CN113173904B - 新的抑菌化合物以及用于制备该化合物的曲霉 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新的抑菌化合物以及用于制备该化合物的曲霉，该曲霉(Aspergillus sp.)菌株发酵分离制备式(I)所示的化合物，该化合物在制备抗菌药物方面的应用，该化合物对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有很好的抑制活性。

Description

新的抑菌化合物以及用于制备该化合物的曲霉

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的抑菌化合物以及用于制备该化合物的曲霉。

背景技术

目前，曲霉属真菌广泛存在于土壤、植物性食品和饲料原料中，其产生的代谢产物会对粮食类作物产生污染。但是，研究发现，在红曲霉中存在大量的红曲多糖，该多糖的理化性能很好。黑曲霉是真菌曲霉属中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食植物性产品和土壤中，其成分中就的生理活性日益受到关注，大量的研究证实，曲霉的多糖具有降低血糖、增强免疫功能、抑菌和抗病毒等作用。因而，对曲霉代谢物进行开发研究，是目前亟待解决的技术问题。

发明内容

为此，本发明提供一种新的抑菌化合物以及用于制备该化合物的曲霉。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明实施例提供式(I)所示的抑菌化合物

本发明的一个实施例中，所述抑菌化合物用于抑制金黄色葡萄球菌和耐药金黄色葡萄球菌。

本发明实施例还提供所述的抑菌化合物在制备抗金黄色葡萄球菌和耐药金黄色葡萄球菌药物中的应用。

本发明实施例的用于制备所述的抑菌化合物的曲霉(Aspergillus sp.)，其保藏编号为CGMCC NO.3.20170。

上述所述的曲霉在制备细菌抑制剂中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明的一个实施例中，所述细菌为金黄色葡萄球菌和耐药金黄色葡萄球菌。

本发明的一个实施例中，利用所述曲霉制备权利要求1所述的式(I)所示的抑菌化合物的方法包括以下步骤：将所述曲霉的发酵产物通过有机相多次萃取，将萃取液合并、干燥后，得到发酵粗提物；

将所述发酵粗提物经正向硅胶柱层析、凝胶Sephadex LH-20柱色谱、高效液相色谱分离纯化，得到所述式(I)所示的化合物，

本发明的一个实施例中，所述硅胶柱层析以不同体积比的正己烷/二氯甲烷(80:20，50:50，20:80)，二氯甲烷，以及二氯甲烷/甲醇(99:1，98:3，96:4，95:5，90:10)混合溶剂进行梯度洗脱，每次300mL。

本发明具有如下优点：

本发明试验证明：本发明提供的化合物具有较好的抑制金黄色葡萄球菌和耐药金黄色葡萄球菌的生长活性，适宜于制备天然的抗菌药物。

菌种保藏说明：本发明的曲霉菌(Aspergillus sp.)，于2020年10月21日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC NO.3.20170。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例提供的曲霉菌(Aspergillus sp.)系统发育树的图；

图2为本发明实施例提供的式(I)所示的化合物的高分辨质谱图；

图3为本发明实施例提供的式(I)所示的化合物的¹H核磁共振图谱；

图4为本发明实施例提供的式(I)所示的化合物的¹³C核磁共振图谱。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1曲霉菌(Aspergillus sp.)分离和鉴定

1、菌株IMCASMF180035的采集与分离

2018年10月从海南沿海海泥中分离到一株菌，命名为菌株IMCASMF180035。

2、菌株IMCASMF180035的鉴定

菌株IMCASMF180035的ITS基因序列如SEQ ID NO:1所示，与GENBANK ACCESSIONNO.MH614471.1的序列相似性最高，相似性为100％。系统发育树如图1所示。根据以上鉴定结果，菌株IMCASMF180035属于曲霉(Aspergillus sp.)。

实施例2、曲霉菌(Aspergillus sp.)的发酵培养

配制PDA培养基：将马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g和水1000mL混匀，115℃高压蒸汽灭菌30min。

配制大米培养基：将200g大米在200mL水中浸泡过夜，121℃高压蒸汽灭菌30min。

利用接种环把菌株IMCASMF180035接种到PDA平皿培养基上，28℃恒温培养7天后，将在PDA培养基活化的曲霉属真菌切取两块1cm²大小的菌块连同PDA培养基接种到大米固体培养基中，28℃恒温培养30d。

实施例3、曲霉菌(Aspergillus sp.)发酵产物的提取

1、发酵结束后，在大米固体发酵产物中加入有机试剂(乙酸乙酯:甲醇＝4:1)，超声波室温浸提20min，收集第一次上清液。

2、在步骤1中固体发酵产物中加入有机试剂(乙酸乙酯:甲醇＝4:1)，超声波室温浸提20min，收集第二次上清液。

3、在步骤2中固体发酵产物中加入有机试剂(乙酸乙酯:甲醇＝4:1)，超声波室温浸提20min，收集第三次上清液。

将第一次上清液、第二次上清液、第三次上清液合并，减压蒸馏至干燥，得到粗提物。

实施例4、抑菌化合物的分离纯化

1、减压正向硅胶柱层析

将实施例3制备的发酵粗提物用硅胶(100～200目，4.68g)拌样，进行减压正相硅胶柱层析分离(薄层层析硅胶H；硅胶柱尺寸L 100mm，

)，以不同体积比的正己烷/二氯甲烷(80:20，50:50，20:80)，二氯甲烷，以及二氯甲烷/甲醇(99:1，98:3，96:4，95:5，90:10)混合溶剂进行梯度洗脱，每次300mL，收集90:10的二氯甲烷/甲醇洗脱的馏分。

2、Sephadex LH-20凝胶色谱分离

将步骤1收集的馏分用2:1的二氯甲烷/甲醇溶剂溶解，进行Sephadex LH-20凝胶色谱分离(凝胶柱尺寸L 600mm，

)，以2:1的二氯甲烷/甲醇溶剂为流动相等度洗脱，TLC检测合并馏分。纯的化合物，薄层层析为一条带。

3、高效液相色谱分离纯化

凝胶色谱分离后的第8个馏分进行高效液相色谱分离，高效液相色谱条件：采用Agilent Zorbax XDB-C8反相色谱柱(250×9.4mm，5μm)，流速3.0mL/min，甲醇浓度65％等度洗脱30min，检测波长为254nm，收集洗脱液，将收集的HPLC洗脱液减压蒸馏至干燥，得到抑菌化合物。

实施例5、抑菌化合物的结构鉴定

运用质谱和核磁共振技术进行结构鉴定，核磁共振用Bruker AVANCE DRX-500NMR Sectrometer测定；高分辨质谱Agilent Accurate-Mass-Q-TOF LC/MS 6520instrument测定，检测的谱图，如图2至图4所示。

抑菌化合物的表征数据如下：抑菌化合物为淡黄色粉末；分子量为558，分子式为C₃₀H₂₂O₁₁；抑菌化合物的¹H NMR和¹³C NMR分析结果，如表1所示。

依据以上表征数据上述化合物的理化数据和图谱，鉴定了抑菌化合物的结构。

表1为式(I)所示的化合物的NMR数据(500MHz,DMSO-d₆)

试验实施例1化合物抗菌活性分析

配制MHB培养基：称取24克Mueller-Hinton Broth干粉，溶解于1000毫升蒸馏水，调pH至7.2，121℃灭菌20分钟。Mueller-Hinton Broth：北京奥博星生物技术有限责任公司。万古霉素：美国Sigma公司。

1、菌液的制备

通过血球计数板计数，用MHB培养基将细菌制备成(2-5)×10⁵个细胞/mL的菌液。分别采用金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

2、待测溶液的制备

以无菌DMSO为溶剂将化合物I配制为4mg/mL的母液，然后用无菌DMSO依次稀释得到浓度为2mg/mL、1mg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL的稀释液。

以无菌DMSO为溶剂将阳性对照药物万古霉素配制为320μg/mL的母液，然后用无菌DMSO依次稀释得到浓度为160μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和2.5μg/mL的稀释液。

3、测定化合物抑制细菌的最小抑菌浓度

(1)、取无菌96孔细胞培养板，每孔加入40μL MHB培养基。

(2)、取完成步骤1的96孔细胞培养板，分组处理如下：

阳性对照组(7个孔)：分别加入2μL步骤二制备的7个稀释度的阳性对照药物稀释液；

实验组(化合物7个孔)：分别加入2μL步骤二制备的化合物稀释液；

阴性对照组(7个孔)：分别加入2μL无菌DMSO。

(3)、取完成步骤2的96孔细胞培养板，每孔加入40μL步骤一得到的菌液，37℃培养16小时后观察各孔中细菌的生长状况，判断MIC值，以观察不到明显细菌生长的孔的浓度作为最小抑菌浓度。

试验结果：本发明的式(I)化合物的抑菌浓度为3.125μg/ml。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国地质大学（北京）

<120> 新的抑菌化合物以及用于制备该化合物的曲霉

<130> GG20875212A

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 568

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cgagtgactg cggaggatca ttaccgagtg cgggctgcct ccgggcgccc aacctcccac 60

ccgtgactac ctaacactgt tgcttcggcg gggagccctc tcgggggcga gccgccgggg 120

actactgaac ttcatgcctg agagtgatgc agtctgagtc tgaatataaa atcagtcaaa 180

actttcaaca atggatctct tggttccggc atcgatgaag aacgcagcga actgcgataa 240

gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgagtcttt gaacgcacat tgcgccccct 300

ggcattccgg ggggcatgcc tgtccgagcg tcattgctgc ccatcaagcc cggcttgtgt 360

gttgggtcgt cgtccccccc gggggacggg cccgaaaggc agcggcggca ccgtgtccgg 420

tcctcgagcg tatggggctt tgtcacccgc tcgattaggg ccggccgggc gccagccgac 480

gtctccaacc atttttttca ggttgacctc ggatcaggta gggatacccg ctgaacttaa 540

gcatatcaaa aaaccggaag aaaccgaa 568

Claims (7)

1.式(I)所示的抑菌化合物

2.权利要求1所述的抑菌化合物在制备抗金黄色葡萄球菌药物中的应用。

3.用于制备权利要求1所述的抑菌化合物的曲霉，其保藏编号为CGMCC NO.3.20170。

4.权利要求3所述的曲霉在制备细菌抑制剂中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，

所述细菌为金黄色葡萄球菌。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，

利用所述曲霉制备权利要求1所述的式(I)所示的抑菌化合物的方法包括以下步骤：将所述曲霉的发酵产物通过有机相多次萃取，将萃取液合并、干燥后，得到发酵粗提物；

将所述发酵粗提物经正向硅胶柱层析、凝胶Sephadex LH-20柱色谱、高效液相色谱分离纯化，得到所述式(I)所示的化合物，

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，

所述硅胶柱层析以不同体积比的正己烷/二氯甲烷80:20，50:50，20:80，二氯甲烷，以及二氯甲烷/甲醇99:1，98:3，96:4，95:5，90:10混合溶剂进行梯度洗脱，每次300mL。

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