CN102477043B - α-吡喃酮类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种α-吡喃酮类化合物，结构式为
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种α-吡喃酮类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤仍是当今世界危及人类生命的一种最常见、最严重的疾病。WHO预计，到2020年，世界年新增肿瘤患者将达到2000万人。癌症已成为人类的一大杀手！然而，以手术、放疗、化疗为主的传统治疗模式虽有一定疗效，却存在许多不足，未能取得整体满意的效果。因此，人们把目光转向了天然产物，希望从中找到高效低毒的抗肿瘤药物。抗肿瘤药物的探索一直是新药研究开发的热点之一。从微生物中寻找，开发新药，是药物研究的重要领域之一。对于寻找具有抗肿瘤活性的化合物的研究而言，研究的微生物主要包括放线菌和真菌。
近年来的研究发现，植物内生真菌产生的抗肿瘤活性成分是十分丰富。利用微生物代谢产物，特别是植物病原真菌来开发抗肿瘤药物，具有毒副作用小，具有靶标针对性强、开发成功率高等特性，并显示出良好的开发应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种α-吡喃酮类化合物。
本发明的第二个目的在于提供该α-吡喃酮类化合物的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供该α-吡喃酮类化合物的应用。
本发明提供的α-吡喃酮类化合物1，化学名为(2S，3R)-3-羟基-2，5-二甲基-3，4-二氢吡喃-7-酮，具有如下结构：
本发明提供的α-吡喃酮类化合物2，化学名为(2R，3S)-3-羟基-2，5-二甲基-3，4-二氢吡喃-7-酮，具有如下结构：
其中，(2S，3R)-3-羟基-2，5-二甲基-3，4-二氢吡喃-7-酮和(2R，3S)-3-羟基-2，5-二甲基-3，4-二氢吡喃-7-酮为同分异构体。
本发明提供的α-吡喃酮类化合物的制备方法，是由刺盘孢属(Colletotrichumsp.)菌株CGMCC No.4180发酵制备所述α-吡喃酮类化合物，所述发酵采用固体培养基或液体培养基进行发酵。
其中，所述采用固体培养基进行发酵的温度为27-30℃，时间为28-35天。
所述采用液体培养基进行发酵的温度为27-30℃，震荡转速为200～250rpm，发酵时间为5-9天。
进一步的，还包括以下进行分离提取的步骤：
(a)、采用有机溶剂提取发酵产物，减压蒸馏得到提取物；
(b)、将所述提取物采用减压硅胶柱层析分离后减压蒸馏；
(c)、将减压蒸馏得到的产物采用Sephadex LH20柱分离；
(d)、将所述Sephadex LH20柱分离得到的馏分浓缩后，采用半制备液相色谱制得所述α-吡喃酮类化合物。
根据本发明，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
根据本发明，所述减压硅胶柱层析分离采用石油醚/乙酸乙酯混合物进行洗脱，所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为3∶5。
根据本发明，所述Sephadex LH20柱分离采用二氯甲烷/甲醇混合物进行洗脱，二氯甲烷与甲醇的体积比为3∶1。
本发明的α-吡喃酮类化合物用于制备抑制肿瘤的药物。优选的，用于制备抑制肺癌、乳腺癌或胰腺癌的药物。
本发明提供了微生物来源的两种α-吡喃酮类同分异构化合物，为研究开发高效低毒的抗肿瘤药物提供了一个新的先导化合物，在人类健康领域具有潜在应用价值。
附图说明
图1为化合物1的高分辨质谱谱图。
图2为化合物1的氢谱谱图。
图3为化合物1的碳谱谱图。
图4为化合物1的HSQC谱谱图。
图5为化合物1的H-H COSY谱谱图。
图6为化合物1的HMBC谱谱图。
图7为化合物1的NOESY谱谱图。
图8为化合物2的高分辨质谱谱图。
图9为化合物2的氢谱谱图。
图10为化合物2的碳谱谱图。
图11为化合物2的HSQC谱谱图。
图12为化合物2的H-H COSY谱谱图。
图13为化合物2的HMBC谱谱图。
图14为化合物2的NOESY谱谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明所用的菌种是从丁香蓼植物的叶中分离得到的一株植物内生菌，该菌株在28℃、PDA的平板上培养2天后，气生菌丝和基内菌丝均为白色。6天后气生菌丝和基内菌丝致密且变为灰色，并产生孢子。孢子颜色为灰色，分生孢子梗从菌丝层或子座生出，不分枝也不分隔，密集成栅栏状，分生孢子常埋于胶质中，群集时使孢子成橙色等。分生孢子盘有刚毛，刚毛生于分生孢子盘的周围，分生孢子椭圆形或新月形，直或微弯。将该菌株的18S rDNA与GeneBank数据库中的序列进行Blast比对分析，结果显示与其相似性最高的序列主要分布在刺盘孢属(Colletotrichum sp.)。再结合文献报道进行分析，确定该菌株属刺盘孢属(Colletotrichum sp.)，这一论断与根据形态学鉴定的结果一致。已于2010年9月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.4180。
以下实施例中所述斜面培养基、所述种子培养基、所述大米培养基的配方(重量百分比)如下：
斜面培养基：PDA培养基。
种子培养基：葡萄糖(1.0％)、黄豆粉(2.0％)、玉米粉(1.0％)、KH2PO4(0.1％)，其余为水。
液体发酵培养基：葡萄糖(0.5％)、可溶性淀粉(3％)、豆粨粉(3％)、玉米粉(0.5％)、酵母提取物(0.5％)、CaCO3(0.3％)，其余为水。
大米固体发酵培养基：大米800g、纯水1000ml。
实施例1、固体发酵制备两种吡喃酮类同分异构化合物
将菌株CGMCC No.4180从冻干管中接种到斜面培养基上进行活化培养，于28℃恒温培养箱内培养5天后，将长满菌丝的斜面挖块接种到装有经121℃高压灭菌30min的种子培养基的四个250ml三角瓶中进行种子培养，其中，每个三角瓶内装有50ml种子培养基，于28℃、转速为220rpm摇床上恒温培养2天后，将四个三角瓶内的种子培养液混匀后接种到经115℃高压灭菌20min的含有800g大米、1000ml纯水的容器内，于28℃静态培养30天。
发酵结束后，将容器内的大米和菌体机械粉碎，用乙酸乙酯浸泡提取3次，在减压条件下将溶剂蒸干得到褐色油状提取物。将提取物用300目硅胶拌样后，装于含有300目硅胶的减压柱(Φ7.0*40cm)中，其中样品高2cm，分离硅胶高5cm；用1200ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为1∶1)洗涤，然后用400ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为3∶5)洗脱，得样品馏分。
将样品馏分减压蒸干后，用2ml二氯甲烷∶甲醇＝3∶1溶解，上样于用二氯甲烷∶甲醇＝3∶1平衡好的凝胶sephadex LH20柱(Φ2.0*60cm)中，用二氯甲烷∶甲醇＝3∶1洗脱，分步收集，每3ml收一管，其中5～15管为目标馏分。
将馏分浓缩干后，用半制备液相色谱分离得到淡黄色油状物，条件为：采用Agilent 1100色谱系统，半制备柱为Agilent ZORBAX ODS 5μm，9.4mm*250mm，条件为0～40min用甲醇∶水＝18∶82(体积比)等度洗脱，α-吡喃酮类化合物1的保留时间为33.8min，化合物2的保留时间为36.0min。
实施例2、液体培养基发酵制备两种吡喃酮类同分异构化合物
将菌株CGMCC No.4180从冻干管中接种到斜面培养基上进行活化培养，于28℃恒温培养箱内培养5天后，将长满菌丝的斜面挖块接种到装有经121℃高压灭菌30min的种子摇瓶中，于28℃、转速为220rpm的摇床上培养2天，以5％的接种量接种于液体发酵培养基中(装量为100ml/500ml摇瓶，发酵液总量为1000ml)，于28℃、转速为220rpm的摇床上振荡培养7天。
发酵结束后，发酵液用乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯相，在减压条件下将溶剂蒸干得到褐色油状提取物。将提取物用300目硅胶拌样后，装于含有300目硅胶的减压柱(Φ7.0*40cm)中，其中样品高2cm，分离硅胶高5cm；用1200ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为1∶1)洗涤，然后用400ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为3∶5)洗脱，得样品馏分。
将样品馏分减压蒸干后，用2ml二氯甲烷∶甲醇＝3∶1溶解，上样于用二氯甲烷∶甲醇＝3∶1平衡好的凝胶sephadex LH20柱(Φ2.0*60cm)中，用二氯甲烷∶甲醇＝3∶1洗脱，分步收集，每3ml收一管，其中5～15管为目标馏分。
将馏分浓缩干后，用半制备液相色谱分离得到淡黄色油状物，条件为：采用Agilent 1100色谱系统，半制备柱为Agilent ZORBAX ODS 5μm，9.4mm*250mm，条件为0～40min用甲醇∶水＝18∶82(体积比)等度洗脱，α-吡喃酮类化合物1的保留时间为33.8min，化合物2的保留时间为36.0min。
实施例3、化合物1的鉴定
经高分辨正离子电喷雾质谱检测，图谱如图1所示，显示化合物1准分子离子峰为：m/z 197.0812(M+H)+，分子式为C10H13O4，比旋光度(c2mg/mL，甲醇)，紫外吸收强度K 2524.5(c 0.02mg/mL)。采用Bruker AvanceII-400型超导核磁共振仪测定了样品的氢谱(图2)、碳谱(图3)及相关二维谱(HMQC谱(图4)、H-H COSY谱(图5)、HMBC谱(图6)、NOESY谱(图7))，其核磁数据见表1。
表1、化合物1核磁数据表(400MHZ，d-MeOH)
通过解析，确定了该化合物所有碳原子和氢原子的归属，得到了化合物1的结构如下：
可见该化合物为一种α-吡喃酮类化合物，化学名为(2S，3R)-3-羟基-2，5-二甲基-3，4-二氢吡喃-7-酮。
实施例4、化合物2的鉴定
经高分辨正离子电喷雾质谱检测，图谱如图8所示，显示化合物2准分子离子峰为：m/z 197.0808(M+H)+，分子式为C10H13O4。比旋光度mg/mL，甲醇)，紫外吸收强度K4563.2(c 0.033mg/mL)。采用Bruker Avance II-400型超导核磁共振仪测定了样品的氢谱(图9)、碳谱(图10)及相关二维谱(HMQC谱(图11)、H-H COSY谱(图12)、HMBC谱(图13)NOESY谱(图14))，其核磁数据见表2。
表2、化合物2核磁数据表(400MHZ，CD3OD)
通过解析，确定了该化合物所有碳原子和氢原子的归属，得到了化合物2的结构如下：
可见该化合物为一种α-吡喃酮类化合物，化学名为(2R，3S)-3-羟基-2，5-二甲基-3，4-二氢吡喃-7-酮
实施例5、化合物抗肿瘤活性测定
取对数生长期肿瘤细胞，用RPMI1640营养液(含有10％小牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)，配成5×104个/mL单细胞悬液，按每孔200μL接种于96孔板。于37℃，5％CO2孵箱培养。
培养24h后，小心吸去培养液，加入不同浓度的样品溶液200μL，同时设空白对组调零(无接种细胞，只加入培养液)、阴性对照组(接种细胞，不加药物处理，只加入培养液)，每组设8个平行。于37℃，5％CO2孵箱中培养。
培养72h后，每孔加入20μL，5μg/mL的MTT溶液(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，PBS(pH＝7.4)溶解，浓度为5mg/mL)，继续在孵箱中培养。培养4h后，加入4％异丙醇-0.01mol/L HCl 100μL给活细胞染色并保持过夜。
次日用MK-2全自动酶标仪在波长570nm下测定OD值。重复测量3次按下式计算细胞抑制率：细胞抑制率(％)＝(1-试验组吸收值A/对照组光吸收值A)×100％。
对肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和胰腺癌细胞(PANC-1)抑制活性的测定结果见表3、表4。
表3、化合物1抗肿瘤活性
表4、化合物2抗肿瘤活性
由表3、4所示的结果可知，该吡喃酮类化合物1和吡喃酮类化合物2对肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和胰腺癌细胞(PANC-1)具有抑制作用，尤其是对肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MDA-MB-231)有较强的抑制活性，可作为抗肺癌、抗乳腺癌、抗胰腺癌的一个前体化合物，用于制备抑制肿瘤的药物。
Claims (7)
1.一种α-吡喃酮类化合物，具有如下结构：
2.如权利要求1所述的α-吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于，由刺盘孢属菌株CGMCC No.4180发酵制备所述α-吡喃酮类化合物，所述发酵采用固体培养基或液体培养基进行发酵，所述采用固体培养基进行发酵的温度为27-30℃，时间为28-35天，所述采用液体培养基进行发酵的温度为27-30℃，震荡转速为200～250rpm，发酵时间为5-9天，还包括以下步骤：
(a)、采用有机溶剂提取发酵产物，减压蒸馏得到提取物；
(b)、将所述提取物采用减压硅胶柱层析分离后减压蒸馏；
(c)、将减压蒸馏得到的产物采用Sephadex LH20柱分离；
(d)、将所述Sephadex LH20柱分离得到的馏分浓缩后，采用半制备液相色谱制得所述α-吡喃酮类化合物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述减压硅胶柱层析分离采用石油醚/乙酸乙酯混合物进行洗脱，所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为3：5。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述Sephadex LH20柱分离采用二氯甲烷/甲醇混合物进行洗脱，二氯甲烷与甲醇的体积比为3：1。
6.如权利要求1所述的α-吡喃酮类化合物的应用，其特征在于，用于制备抑制肿瘤的药物。
7.如权利要求6所述的α-吡喃酮类化合物的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、乳腺癌或胰腺癌。
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