CN111334438A - 芳香丁烯酸内酯二聚体制备方法及其在制抗菌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种芳香丁烯酸内酯二聚体及其制备方法和在抗菌药物中的应用。本发明从一株曲霉属真菌Aspergillus terreus SCAU011 CGMCC No:19270的发酵物中分离得到具有抗菌活性的图1所示的丁烯酸内酯二聚体，能够抑制金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和灿烂弧菌（Vibrio splendidus）的生长（IC50分别为1.3μM和3.7μM），在抗菌药物方面具有良好的应用前景。

Description

芳香丁烯酸内酯二聚体制备方法及其在制抗菌药物中的应用
技术领域
本发明属于海洋天然药物领域，具体涉及一种芳香丁烯酸内酯二聚体及其在制备抗菌药物中的应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus) 是临床上的常见细菌，属于革兰氏阳性病原菌，可以引起人类和动物的多种疾病如肠胃炎、乳腺炎、伤口感染、菌血症、肺炎、心内膜炎、败血症等，严重的可以危及生命。S. aureus对生长环境要求较低，因此，在自然界中广泛存在，据报道，金葡菌长期宿主占人口的 20％-25％，主要存在于人的鼻腔与皮肤上。在上世纪 40 年代，青霉素在治疗金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病方面取得了良好的疗效，但是由于抗生素的大量使用，出现了S. aureus耐药性，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现，使得金葡菌感染的治疗变得复杂和困难，因此，开发具有金黄色葡萄球菌抑制活性的药物迫在眉睫。
近年来水产养殖业快速发展，水产养殖动物病害问题也日益突出。弧菌病是水产养殖动物出现的最为常见、危害较严重的一种疾病，感染的动物涉及鱼类、虾类、贝类及其它棘皮动物门生物如刺参等，对水产养殖业造成了巨大经济损失。灿烂弧菌（Vibrio splendidus）属于革兰氏阴性细菌，兼性厌氧，是主要的致病弧菌之一，能引起被感染的鱼体两侧特别是靠近尾部出现出血点，皮肤腐烂，严重的形成溃疡，背鳍、胸鳍、尾鳍的鳍条基部充血，肾脏、肝脏糜烂等症状，引起扇贝幼苗、大菱鲆、牡蛎、刺参等水产养殖动物的大量死亡。但是，目前并没有致病弧菌的专用抑制剂，因此，开发灿烂弧菌抑制剂，对于水产养殖业具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种曲霉属真菌及其发酵物中分离的具有抑制金黄色葡萄球菌（S. aureus）和灿烂弧菌（V. splendidus）生长的芳香丁烯酸内酯二聚体化合物及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种曲霉属真菌Aspergillus terreus SCAU011，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No. 19270，保藏日期：2019年12月27日。
一种曲霉属真菌Aspergillus terreus SCAU011及其发酵产物在生产抗菌药物中的应用。所述曲霉属真菌Aspergillus terreus SCAU011培养后可产生发酵产物，所述发酵产物中含有抑制S. aureus和V. splendidus生长的活性物质，其发酵液可用于生产具有抗菌活性的药物或添加剂。
一种曲霉属真菌Aspergillus terreus SCAU011产生的芳香丁烯酸内酯二聚体化合物，其结构式如图1所示。
一种上述芳香丁烯酸内酯二聚体化合物的制备方法，包括以下步骤：
（1）曲霉属真菌Aspergillus terreus SCAU011的发酵；
（2）从步骤（1）所得发酵物中经提取得到发酵提取物；
（3）步骤（2）中的提取物通过正相硅胶柱、快速中压层析柱、反相C18柱高效液相等方法进行分离。
本发明提供一种含有步骤（2）中提取物，或图 1所示化合物或其盐在制备抗菌药物、药物中间体的用途。
本发明提供一种含有含有步骤（2）中提取物，或图 1所示化合物或其盐的抗菌药物。所述抗菌药物还包括医学上可接受的辅料。所述抗菌药物还可以包括其他有效成分，以增强抑菌效果。
本发明具有以下优点：
本发明的芳香丁烯酸内酯二聚体可以通过Aspergillus terreus SCAU011的发酵提取分离获得，具有抑制S. aureus和V. splendidus生长的活性，在制备抗菌药物发面具有应用潜力。
附图说明
图1为芳香丁烯酸内酯二聚体化合物的结构式。
图2为菌种SCAU011平板培养图片。
图 3为图1所示化合物的氢谱（600 MHz）和碳谱（150 MHz）数据（CDCl3）。
图4为图 1所示化合物主要的1H-1H COSY 、HMBC信息。
图5为图 1所示化合物的ECD谱图。
图6为图 1所示化合物的Mosher试剂衍生物结构及其δH (Δδ = δS−δR)差值。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为商业购买。
本发明的菌种Aspergillus terreus SCAU011保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No. 19270，保藏日期：2019年12月27日。
实施例1 菌种的分离纯化与鉴定。
从湛江特呈岛红树林保护区沉积物中，经分离纯化获得菌种Aspergillus terreus SCAU011，其典型培养物图片如图2所示：菌落呈圆形，菌丝白色，孢子土黄色。经ITS rDNA检测，与Gene Bank数据进行比较，鉴定为Aspergillus terreus真菌。
实施例2 发酵物的制备。
种子培养基的配制方法：土豆浸出液200 mL，葡萄糖20 g，海盐 30 g，用水定容到1 L。将PDB培养基装入20个500 mL的三角烧瓶中，每瓶约150 mL，在121℃高压蒸汽灭菌25分钟，备用。
大米培养基配置方法：将市售大米80 g，酵母浸膏0.4 g，葡萄糖0.4 g，无菌水120mL，海盐3.6 g置于1 L三角瓶中，共60瓶。121℃高压蒸汽灭菌25分钟，备用。
用无菌竹签挑取适量的真菌Aspergillus terreus SCAU011菌种接种入种子培养基中，28℃摇床（180 rpm）培养3天得到种子液，然后用移液枪接种10 mL种子液到1 L的装有大米培养基的三角烧瓶中，于28℃静置培养30天后，收取发酵的培养基。
将发酵的大米培养基用95%乙醇浸泡，浸取液回收乙醇后剩余水相，再用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯提取物作为粗提物。
实施例3 芳香丁烯酸内酯二聚体的制备。
按照实施例2的方法获得4.0 kg发酵大米培养基，将大米培养基用95%乙醇浸泡、浸取液回收乙醇后剩余水相再用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯提取物60g。乙酸乙酯提取物用正相硅胶（100-200目）进行柱层析，以二氯甲烷-甲醇作为洗脱剂，从体积比100:0 到0:100进行梯度洗脱，根据薄层层析情况合并各个流份，回收洗脱溶剂，获得7个馏分（Fr.1-Fr.7）。
Fr.5进一步以二氯甲烷-丙酮作为洗脱剂进行正相硅胶（200-300目）柱层析，根据薄层层析情况合并各个流份，回收洗脱溶剂，获得6个馏分（Fr.5-1-Fr.5-6）。组分Fr.5-4以甲醇-水作为洗脱剂进行快速中压（反向C-18）层析分离，根据薄层层析情况合并各个流份，回收洗脱溶剂，获得9个馏分（Fr.5-4-1-Fr.5-4-9）。组分Fr.5-4-9采用高效液相半制备（色谱柱为YMC-Pack ODS-A 10 mm×250 mm，流速为3.0 mL/min，检测波长254 nm，流动相为体积比为76：24：0.05的甲醇-水-乙酸）在出峰时间为11.2 min时分离纯化得到图1所示化合物（6.3 mg）。
图1所示化合物是淡黄色胶状，易溶于氯仿、甲醇、DMSO，难溶于水，比旋光度值[α]29 D77.1（c 0.36，MeOH）。
对分离获得的化合物进行高分辨质谱（HR-ESIMS）、1H NMR、13C NMR、2D 1H-1HCOSY、HSQC、HMBC分析，确定了平面结构，并通过ECD和改良Mosher的方法确定了化合物的立体结构。1H和13C NMR数据见图3，主要的1H-1H COSY和HMBC相关信息见图4， ECD谱图见图5。分离得到的化合物的结构如图1所示。
实施例4 图 1所示化合物衍生物的制备。
称取1.0 mg图 1所示化合物溶于0.5 mL无水吡啶中，往溶液中加入Mosher试剂10μL (R)-2-甲氧基-2-三氟甲基苯乙酰氯和1.0 mg DMAP（作为催化剂），于室温反应9小时。将溶剂减压蒸干后，将粗品采用高效液相半制备得到化合物a（图6）；将Mosher试剂换为(S)-2-甲氧基-2-三氟甲基苯乙酰氯，相同的方法得到化合物b（图6）。
实施例5 图 1所示化合物的抗菌活性。
采用96孔板对图 1所示化合物进行了抗菌活性测试。分别将Staphylococcus aureus ATCC25923和Vibrio splendidus MCCC1A04069接种到LB培养基中37 °C摇床（180rpm）培养24小时，然后通过麦氏比浊法，用LB培养基将培养液的菌种浓度稀释到104-105 cfu/mL，接种于96孔板中，每孔包含200 μL（包含倍比稀释的待测样品）培养液，37 oC放置12小时，用酶标仪检测各孔在600nm处的吸光度A值，计算细菌生长抑制率。细菌生长抑制率=1 -（实验组OD -空白组OD）÷（对照组OD - 空白组OD）×100%。
实验结果显示，图 1所示的丁烯酸内酯二聚体化合物能抑制Staphylococcus aureus ATCC25923和Vibrio splendidus MCCC1A04069，它们的IC50值分别为1.3 μM和 3.7μM。

Claims (5)

1.一种曲霉属真菌Aspergillus terreus SCAU011，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No: 19270。
2.一种如权利要求1所述的曲霉属真菌产生的芳香丁烯酸内酯二聚体，其结构式如图1所示。
3.一种如权利要求1所述的曲霉属真菌Aspergillus terreus SCAU011在制备权利要求2所述的图1所示化合物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）曲霉属真菌Aspergillus terreus SCAU011的发酵；
（2）从步骤（1）所得发酵物中经提取得到发酵提取物；
（3）步骤（2）中的提取物通过正相硅胶柱、快速中压层析柱、反相C18柱高效液相等方法进行分离。
4.一种如上述步骤（2）所述的曲霉属真菌Aspergillus terreus SCAU011发酵产物，或如权利要求2所述的芳香丁烯酸内酯二聚体化合物或其盐在制备抗菌药物，或作为抗菌药物中间体中的用途。
5.一种抗菌药物，其特征在于，包含有效量的作为活性成分的上述步骤（2）所述的曲霉属真菌Aspergillus terreus SCAU011发酵产物，或如权利要求2所述的芳香丁内酯二聚体化合物或其盐，和在药学上可以接受的载体。
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