CN102477454B - 一种吡喃酮类化合物的制备方法 - Google Patents
一种吡喃酮类化合物的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102477454B CN102477454B CN201010565596.1A CN201010565596A CN102477454B CN 102477454 B CN102477454 B CN 102477454B CN 201010565596 A CN201010565596 A CN 201010565596A CN 102477454 B CN102477454 B CN 102477454B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- preparation
- pyrone compound
- alpha
- adopts
- fermentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明公开了一种α-吡喃酮类化合物的制备方法,该化合物为5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2H-吡喃酮-9-乙酯,结构为:
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体涉及一种α-吡喃酮类化合物5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-9-羟基-2H-吡喃酮-9-乙酯的制备方法。
背景技术
吡喃酮类化合物具有杀虫、抗菌、抗病毒等多种生理活性,是重要的药物合成的前体。α-吡喃酮类化合物5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-9-羟基-2H-吡喃酮-9-乙酯首次由Sakae Shimizu通过微生物发酵和化学合成两步方法得到(SakaeShimizu,Ikuo Sakurai,Yuzuru Yamamoto.Chem.Pharm.Bull 1983,31(10):3781-3784),合成工艺相对繁琐。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物来源的α-吡喃酮类化合物的制备方法。
本发明所述的α-吡喃酮类化合物,为5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-9-羟基-2H-吡喃酮-9-乙酯,具有如下结构:
本发明提供的该化合物的制备方法是经刺盘孢属菌株CGMCC No.4180发酵制备所述α-吡喃酮类化合物,所述发酵采用固体培养基或液体培养基进行发酵。
其中,所述采用固体培养基进行发酵的温度为27-30℃,时间为28-35天。
所述采用液体培养基进行发酵的温度为27-30℃,震荡转速为200~250rpm, 发酵时间为5-9天。
根据本发明,所述方法还包括将发酵产物进行分离提取的步骤,具体的,包括以下步骤:
(a)、采用有机溶剂提取发酵产物,减压蒸馏得到提取物;
(b)、将所述提取物采用减压硅胶柱层析分离后减压蒸馏;
(c)、将减压蒸馏得到的产物采用Sephadex LH20柱分离;
(d)、将所述Sephadex LH20柱分离得到的馏分浓缩后,采用半制备液相色谱制得所述α-吡喃酮类化合物。
根据本发明,所述有机溶剂为乙酸乙酯。
根据本发明,所述减压硅胶柱层析分离采用石油醚/乙酸乙酯混合物进行洗脱,所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为3∶2。
根据本发明,所述Sephadex LH20柱分离采用二氯甲烷/甲醇混合物进行洗脱,二氯甲烷与甲醇的体积比为3∶1。
本发明只通过微生物发酵一步就可制备获得该物质。相比微生物发酵与化学合成结合的制备方法,本发明只通过微生物发酵一步就可制备获得该目标化合物,在成本、环保、产能潜力等各方面都有显著的优势。
附图说明
图1为质谱谱图。
图2为氢谱谱图。
图3为碳谱谱图。
图4为HSQC谱谱图。
图5为H-H COSY谱谱图。
图6为HMBC谱谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明做进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
本发明所用的菌种是从丁香蓼植物的叶中分离得到的一株植物内生菌,该菌株在28℃、PDA的平板上培养2天后,气生菌丝和基内菌丝均为白色。6天后气生菌丝和基内菌丝致密且变为灰色,并产生孢子。孢子颜色为灰色,分生孢子梗从菌丝层或子座生出,不分枝也不分隔,密集成栅栏状,分生孢子常埋于胶质中,群集时使孢子成橙色等。分生孢子盘有刚毛,刚毛生于分生孢子盘的周围,分生孢子椭圆形或新月形,直或微弯。将该菌株的18S rDNA与GeneBank数据库中的序列进行Blast比对分析,结果显示与其相似性最高的序列主要分布在刺盘孢属(Colletotrichum sp.)。再结合文献报道进行分析,确定该菌株属刺盘孢属(Colletotrichum sp.),这一论断与根据形态学鉴定的结果一致。已于2010年9月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号CGMCC No.4180,建议的分类命名为Colletotrichum gloeosporioides。
以下实施例中所述斜面培养基、所述种子培养基、所述大米培养基的配方(重量百分比)如下:
斜面培养基:PDA培养基。
种子培养基:葡萄糖(1.0%)、黄豆粉(2.0%)、玉米粉(1.0%)、KH2PO4(0.1%),其余为水。
液体发酵培养基:葡萄糖(0.5%)、可溶性淀粉(3%)、豆粕粉(3%)、玉米粉(0.5%)、酵母提取物(0.5%)、CaCO3(0.3%),其余为水。
大米固体发酵培养基:大米800g、纯水1000ml。
实施例1、固体培养发酵制备化合物
将菌株CGMCC No.4180从冻干管中接种到斜面培养基上进行活化培养,于28℃恒温培养箱内培养5天后,将长满菌丝的斜面挖块接种到装有经121℃高压灭菌30min的种子培养基的四个250ml三角瓶中进行种子培养,其中,每个三角瓶内装有50ml种子培养基,于28℃、转速为220rpm摇床上恒温培养2天后,将四个三角瓶内的种子培养液混匀后接种到经115℃高压灭菌20min的含有800g大米、1000ml纯水的容器内,于28℃静态培养30天,进行固体培养发酵。
发酵结束后,将容器内的大米和菌体机械粉碎,用乙酸乙酯浸泡提取3次,在减压条件下将溶剂蒸干得到褐色油状提取物。将提取物用300目硅胶拌样后,装于含有300目硅胶的减压柱(Φ7.0*40cm)中,其中样品高2cm,分离硅胶高5cm;用1200ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为13∶7)洗涤,然后用400ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为3∶2)洗脱,得样品馏分。
将样品馏分减压蒸干后,用2ml二氯甲烷∶甲醇=3∶1溶解,上样于用二氯甲烷∶甲醇=3∶1平衡好的凝胶sephadex LH20柱(2.0*60cm)中,用二氯甲烷∶甲醇=3∶1洗脱,分步收集,每3ml收一管,其中6~19管为目标馏分。
将馏分浓缩干后,用半制备液相色谱分离得到淡黄色油状物,条件为:采用Agilent 1100色谱系统,半制备柱为Agilent ZORBAX ODS 5μm,9.4mm*250mm,条件为0~40min用35%甲醇(65%水)等度洗脱,该化合物的保留时间tR约为36.5min。
实施例2、液体培养基发酵制备化合物
将菌株CGMCC No.4180从冻干管中接种到斜面培养基上进行活化培养,于28℃恒温培养箱内培养5天后,将长满菌丝的斜面挖块接种到装有经121℃高压灭菌30min的种子摇瓶中,于28℃、转速为220rmp的摇床上培养2天,以5%的接种量接种于液体发酵培养基中(装量为100ml/500ml摇瓶,发酵液总量为1000ml),于28℃、转速为220rmp的摇床上振荡培养7天。
发酵结束后,发酵液用乙酸乙酯提取3次,合并乙酸乙酯相,在减压条件下将溶剂蒸干得到褐色油状提取物。将粗提物用300目硅胶拌样后,装于含有300目硅胶的减压柱(Φ7.0*40cm)中,其中样品高2cm,分离硅胶高5cm;用1200ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为13∶7)洗涤,然后用400ml石油醚∶乙酸乙酯(体积比为3∶2)洗脱,得样品馏分。
将样品馏分减压蒸干后,用2ml二氯甲烷∶甲醇=3∶1溶解,上样于用二氯甲烷∶甲醇=3∶1平衡好的凝胶sephadex LH20柱(2.0*60cm)中,用二氯甲烷∶甲醇=3∶1洗脱,分步收集,每3ml收一管,其中6~19管为目标馏分。
将馏分浓缩干后,用半制备液相色谱分离得到淡黄色油状物,条件为:采 用Agilent 1100色谱系统,半制备柱为Agilent ZORBAX ODS 5μm,9.4mm*250mm,条件为0~40min用35%甲醇(65%水)等度洗脱,该化合物的保留时间tR约为36.5min。
实施例3、α-吡喃酮类化合物的鉴定
经高分辨正离子电喷雾质谱检测,图谱如图1所示,显示其准分子离子峰为:m/z 227.0880(M+H)+,分子式为C11H15O5。采用Bruker Avance II-400型超导核磁共振仪测定了样品的氢谱(图2)、碳谱(图3)及相关二维谱(HMQC谱(图4)、H-H COSY谱(图5)、HMBC谱(图6)),其核磁数据见表1。
表1、核磁数据表(400MHZ,Actone-d6)
通过解析,确定了该化合物所有碳原子和氢原子的归属,得到了该化合物的结构如下,可知该化合物为一种α-吡喃酮类化合物,化学名为5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2H-吡喃酮-9-乙酯。
实施例4、5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2H-吡喃酮-9-乙酯抗肿瘤活性测定
取对数生长期肿瘤细胞,用RPMI1640营养液(含有10%小牛血清,100U/mL青霉素和100U/mL链霉素),配成5×104个/mL单细胞悬液,按每孔200μL接种于96孔板。于37℃,5%CO2孵箱培养。培养24h后,小心吸去培养液,加入不同浓度的样品溶液200μL,同时设空白对组调零(无接种细胞,只加入培养液)、阴性对照组(接种细胞,不加药物处理,只加入培养液),每组设8个平行。于37℃,5%CO2孵箱中培养。培养72h后,每孔加入20μL,5μg/mL的MTT溶液(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,PBS(pH=7.4)溶解,浓度为5mg/mL),继续在孵箱中培养。培养4h后,加入4%异丙醇-0.01mol/L HCl100μL活细胞染色并保持过夜。次日用MK-2全自动酶标仪在波长570nm下测定OD值。重复测量3次按下式计算细胞抑制率:细胞抑制率(%)=(1-试验组吸收值/对照组光吸收值A)×100%。
表2、5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2′-羟基-2H-吡喃酮-9-乙酯抗肿瘤活性
5-乙基-4-甲氧基-6-甲基-2′-羟基-2H-吡喃酮-9-乙酯抗肺癌细胞(A549)、乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和胰腺癌细胞(PANC-1)活性测定结果如表2所示。由表2所示的结果可知,该α-吡喃酮类化合物对肺癌细胞(A549)和乳腺癌细胞(MDA-MB-231)有较强的抑制活性,可作为抗肺癌和抗乳腺癌的一个前体化合物。
Claims (7)
1.一种α-吡喃酮类化合物的制备方法,所述α-吡喃酮类化合物具有如下结构:
其特征在于,是经刺盘孢属菌株CGMCC No.4180发酵制备所述α-吡喃酮类化合物,所述发酵采用固体培养基或液体培养基进行发酵。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述采用固体培养基进行发酵的温度为27-30℃,时间为28-35天。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述采用液体培养基进行发酵的温度为27-30℃,震荡转速为200~250rpm,发酵时间为5-9天。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,还包括以下步骤:
(a)、采用有机溶剂提取发酵产物,减压蒸馏得到提取物;
(b)、将所述提取物采用减压硅胶柱层析分离后减压蒸馏;
(c)、将减压蒸馏得到的产物采用Sephadex LH20柱分离;
(d)、将所述Sephadex LH20柱分离得到的馏分浓缩后,采用半制备液相色谱制得所述吡喃酮类化合物。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述有机溶剂为乙酸乙酯。
6.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述减压硅胶柱层析分离采用石油醚/乙酸乙酯混合物进行洗脱,所述石油醚与乙酸乙酯的体积比为3∶2。
7.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述Sephadex LH20柱分离采用二氯甲烷/甲醇混合物进行洗脱,二氯甲烷与甲醇的体积比为3∶1。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201010565596.1A CN102477454B (zh) | 2010-11-30 | 2010-11-30 | 一种吡喃酮类化合物的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201010565596.1A CN102477454B (zh) | 2010-11-30 | 2010-11-30 | 一种吡喃酮类化合物的制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102477454A CN102477454A (zh) | 2012-05-30 |
CN102477454B true CN102477454B (zh) | 2014-11-05 |
Family
ID=46090238
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201010565596.1A Active CN102477454B (zh) | 2010-11-30 | 2010-11-30 | 一种吡喃酮类化合物的制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102477454B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115677640A (zh) * | 2022-10-17 | 2023-02-03 | 浙江省海洋开发研究院 | 一种吡喃2酮类化合物及其制备方法和应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101191141A (zh) * | 2006-11-20 | 2008-06-04 | 上海医药工业研究院 | 用于生物合成7α,15α-二羟基雄烯醇酮的发酵培养基 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4017697B2 (ja) * | 1996-12-06 | 2007-12-05 | 大日本除蟲菊株式会社 | 新規抗菌活性物質及びこれを含有する植物病害防除剤 |
-
2010
- 2010-11-30 CN CN201010565596.1A patent/CN102477454B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101191141A (zh) * | 2006-11-20 | 2008-06-04 | 上海医药工业研究院 | 用于生物合成7α,15α-二羟基雄烯醇酮的发酵培养基 |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
C M Garcia-Pajon et al.Secondary metabolites isolated from colletotrichum species.《Natural Product Reports》.2003,第20卷(第4期),426-431. * |
JP特开平10-167910A 1998.06.23 * |
Secondary metabolites isolated from colletotrichum species;C M Garcia-Pajon et al;《Natural Product Reports》;20030831;第20卷(第4期);426-431 * |
一株银杏内生真菌的分离及其产黄酮类物质的初步研究;王梅霞等;《工业微生物》;20040630;第34卷(第2期);15-18 * |
王梅霞等.一株银杏内生真菌的分离及其产黄酮类物质的初步研究.《工业微生物》.2004,第34卷(第2期),15-18. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102477454A (zh) | 2012-05-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102311981B (zh) | 制备提纯灵菌红素的方法 | |
CN103910708A (zh) | 一种海洋真菌来源的Azaphilones化合物及其制备方法和应用 | |
CN103910746A (zh) | 一类海洋真菌来源的Berkeleyones化合物及其制备方法和应用 | |
CN102475701B (zh) | 一种吡喃酮类化合物的应用 | |
CN109106702A (zh) | 源于草酸青霉的4-4’异构化黑麦酮酸d在结肠癌方面的应用 | |
CN103910701A (zh) | 一种海洋真菌来源的萘醌类化合物及其制备方法和应用 | |
CN103911407A (zh) | 一种海洋真菌来源的Azaphilone类二聚体化合物的制备方法及应用 | |
CN102477454B (zh) | 一种吡喃酮类化合物的制备方法 | |
CN102477400B (zh) | 一种刺盘孢菌及其应用 | |
CN101293886B (zh) | 白木香内生真菌产物螺光黑壳菌酮a的制备方法及应用 | |
CN112300243B (zh) | 一种环肽化合物及其制备方法和应用 | |
CN100404537C (zh) | 喹唑啉生物碱类化合物及其制备方法和用途 | |
CN102477043B (zh) | α-吡喃酮类化合物及其制备方法和应用 | |
CN104059038A (zh) | 一种倍半萜类化合物及其应用 | |
CN103130757B (zh) | 一种抗肿瘤活性的新化合物及其制备方法和应用 | |
CN103641791A (zh) | 一种环肽化合物clavatustide B及其制备方法和应用 | |
CN114045221B (zh) | 葡萄穗霉菌株Stachybotrys sp.及其培养方法、次级代谢产物和用途 | |
CN106491596B (zh) | 源于桔绿木霉的青霉烯醇e1在肺癌方面的应用 | |
CN106432034B (zh) | 源于桔绿木霉的青霉烯醇e1在制备抗乳腺癌药物的应用 | |
CN116554187A (zh) | 一种新颖骨架类型细胞松弛素及其在制备具有抗肿瘤活性的药物中的应用 | |
CN106389418B (zh) | 源于桔绿木霉的青霉烯醇e1在肝癌方面的应用 | |
CN116715659A (zh) | 一种新颖骨架类型细胞松弛素及其在制备具有抗肿瘤活性的药物中的应用 | |
CN105061443B (zh) | 源于桔青霉的penicitrinine A及其制备抗人肝癌药物的应用 | |
CN116173013A (zh) | 一种源于桔青霉的青霉烯醇a2的抗长春新碱耐药新用途 | |
CN105061445B (zh) | 源于桔青霉的penicitrinine A及其制备抗人胃癌药物的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |