CN108866128A

CN108866128A - 一种提高春雷霉素生物效价方法

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Publication number: CN108866128A
Application number: CN201810817178.3A
Authority: CN
Inventors: 潘忠成; 翁婧; 邓钊; 张楠; 秦秋菊; 盖希维; 李向荣; 郭秀艳; 李蒲民
Original assignee: Shaanxi Microbe Bio-Technology Co Ltd
Current assignee: Shaanxi Microbe Bio-Technology Co Ltd
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2038-07-24
Also published as: CN108866128B

Abstract

本发明涉及一种提高春雷霉素生物效价的方法，小金色链霉菌普通培养基由黄豆粕粉、NaCl、玉米浆干粉、麦芽糖、鱼油、KH₂PO₄、肌醇构成，优化的培养基是在普通培养基基础上添加生长因子和微量元素。小金色链霉菌在添加生长因子和微量元素培养基进行培养，春雷霉素效价提高了19.7%，单罐产量提高了10.8%。利用该种培养基培养小金色链霉菌能显著提高春雷霉素生物效价和单罐产量。

Description

一种提高春雷霉素生物效价方法

技术领域

本发明属于生物发酵的技术领域，具体涉及一种提高春雷霉素生物效价方法。

背景技术

春雷霉素（Kasugamycin）又叫春日霉素、加收米，是一种防治农作物病害的微生物源农用杀菌剂，其化学名为（5-氨基-2-甲基-6-（2，3，4，5，6-羟基环己基氧代）四氢吡喃-3-基）氨基-α-亚氨醋酸，分子式C₁₄H₂₅N₃O₉，分子量 379.4。春雷霉素纯品为白色结晶；盐酸盐为白色针状或片状结晶，纯品熔点：236～239℃分解，盐酸盐熔点：202～204℃(分解），易溶于水，在25℃水中溶解12.5%（W/V)，不溶于甲醇、乙醇、丙酮、苯等有机溶剂。其结构式如下式所示：

春雷霉素对人畜无毒、无残留、无污染，符合现代环保要求，被农业部列为无公害农产品生产推荐生物农药。随着人们对农药安全意识的提高，春雷霉素高效、广谱、无公害的生物特性展示了越来越广泛的市场前景。

春雷霉素发酵工艺是由从小金色链霉菌的培养到春雷霉素原药获取的整体制备工艺，其工艺过程如图1所示。

如何提高小金色链霉菌在发酵罐的生物效价，通过提高每罐的春雷霉素效价来提高单罐产量和含量，在生产实际中春雷霉素通过上述图1的生产工艺，在现有优化后的培养基下发酵小金色链霉菌的生物效价通常为12000-12500µg/L，30吨的发酵罐的单罐产量通常为316-330Kg。如何进一步提高小金色链霉菌在发酵过程中的生物效价，存在如下技术瓶颈：

（1）基于响应面对小金色链霉菌培养基进行优化，小金色链霉菌在优化的培养基培养，在温度为25℃、通气量为600L/h、搅拌转速为200rpm、罐压为0.02MPa的条件下对接种好的小金色链霉菌进行发酵培养，发酵时间为168～170h时，春雷霉素生物效价在实验摇瓶下通常为3850-4250µg/L；

（2）通过ARTP等技术诱变育种能提高小金色链霉菌的春雷霉素生物效价，一般提高为10-15%，但一般生产企业缺乏实验条件和相关设备，其诱变育种存在稳定遗传性等相关问题；

（3）春雷霉素发酵工艺优化情况下，当小金色链霉菌的春雷霉素效价一般能提高为15-30%。

中国专利申请CN107828702A公开了一种春雷霉素发酵培养基及发酵方法，包括如下步骤：（1）配置培养基，将培养基消毒，灭菌；所述的培养基的配方为：黄豆粕粉5.0～8.0%；NaCl：0.3～0.5%；玉米浆干粉：0.5～1.0%；麦芽糖：2.0～2.5%；鱼油：3.5～4.0%；KH₂PO₄：0.03～0.05%；肌醇：0.01%～0.05%；pH值为6.8～7.2；（2）在培养基中接种小金色链霉菌株，接种量为10～15vol%，在28～30℃发酵168～170h，对发酵产物过滤，取滤液，即得。本发明实现春雷霉素发酵效价提高，发酵周期缩短，从而达到降低生产成本，提升产品品质。

针对上述问题，如何在现有培养基的基础上，进一步优化培养基的配方，使小金色链霉菌通过该培养基进行发酵，能显著提高春雷霉素的生物效价和单罐产量。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供一种提高春雷霉素生物效价方法，在优化春雷霉素普通培养基的情况下，往普通培养基添加生长因子和微量元素来实现。

本发明采用如下技术方案：一种提高春雷霉素生物效价的方法，春雷霉素发酵培养基各物质的质量百分比：黄豆粕粉5.0～8.0%；NaCl：0.3～0.5%；玉米浆干粉：0.5～1.0%；麦芽糖：2.0～2.5%；鱼油：3.5～4.0%；KH₂PO₄：0.03～0.05%；肌醇：0.01%～0.05%；生长因子0.010-0.020%、微量元素0.02-0.012%，pH值为6.8～7.2；按上述比例配置培养基，该培养基灭菌消毒后，接种小金色链霉菌。

在本发明的优选的实施方式中，所述的春雷霉素发酵培养基各物质的质量百分比：黄豆粕粉8.0%、NaCl 0.5%、玉米浆干粉0.8%、麦芽糖2.5%、鱼油3.5%、KH₂PO₄0.03%、肌醇0.03%、生长因子0.010-0.020%、微量元素0.02-0.012%，双蒸水补至100%，pH值为7.0。

进一步的，所述的生长因子的含量为0.017%。

进一步的，所述的微量元素的含量为0.006%。

进一步的，所述的小金色链霉菌的接种量以体积比计为10-15%。

进一步，所述的生长因子组成：维生素B₁，0.001mg；尼克酸，0.1mg；对氨基苯甲酸，0.1mg；生物素，0.001mg。

进一步，所述的微量元素的组成：FeCl₃·6H₂O：5mg；CuSO₄·6H₂O：0.05mg；H₃BO₄：1mg；MnCl₂·4H₂O：0.05mg；ZnSO₄·7H₂O：1mg；Co(NO₃)·6H₂O：0.5mg。

进一步，春雷霉素培养基除生长因子和微量元素外，其余物质进行高压灭菌消毒，生长因子与微量元素采用灭菌蒸馏水配置后进行微孔滤膜过滤消毒。

进一步，所述的微孔滤膜的孔径为0.22µm。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的小金色链霉菌普通培养基由黄豆粕粉、NaCl 、玉米浆干粉、麦芽糖、鱼油、KH₂PO₄、肌醇构成，通过往普通培养基添加生长因子和微量元素有效的优化了春雷霉素普通培养基，未加微量元素组和生长因子组与添加微量元素和生长因子组对比实验表明：30吨发酵罐的春雷霉素生物效价：未添加组为11500µg/L，添加组为 13750µg/L；未添加组的单罐产量为316kg,添加组单罐产量为340kg。小金色链霉菌在添加生长因子和微量元素培养基进行培养，春雷霉素效价提高了19.7%，单罐产量提高了10.8%。利用该种培养基培养小金色链霉菌能显著提高春雷霉素生物效价和单罐产量。另一方面能降低企业单位产能能耗、节约成本。

附图说明

下面结合附图进一步说明：

图1为春雷霉素生产工艺流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚，本发明用以下具体实施例进行说明，但本发明绝非限于这些例子。本发明所采用的测试手段如下：

1、春雷霉素质量分数的测定

所述试剂如下：

乙腈：色谱纯；水：新蒸二次蒸馏水；春雷霉素盐酸盐水合物标样：已知质量分数≥80.0%。

所述仪器如下：

高效液相色谱仪：具有可变波长紫外检测器；色谱数据处理机；色谱柱：150mm×3.9mm（id）不锈钢色谱柱，Waters symetryshield RP18，粒径5μm；微量进样器：50μL。

高效液相色谱操作条件如下：

流动相：0.5%十二烷基硫酸钠水溶液∶乙腈= 80∶20（v/v），用磷酸调pH值为2.5。

流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；温度:25℃；进样体积：10μL；保留时间：春雷霉素约10.7min。

计算：

将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中春雷霉素的面积分别进行平均，试样中春雷霉素的质量分数ω₁（%）按式（1）计算：

式中： A ₁――标样溶液中，春雷霉素峰面积的平均值；

A ₂――试样溶液中，春雷霉素峰面积的平均值；

m ₁――春雷霉素标样的质量，单位为克(g)；

m ₂――试样的质量，单位为克(g)；

ω――标样中春雷霉素的质量分数（%）。

实施例1

春雷霉素发酵培养基各物质的质量百分比：黄豆粕粉8.0%、NaCl 0.5%、玉米浆干粉0.8%、麦芽糖2.5%、鱼油3.5%、KH₂PO₄0.03%、肌醇0.03%、微量元素的质量百分比为0.002%、0.004%、0.006%、0.008%、0.010%、0.012%，双蒸水补至100%，按上述比例配置培养基，该培养基灭菌消毒后，接种小金色链霉菌至体积300m L摇瓶里，每摇瓶接种量150m L，一定质量百分比的微量元素组设置三个平行样组，另设未添加微量元素组（对照组）、添加微量元素为实验组。所有的摇瓶样品在生物摇床里178h连续培养后进行春雷霉素测定，其培养温度25℃，转速为120r/min。具体实验结果见下表1.1。

表1.1微量元素组对小金色链霉菌发酵178h后的春雷霉素变化情况

从表1.1可知，实验组随微量元素添加量开始上升，然后至微量元素添加量为0.006%时下降，实验组与对照组t检验分析可知差异极显著（其中p<0.01）。

实施例2

春雷霉素发酵培养基各物质的质量百分比：黄豆粕粉8.0%、NaCl 0.5%、玉米浆干粉0.8%、麦芽糖2.5%、鱼油3.5%、KH₂PO₄0.03%、肌醇0.03%、生长因子的质量百分比为0.01%、0.013%、0.015%、0.017%、0.019%、0.021%，双蒸水补至100%，按上述比例配置培养基，该培养基灭菌消毒后，接种小金色链霉菌至体积300m L摇瓶里，每摇瓶接种量150m L，生长因子组每组设置三个平行样，另设未添加生长因子组（对照组）、生长因子为实验组。所有的摇瓶样品在生物摇床里进行178h连续培养后进行春雷霉素测定，其培养温度25℃，转速为120r/min。具体实验结果见下表2.1。

表2.1生长因子对小金色链霉菌发酵178h后的春雷霉素影响情况

从表2.1可知，实验组随生长因子添加量开始上升，然后至生长因子添加量为0.017%时下降，实验组与对照组t检验分析可知差异极显著（其中p<0.01）。

实施例3

春雷霉素发酵培养基各物质的质量百分比：黄豆粕粉8.0%、NaCl 0.5%、玉米浆干粉0.8%、麦芽糖2.5%、鱼油3.5%、KH₂PO₄0.03%、肌醇0.03%、微量元素0.006%、生长因子0.017%，双蒸水补至100%。该培养基灭菌消毒后，接种小金色链霉菌至体积300m L摇瓶里，每摇瓶接种量150m L，实验组=普通培养基+生长因子+微量元素，对照组1=普通培养基+生长因子,对照组2=普通培养基+微量元素，对照组3=普通培养基组。每组设立三个平行样，所有的摇瓶样品在生物摇床里178h连续培养后进行春雷霉素测定，其培养温度25℃，转速为120r/min。具体结果如下表3.1所示。

3.1小金色链霉菌发酵178h后的春雷霉素在各组的变化情况

从表3.1可知，普通培养基添加生长因子0.017%和微量元素0.006%时，与对照1组比较差异不显著（p>0.05）,说明微量元素对春雷霉素的生物效价并没有明显提高；与对照2组或对照3组差异极显著（p<0.01），说明生长因子是主要影响小金色链霉菌产春雷霉素的主要影响影响因素；对照1组与对照2组或对照3组差异极显著（p<0.01），说明生长因子能显著提高小金色链霉菌产春雷霉素的生物效价，对照2组与对照3组差异不显著（p>0.05），说明微量元素尽管提高小金色链霉菌产春雷霉素的生物效价，但提高不明显。至178小时后实验组与对照1组或对照2组比较，春雷霉素生物效价差异显著（p<0.01），说明微量元素和生长因子对小金色链霉菌的生物效价起协同作用。

实施例4

春雷霉素发酵培养基各物质的质量百分比：黄豆粕粉8.0%、NaCl 0.5%、玉米浆干粉0.8%、麦芽糖2.5%、鱼油3.5%、KH₂PO₄0.03%、肌醇0.03%、微量元素0.006%、生长因子0.017%，双蒸水补至100%。该培养基灭菌消毒后，接种小金色链霉菌至体积30吨发酵管，其接种量为体积比15%，对照组为普通培养基组进行178h连续培养后进行春雷霉素测定,其培养温度25℃，转速为120r/min。除菌空气通量为600L/h, 整个过程中通过添加氨水保持发酵液pH为6.8，补糖(2mol/L)为30L/h。每组设立三个平行样，小金色链霉菌产春雷霉素的生物效价的具体结果如下表4.1所示。

4.1小金色链霉菌在30吨发酵罐发酵178h后各组的春雷霉素效价变化情况

从表4.1可知，96小时前实验组与对照组差异不显著（p>0.05）,96小时候后实验组与对照组差异极显著（p<0.01），最终178h，实验组春雷霉素效价为13750（µg/L），对照组春雷霉素效价为11500（µg/L），实验组单罐产量为340kg，对照组的单罐产量为316kg。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种提高春雷霉素生物效价的方法，其特征在于，春雷霉素发酵培养基各物质的质量百分比：黄豆粕粉5.0～8.0%；NaCl：0.3～0.5%；玉米浆干粉：0.5～1.0%；麦芽糖：2.0～2.5%；鱼油：3.5～4.0%；KH₂PO₄：0.03～0.05%；肌醇：0.01%～0.05%；生长因子0.010-0.020%、微量元素0.02-0.012%，pH值为6.8～7.2；按上述比例配置培养基，该培养基灭菌消毒后，接种小金色链霉菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，黄豆粕粉8.0%、NaCl 0.5%、玉米浆干粉0.8%、麦芽糖2.5%、鱼油3.5%、KH₂PO₄0.03%、肌醇0.03%、生长因子0.010-0.020%、微量元素0.02-0.012%，双蒸水补至100%，pH值为7.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生长因子的含量为0.017%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微量元素的含量为0.006%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小金色链霉菌的接种量以体积比计为10-15%。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生长因子组成：维生素B₁，0.001mg；尼克酸，0.1mg；对氨基苯甲酸，0.1mg；生物素，0.001mg。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微量元素的组成：FeCl₃·6H₂O：5mg；CuSO₄·6H₂O：0.05mg；H₃BO₄：1mg；MnCl₂·4H₂O：0.05mg；ZnSO₄·7H₂O：1mg；Co(NO₃)·6H₂O：0.5mg。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，春雷霉素培养基除生长因子和微量元素外，其余物质进行高压灭菌消毒，生长因子与微量元素采用灭菌蒸馏水配置后进行微孔滤膜过滤消毒。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的微孔滤膜的孔径为0.22µm。