却并降至室温，然后将得到的深棕色液体在在转速为5000～8000rpm下离心15min去除大颗粒；(5)将得到液体用0.22μm过滤膜过滤，用透析袋在玻璃容器中透析，得到纯净的棕色液体。
本发明制备的N,S-CDs主要呈球形，且尺寸分布均匀(5.5～7.5nm)，分散性较好；具有很好的亲水性、优异的荧光稳定性、良好的光致发光性能和较低的细胞毒性，它可以被HepG2细胞内化，表明了N,S-CDs在细胞成像中的潜在应用；基于TCs与N,S-CDs之间强烈的分子间相互作用，N,S-CDs被用作荧光传感器来检测TCs。当TC、CTC和OTC的浓度分别在0.5～38.46μM、5～38.46μM和5～47.62μM范围内时，它们相应的线性相关系数(R2)分别是0.991、0.991和0.997，N,S-CDs对TC、CTC和OTC相应的检出限分别是0.041μM、0.1263μM和0.222μM。并且利用N,S-CDs制备的简易试纸可以对养殖废水中的TC进行快速检测。本发明的制备技术工艺简单、易于操作并且环保无污染，在环境检测领域有很大的应用潜力。
附图说明
图一为N,S-CDs的透射电镜图和尺寸分布图；
图二为N,S-CDs在不同激发波长下的荧光光谱图；
图三为N,S-CDs溶液随TCs浓度变化的荧光发射光谱图；
图四为N,S-CDs制备的试纸在不同浓度TC存在时在紫外灯下的照片；
图五为N,S-CDs标记的人肝癌细胞(HepG2)荧光显微镜图。
具体实施方式
这些实施例仅限于说明本发明，但本发明并不局限与这些实施例。
实施例1：
本发明一种真菌菌丝氮硫自掺杂碳点的制备方法及应用，具体按下述步骤进行：利用生物合成技术合成真菌菌丝。将真菌菌丝在PDA固体培养基中25℃环境条件下恒温培养，待菌丝长满表面，然后将上述菌丝接种于PDA液体培养基中，置于160r/min的恒温振荡器中，25℃培养10d，最后用浓度为0.5mol/L的稀碱液对真菌菌丝进行纯化，煮沸时间为30min，去离子水洗涤至中性，冷冻干燥备用；(2)以上述生物合成的真菌菌丝为原料，取2g加入到25mL的去离子水中，磁力搅拌30min，形成均匀的混合物；(3)将混合物转移至50mL的水热反应釜中，在均相反应器中200℃下反应8h；(4)待反应结束以后，将其自然冷却并降至室温，然后将得到的深棕色液体在5000rpm下离心15min去除大颗粒；(5)将得到液体用0.45μm的过滤膜过滤，用100～1000Da透析袋在玻璃容器中透析12～48h，得到纯净的棕色液体。其荧光量子产率(以硫酸奎宁作为参比)为14.51％。
实施例2
利用生物合成技术合成真菌菌丝。将真菌菌丝在PDA固体培养基中25℃环境条件下恒温培养，待菌丝长满表面，然后将上述菌丝接种于改性PDA液体培养基(氨基酸与PDA液体培养基的质量比是1:15)中，置于120～160r/min的恒温振荡器中，25～30℃培养6～14d，最后用稀碱液对真菌菌丝进行纯化，去离子水洗涤至中性，冷冻干燥备用；以上述生物合成的真菌菌丝为原料，取1g加入到25mL的去离子水中，磁力搅拌30min，形成均匀的混合物；将混合物转移至50mL的水热反应釜中，在均相反应器中180℃下反应6h；待反应结束以后，将其自然冷却并降至室温，然后将得到的深棕色液体在8000rpm下离心15min去除大颗粒；将得到液体用0.22μm的过滤膜过滤，用100Da透析袋在玻璃容器中透析48h，得到纯净的棕色液体。其荧光量子产率(以硫酸奎宁作为参比)为16.23％。
实施例3
利用生物合成技术合成真菌菌丝。将真菌菌丝在PDA固体培养基中25℃环境条件下恒温培养，待菌丝长满表面，然后将上述菌丝接种于改性PDA液体培养基(氨基酸与PDA液体培养基的质量比是1:10)中，置于120r/min的恒温振荡器中，30℃培养5d，最后用稀碱液对真菌菌丝进行纯化，去离子水洗涤至中性，冷冻干燥备用；以上述生物合成的真菌菌丝为原料，取1.5g加入到25mL的去离子水中，磁力搅拌30min，形成均匀的混合物；将混合物转移至微波炉中，在微波炉中100℃下反应5min；待反应结束以后，将其自然冷却并降至室温，然后将得到的深棕色液体在8000rpm下离心15min去除大颗粒；将得到液体用0.22μm的过滤膜过滤，用100Da透析袋在玻璃容器中透析48h，得到纯净的棕色液体。其荧光量子产率(以硫酸奎宁作为参比)为17.47％。
实施例4
利用生物合成技术合成真菌菌丝。将真菌菌丝在PDA固体培养基中25℃环境条件下恒温培养，待菌丝长满表面，然后将上述菌丝接种于PDA液体培养基中，置于160r/min的恒温振荡器中，25℃培养10d，最后用稀碱液对真菌菌丝进行纯化，去离子水洗涤至中性，冷冻干燥备用；以上述生物合成的真菌菌丝为原料，取5g加入到25mL的去离子水中，磁力搅拌30min，形成均匀的混合物；将混合物转移至50mL的水热反应釜中，在均相反应器中160℃下反应8h；待反应结束以后，将其自然冷却并降至室温，然后将得到的深棕色液体在5000～8000rpm下离心15min去除大颗粒；将得到液体用0.22μm的过滤膜过滤，用100Da透析袋在玻璃容器中透析48h，得到纯净的棕色液体。其荧光量子产率(以硫酸奎宁作为参比)为15.18％。
实施例5
利用生物合成技术合成真菌菌丝。将真菌菌丝在PDA固体培养基中25℃环境条件下恒温培养，待菌丝长满表面，然后将上述菌丝接种于改性PDA液体培养基(氨基酸与PDA液体培养基的质量比是1:15)中，置于160r/min的恒温振荡器中，25℃培养10d，最后用稀碱液对真菌菌丝进行纯化，去离子水洗涤至中性，冷冻干燥备用；以上述生物合成的真菌菌丝为原料，取2.5g加入到25mL的去离子水中，磁力搅拌30min，形成均匀的混合物；将混合物转移至50mL的水热反应釜中，在均相反应器中80℃下反应6h。得到的液体依然是悬浮液的状态，未能得到碳点溶液。
实施例6
利用生物合成技术合成真菌菌丝。将真菌菌丝在PDA固体培养基中25℃环境条件下恒温培养，待菌丝长满表面，然后将上述菌丝接种于改性PDA液体培养基(氨基酸与PDA液体培养基的质量比是1:5)中，置于160r/min的恒温振荡器中，25℃培养10d，最后用稀碱液对真菌菌丝进行纯化，去离子水洗涤至中性，冷冻干燥备用；以上述生物合成的真菌菌丝为原料，取3g加入到25mL的去离子水中，磁力搅拌30min，形成均匀的混合物；将混合物转移至50mL的水热反应釜中，在均相反应器中240℃下反应10h；待反应结束以后，将其自然冷却并降至室温，然后将得到的深棕色液体在8000rpm下离心15min去除大颗粒；将得到液体用0.22μm的过滤膜过滤，用1000Da透析袋在玻璃容器中透析12～48h，得到纯净的棕色液体。其荧光量子产率(以硫酸奎宁作为参比)为19.12％。

Claims (3)

1.一种真菌菌丝氮硫自掺杂碳点的制备方法及应用，其特征是：该方法包括如下步骤：
(1)利用生物合成技术制备真菌菌丝。将真菌菌丝在PDA固体培养基中25℃环境条件下恒温培养，待菌丝长满表面，然后将上述菌丝接种于改性PDA液体培养基中，置于恒温振荡器中转速为120～160r/min，温度为25～30℃培养6～14d，最后用浓度为0.1～1mol/L稀碱液对真菌菌丝进行纯化，煮沸时间为10～30min，去离子水洗涤至中性，冷冻干燥备用；(2)以上述生物合成的真菌菌丝为原料，取1～5g的真菌菌丝加入到25mL去离子水中，磁力搅拌30min，形成均匀的混合物；(3)将混合物转移至50mL的水热反应釜中，在均相反应器中160～240℃下反应4～12h；(4)待反应结束以后，将其自然冷却并降至室温，然后将得到的深棕色液体在转速为5000～8000rpm下离心15min去除大颗粒；(5)将得到液体用0.22μm的过滤膜过滤，用截留分子量为100～1000Da的透析袋在玻璃容器中透析12～48h，得到纯净的棕色液体。
得到的N,S-CDs可以对TCs产生强烈的响应，可以用于检测养殖废水中的TCs。并且可以将其制成简易试纸，对养殖废水中TCs进行快速检测。
2.根据权利要求1所述的一种真菌菌丝氮硫自掺杂碳点的制备方法及应用，其特征是：步骤(1)中所用的改性PDA液体培养基是以氨基酸为改性剂，氨基酸为甘氨酸、赖氨酸或者是半胱氨酸中的一种或多种；氨基酸与PDA液体培养基的质量比是1:15～1:5。
3.根据权利要求1所述的一种真菌菌丝氮硫自掺杂碳点的制备方法及应用，其特征是：步骤(1)～(3)中采用水热合成与生物合成技术相结合的方法制备出真菌菌丝氮硫自掺杂碳点。
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