CN103911407A - 一种海洋真菌来源的Azaphilone类二聚体化合物的制备方法及应用 - Google Patents
一种海洋真菌来源的Azaphilone类二聚体化合物的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于药物化合物技术领域，具体涉及一种海洋真菌来源的Azaphilone类二聚体化合物的制备方法及应用。所述Azaphilone类二聚体化合物的结构如式（I）所示，该化合物具有抑制癌细胞增殖的作用，可用于制备抗癌药物。本发明所述Azaphilone类二聚体化合物是从一种海洋真菌菌核青霉Penicilliumsclerotiorum.SJ0167中分离得到，海洋微生物种类繁多，数量庞大，从微生物提取的方法简单，步骤简便，使得Azaphilone类化合物来源丰富，成本低廉；对癌细胞抑制活性高，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于药物化合物技术领域，具体涉及一种海洋真菌来源的Azaphilone类二聚体化合物的制备方法及应用。
背景技术
Azaphilone类二聚体化合物结构式如式（Ⅰ）所示。
现有技术中Azaphilone类二聚体化合物一般采用有机合成的方法制备，但有机合成方法复杂、合成成本比较高，限制了人们对Azaphilone类二聚体化合物的深入研究和应用开发。因此，对于Azaphilone类二聚体化合物的功能方面的研究都未见报道。
红树林是热带、亚热带海湾、河口泥滩上特有的常绿灌木和小乔木群落，具有呼吸根或支柱根，一般分布于高潮线与低潮线之间的潮间带。在中国，红树林主要分布在海南岛、广西、广东和福建。作为海洋真菌中的第二大类群，红树林真菌由于生长条件独特，活性代谢产物非常丰富，在海洋资源开发方面有着重要的意义。目前科学家已从其里面的各种内生真菌代谢产物中分离出很多结构新颖、有显著活性的化合物，许多已进入临床试验阶段。
癌症是严重威胁人类生命的常见病和多发病。研发高效、低毒、特异性强的新型抗癌药物是当今抗肿瘤药物研究的重要方向。海洋天然产物作为药物先导化合物的重要来源之一，对新型药物的研发有着重要的作用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中Azaphilone类二聚体化合物的制备方法复杂、合成成本比较高的技术缺陷，提供一种Azaphilone类二聚体化合物的新的制备方法。具体为从一种南海红树林内生真菌菌核青霉Penicillium sclerotiorum.SJ 0167的发酵产物中分离得到该化合物。而且，发明人通过深入研究发现：该化合物对乳腺癌细胞（MDA-MB-435）、肝癌细胞(HepG2)、结肠癌细胞（HCT-116）和肺腺癌细胞（A549）均表现出较好的抗癌活性，可应用于制备抗癌药物。
本发明的另一个目的是提供上述Azaphilone类二聚体化合物的应用。
本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：
一种Azaphilone类二聚体化合物的制备方法，包括如下步骤：
S1. 真菌Penicillium sclerotiorum.SJ 0167菌株接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；
S2. 将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养得发酵物；
S3. 将发酵物用甲醇浸泡提取，甲醇提取液浓缩后经乙酸乙酯萃取、浓缩，得到浸膏，再经层析分离，得到目标化合物；
所述Azaphilone类二聚体化合物的结构式如式（I）所示：
。
本发明所用的真菌菌核青霉Penicillium sclerotiorum.SJ 0167是从南海红树林内分离出的一种内生真菌，分类命名为菌核青霉Penicillium sclerotiorum，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏日期是2013年12月23日，保藏号是CGMCC NO: 8628；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
步骤S1所述种子培养基采用本领域常规的GYT培养基即可，室温培养5~7天；常规GYT培养基的组成按重量比为：葡萄糖18~23g，蛋白胨4~5g，酵母膏1~2g，海盐55~65g，水1.5~2L。步骤S1所述摇床培养是室温下，摇床转速100~150rpm，培养时间为5~7天。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤S2所述发酵培养基为固体大米培养基，其组分为：大米50~70g，海盐1.5~2g，水50~70mL。步骤S2所述静置培养的时间为1~2个月，静置培养的温度为室温。
作为一种优选方案，上述制备方法中，步骤S3所述甲醇的用量为与发酵物等体积，乙酸乙酯的用量为甲醇用量的1/3；所述浸膏用硅胶柱进行层析分离，硅胶柱进行层析分离时分别用10：0、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9及0：10的石油醚-乙酸乙酯梯度淋洗。将2：8、1：9及0：10的石油醚-乙酸乙酯洗脱部分合并，经过反相柱用体积比为7：3的甲醇-水为洗脱剂洗脱，再经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，用体积比为2：1：1的石油醚-二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行纯化，洗脱液经多次重结晶即得式（I）化合物。
所述硅胶柱为本领域常规的硅胶柱即可，目数约为200~300目。
本发明分离得到的Azaphilone类二聚体化合物具有抑制癌细胞增殖的作用，因此可用于制备抗癌药物。
所述抗癌包括抗乳腺癌、抗肝癌、抗结肠癌或抗肺腺癌。
本发明具有如下有益效果：
现有技术中Azaphilone类二聚体化合物都是通过有机合成得到的，其合成方法复杂、合成成本比较高，从而限制了人们对Azaphilone类二聚体化合物的深入研究和应用开发。而本发明提供了一种Azaphilone类二聚体化合物的新的获得方法，具体为从南海红树林内生真菌菌核青霉Penicillium sclerotiorum.SJ 0167的发酵产物中分离纯化。本发明所述方法简单，操作简便，使得Azaphilone类二聚体化合物来源丰富，成本低廉。
通过本发明所述方法简便获得Azaphilone类二聚体化合物后，发明人对Azaphilone类二聚体化合物的功能进行了深入的研究，发现该Azaphilone类二聚体化合物具有抑制癌细胞增殖的作用，可用于制备抗癌药物，应用前景广阔。
附图说明
图1 为本发明Azaphilone类二聚体化合物的核磁共振氢谱。
图2 为本发明Azaphilone类二聚体化合物的核磁共振碳谱。
图3 为本发明Azaphilone类二聚体化合物的核磁共振H,H-cosy二维谱。
图4 为本发明Azaphilone类二聚体化合物的核磁共振HSQC二维谱。
图5为本发明Azaphilone类二聚体化合物的核磁共振HMBC二维谱。
具体实施方式
下面结合具体说明书附图和实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
实施例1 化合物的提取与表征
本发明的化合物，可以从南海红树林内生真菌菌核青霉Penicillium sclerotiorum.SJ 0167中分离得到，海洋真菌菌核青霉Penicillium sclerotiorum.SJ 0167是从深圳海桑中分离得到。
该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏日期是2013年12月23日，保藏号是CGMCC NO: 8628，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
化合物的具体制备步骤如下：
S1. 种子培养液的获得：
S11. 配制种子培养基：葡萄糖20g，蛋白胨4g，酵母膏2g，海盐60g，自来水2000mL，平均分装于8个500mL锥形瓶，121℃灭25分钟。
S12. 种子的培养 ：将海洋真菌Penicillium sclerotiorum.SJ 0167的菌株接入种子培养基，在28℃的温度下，置摇床上以120rpm的转速，培养72小时得种子培养液。
S2. 发酵培养：1000 mL三角瓶内装60 g大米，60 mL海盐水，经121 ℃(0.1 MPa) 高温灭菌25 min后在超净工作台无菌操作下将5mL步骤S1得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，共接种90瓶，于室温静置培养30 天得发酵物。
S3. Azaphilone类二聚体化合物的提取分离：将步骤S2培养好的发酵物以每瓶150mL甲醇提取三次，得到甲醇提取物；甲醇提取物经过浓缩得到浓缩物，浓缩物用乙酸乙酯进行萃取3次，每次用量为50mL每瓶，浓缩得粗提物浸膏67 g。该粗提物浸膏用200~300目的硅胶柱进行层析分离，具体为分别用10：0、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9及0：10的石油醚-乙酸乙酯梯度淋洗。将2：8、1：9及0：10的石油醚-乙酸乙酯洗脱部分合并，经过反相柱用体积比为7：3的甲醇-水为洗脱剂洗脱，再经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，用体积比为2：1：1的石油醚-二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进行纯化，洗脱液经多次重结晶即得式（I）Azaphilone类化合物（80 mg）。
分离提取的化合物为红色固体，对其进行核磁共振分析检测的谱图如图 1~5所示。
化合物结构分析测试的理化性质数据如下：
EI-MS m/z: 833 [M+H]+，分子式为C46H54N2O8Cl2。 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7.89 (s, 1H), 7.00 (s, 1H), 6.95 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 6.10 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 5.73 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 3.87 (td, J = 14.4, 8.5 Hz, 2H), 2.50 (m, 1H), 2.18 (s, 3H), 1.82 (s, 3H), 1.80 (m, 2H), 1.56 (s, 3H), 1.43 (m, 2H), 1.04 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.92 (t, J = 7.4 Hz, 3H)；13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 194.28 (C), 184.43 (C), 170.38 (C), 148.78 (CH), 147.93 (C), 145.94 (CH), 144.16 (C), 141.11 (CH), 131.81 (C), 115.00 (C), 114.14 (CH), 112.12 (CH), 103.02 (C), 85.38 (C), 53.35 (CH2), 35.28 (CH), 30.24 (CH2), 27.31 (CH2), 23.55 (CH3), 20.55 (CH3), 20.36 (CH3), 12.83 (CH3), 12.19 (CH3)。
从核磁共振的结构分析检测结果可确定化合物的分子式为C19H22O5，结构式如式（I）所示：
。
实施例2 化合物的抗癌活性测试
化合物的抗癌活性测试采用的是MTT法（T. Mosmann. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of immunological methods. Journal of Immunological Methods 1983, 65, 55-63.）。
（一）材料
四脞盐（MTT）： 用0.01mol/L 的磷酸盐缓冲液（PBS） 溶解MTT〔3- 4,5-dimethythiazol-z-yl）2,5-diphenytetrazolium bromide,SIGMA〕，最终浓度5mg/ml，过滤除菌，分装后4℃避光保存。
MTT裂解液的配制：80g的十二烷基磺酸钠溶解在200ml的N-N－二甲基甲酰胺中，水浴加热助溶，加入200ml蒸馏水，用80％乙酸与1N盐酸（1：1）混合调pH至4.7。
细胞株选用：MDA-MB-435，HepG2, HCT-116, Calu-3肿瘤细胞株。于37 ℃下5%的CO2含量的空气中保藏。
（二）操作步骤
将处于对数生长期的以上四种肿瘤细胞分别接种于96孔板，用Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 完全培养基将细胞稀释至1×104个/ml，每孔加入200μL稀释好的细胞，每组五个平行样，另设空白孔和对照孔，所述空白孔为未接种细胞的孔，所述对照孔为不含药物的培养液。在5%CO2中，37 ℃室温和饱和湿度下培养24小时。去除培养基，加入不同浓度的抗癌药物溶液（所述不同浓度的抗癌药物溶液的配制方法为先用少量DMSO溶解药物制得药物母液，再用DMEM完全培养基将药物母液稀释至药物终浓度为0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 μM的本发明所述Azaphilone类二聚体化合物的溶液，稀释后的药物溶液中，DMSO 的体积百分比不高于总体积的0.1 %），每孔200μL，培养48小时，每孔加入2mg/ml的MTT（Sigma） 20μL，孵育4小时。尽量完全的吸出孔内培养液，加入DMSO液（150μL/孔），振荡10分钟，使结晶物充分溶解。用酶标仪于570nm波长下测定各孔OD值；以吸光度值对药物浓度对数作图，求出IC50值，结果用平均值±标准偏差表示。
本发明所述化合物进行4种癌细胞活性测试中，均表现出对癌细胞的抑制作用，测试结果如下表1所示。
表1
| 癌细胞株 | 乳腺癌MDA-MB-435 | 肝癌HepG2 | 结肠癌HCT-116 | 肺腺癌Calu-3 |
| 化合物IC50 (μM) | 7.126±0.098 | 39.641±0.918 | 27.802±0.583 | >50 |
Claims (9)
1.一种Azaphilone类二聚体化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1. 将海洋真菌菌核青霉Penicillium sclerotiorum.SJ 0167菌株接入种子培养基，摇床培养，得到种子培养液；
S2. 将种子培养液接入发酵培养基中，静置培养得发酵物；
S3. 将得发酵物用甲醇浸泡提取，甲醇提取液浓缩后经乙酸乙酯萃取、浓缩，得到浸膏，浸膏再经层析分离，得到目标化合物；
所述Azaphilone类二聚体化合物的结构式如式（I）所示：
；
所述菌核青霉Penicillium sclerotiorum.SJ 0167菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏日期是2013年12月23日，保藏号是CGMCC NO: 8628。
2.根据权利要求1所述Azaphilone类二聚体化合物的制备方法，其特征在于，步骤S1所述种子培养基的组分为：葡萄糖18~23g，蛋白胨4~5g，酵母膏1~2g，海盐55~65g，水1.5~2L。
3.根据权利要求1所述Azaphilone类二聚体化合物的制备方法，其特征在于，步骤S1所述摇床培养是室温下，摇床转速100~150rpm，培养时间为5~7天。
4.根据权利要求1所述Azaphilone类二聚体化合物的制备方法，其特征在于，步骤S2所述发酵培养基的组分为：大米50~70g，海盐1.5~2g，水50~70mL。
5.根据权利要求1所述Azaphilone类二聚体化合物的制备方法，其特征在于，步骤S2所述静置培养的时间为1~2月，静置培养的温度为室温。
6.根据权利要求1所述Azaphilone类二聚体化合物的制备方法，其特征在于，步骤S3所述甲醇的用量为与发酵物等体积；乙酸乙酯的用量为甲醇用量的1/3；所述浸膏用硅胶柱进行层析分离，硅胶柱进行层析分离时分别用10：0、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9和0：10的石油醚-乙酸乙酯梯度淋洗。
7.根据权利要求6所述Azaphilone类二聚体化合物的制备方法，其特征在于，将2：8、1：9及0：10的石油醚-乙酸乙酯洗脱部分合并，经过反相柱用体积比为7：3的甲醇-水为洗脱剂洗脱，再经过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20层析，用体积比为2：1：1的石油醚-二氯甲烷-甲醇为洗脱剂进一步纯化，最后重结晶即得式（I）化合物。
8.权利要求1所述Azaphilone类二聚体化合物的制备方法所获得的Azaphilone类二聚体化合物在制备抗癌药物中的应用。
9. 根据权利要求8所述Azaphilone类二聚体化合物在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述抗癌包括抗乳腺癌、抗肝癌、抗结肠癌或抗肺腺癌。
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Granted publication date: 20160706 Termination date: 20210228 |