CN109320527B - 鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4及其生产方法及应用 - Google Patents

鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4及其生产方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4及其生产方法及应用。所述的鹿色霉素B1、B2、B3和B4的化学结构如式(1)、(2)、(3)、(4)所示。通过发酵培养保藏编号为CGMCC NO.16425的链霉菌，收获发酵培养物并从中提取和分离纯化，获得鹿色霉素B1‑B4组分。本发明所述的鹿色霉素B1‑B4组分有望作为研发抗细菌感染药物的先导化合物。

Description

鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4及其生产方法及应用
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一种鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4及 其生产方法及应用。
背景技术
随着抗生素的滥用，致病菌对抗生素的耐药性逐渐增加，而耐药基因通过水平转移的方式在同种属或 不同种属的菌群间的传播，也使得耐药菌问题更加难以控制。据我国细菌耐药性监测网数据显示，从 2005-2016年间，部分耐药菌例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的临床检出率虽然得到了一定的 控制，但依然维持在38％以上；但是有些耐药菌例如耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的临床检出率从30％增长至 60％以上；在临床检出率最高的大肠埃希菌中，产超广谱β内酰胺酶的耐药菌维持在约50％。这些数据和 趋势都说明开发新的抗耐药菌药物十分必要。
鹿色霉素(cervinomycin)是一类由微生物产生的、包含氧杂蒽酮结构的多环化合物。该化合物首次 由日本大村智等在20世纪80年代分离得到。它们对普氏消化球菌等厌氧菌的活性很强，最低抑菌浓度在 0.012-25μg/ml之间。其中，18-O-去甲鹿色霉素A2经过化学衍生后，还具有了抗革兰氏阴性细菌活性， 对大肠埃希菌、克雷白氏杆菌等的最低抑菌浓度(MIC)在0.2-3.13μg/ml，曾被作为抗菌药物的先导物进 行研究。不仅如此，大多数多环氧杂蒽酮类化合物都有很强的抗菌和抗球虫活性。例如，simaomicinα被 认为是抗球虫谱最广的天然产物之一，在鸡饲料中添加量为1.0ppm时即可防止病症产生，并且它对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌的MIC均小于0.06μg/ml。2008年，相继发现的neocitremicins I、II和 citreamicinδ、ε，都具有较强的抗耐药菌活性。其中，neocitremicins对MRSA、耐万古霉素粪肠球菌(VRE) 的MIC在0.06-0.5μg/ml。2018年发现的代号为MDN-0185化合物对3D7恶性疟原虫的IC50为9.0nM。 到目前为止，已报道的属于多环氧杂蒽酮类抗生素家族的化合物超过了40个，其中多数具有包括抗菌在 内的多种生物活性。
本发明人从一株链霉菌的次级代谢产物中，分离得到一组共4个多环氧杂蒽酮类抗生素——鹿色霉素 (cervinomycin)B1、B2、B3、B4，经过紫外光谱、高分辨质谱及核磁共振等波谱学数据的分析，确定 (cervinomycin)B1、B2、B3、B4为cervinomycin类新抗生素。对cervinomycin B1、B2、B3、B4进行抗 菌活性评价，发现这四个化合物对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)、甲氧西林敏感表皮葡萄球菌(MSSE)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)、万古霉素敏感粪 肠球菌(VSE)、耐万古霉素粪肠球菌(VRE)、万古霉素敏感屎肠球菌(VSE)、耐万古霉素屎肠球菌(VRE) 都有显著的抑制活性。其中，鹿色霉素B1对革兰氏阳性细菌的MIC为0.03-0.12μg/ml(对MRSA和VRE 等耐药性细菌的MIC为0.03-0.12μg/ml)；鹿色霉素B2对革兰氏阳性细菌的MIC为0.06-0.12μg/ml(对MRSA和VRE等耐药性细菌的MIC为0.06-0.12μg/ml)；鹿色霉素B3对革兰氏阳性细菌的MIC为0.004-0.03μg/ml(对MRSA和VRE等耐药性细菌的MIC为0.004-0.03μg/ml)；鹿色霉素B4对革兰氏阳性 细菌的MIC为0.12-0.5μg/ml(对MRSA和VRE等耐药性细菌的MIC为0.12-0.5μg/ml)。因此，鹿色霉素B1、B2、B3、B4有望成为抗革兰氏阳性细菌及其耐药菌(例如MRSA)的先导化合物，并具有潜在的良 好开发前景。
发明内容
本发明首先提供一组新的多环氧杂蒽酮类抗生素，分别为鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4， 其结构如式(1)、(2)、(3)、(4)所示：
Figure BDA0001862664130000021
所述的鹿色霉素(cervinomycin)B1是一种金黄色无定形粉末，分子式C29H25O9N分子量531，可溶 于二甲基亚砜等有机溶剂，难溶于水。
所述的鹿色霉素(cervinomycin)B2是一种砖红色无定形粉末，分子式C29H23O9N，分子量529，微 溶于二甲基亚砜等有机溶剂，难溶于水；它与鹿色霉素B1组分结构类似，属于B1组分的E环醌式(氧 化)结构。
所述的鹿色霉素(cervinomycin)B3是一种金黄色无定形粉末，分子式C28H23O9N，分子量517，可 溶于二甲基亚砜等有机溶剂，难溶于水；它与鹿色霉素B1组分结构类似，是18-O-去甲基鹿色霉素B1。
所述的鹿色霉素(cervinomycin)B4是一种砖红色无定形粉末，分子式C28H21O9N，分子量515，微 溶于二甲基亚砜等有机溶剂，难溶于水；它与鹿色霉素B3组分结构类似，属于B3组分的E环醌式(氧 化)结构。
本发明还涉及发酵生产上述鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4化合物的制备方法，包括如 下步骤：
(1)发酵培养链霉菌CGMCC NO.16425，收获发酵物；
(2)从发酵物中提取、分离并纯化所述的鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4。
所述发酵培养步骤为：
(1)种子培养。
首先将于零下70℃冰箱中冷冻保藏的链霉菌CGMCC NO.16425孢子悬液，融化后接种于孢子培养基 平板上进行培养，孢子培养条件为26～30℃、6-10天；
孢子培养基组成为(g/L)：淀粉20.0，黄豆饼粉20.0，琼脂粉15.0，pH7.0；
将培养后的孢子用无菌水洗下，振荡悬浮，得新鲜孢子悬液(含约108个孢子/ml)，用于接种发酵培 养基平板；或者，将孢子平板或斜面挖块，接种到液体发酵培养基。
(2)固态或液态发酵所述链霉菌。
所述固态发酵方法为：
将链霉菌CGMCC NO.16425的新鲜孢子悬液，接种于发酵培养基平板，接种量为约106个孢子。发酵 培养基平板于26～30℃培养8-12天，收获发酵培养物；
发酵培养基的组成为(g/L)：玉米淀粉10.0，棉籽饼粉10.0，苏氨酸10.0，琼脂粉15.0，pH7.0。
所述的液态发酵方法为：
将链霉菌CGMCC NO.16425的新鲜孢子斜面或平板，挖块(大小约1-2cm2)接种于装有液体发酵培 养基的摇瓶中，摇瓶于28℃摇床振荡培养5-6天，收集发酵液；
发酵培养基的组成为(g/L)：玉米淀粉10.0，棉籽饼粉10.0，苏氨酸10.0，pH7.0。
为了提高链霉菌CGMCC NO.16425的鹿色霉素B组分产量，在发酵培养基中需要含有丰富碳源与氮 源。碳源包括各种单糖(例如葡萄糖和果糖)、双糖(例如麦芽糖和蔗糖)和多糖(例如淀粉和糊精)等； 氮源、特别是有机氮源，包括氨基酸、多肽和蛋白胨(动物、植物或微生物来源)、黄豆饼粉、棉籽饼粉、 酵母粉、玉米浆和花生饼粉等。这些培养基成分除了为链霉菌CGMCC NO.16425的生长提供所必需的营 养物质和能量之外，还用于提供鹿色霉素B组分生物合成所需的前体或构造单元。因此，链霉菌CGMCC NO.16425的发酵培养基包括但不限于上述的发酵培养基配方。
所述从发酵物中提取、分离并纯化所述的鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4的步骤为：
(1)发酵培养物用有机溶剂例如乙酸乙酯提取，减压旋蒸提取液得到乙酸乙酯粗提物；
(2)乙酸乙酯粗提物采用反相C18色谱柱以除去主要杂质，分别用30％-水、50％-水和70％甲醇-水 洗脱2-3个柱体积，收集洗脱液，经TLC或HPLC分析后合并含有鹿色霉素B各组分的收集液；减压旋 蒸除去洗脱溶剂后，得到含有鹿色霉素B1、B2、B3组分混合物精制品，以及含有鹿色霉素B3、B4组分 混合物精制品；
(3)对鹿色霉素B1、B2、B3组分混合物精制品进行正相硅胶色谱柱分离，采用甲醇(0％-10％)- 二氯甲烷梯度洗脱，经HPLC分析后合并相同成分洗脱液；减压旋蒸除去洗脱溶剂后，得到鹿色霉素B3 组分纯品，以及含有鹿色霉素B1、B2组分混合物精制品；
(4)对鹿色霉素B3、B4组分混合物精制品进行反相半制备HPLC纯化，分别得到鹿色霉素B3组分 和鹿色霉素B4组分纯品；
(5)对鹿色霉素B1、B2组分混合物精制品进行反相制备和半制备HPLC纯化，分别得到鹿色霉素 B1组分和鹿色霉素B2组分纯品；所述反相HPLC使用的流动相为70％或50％乙腈-水，收集含鹿色霉素 B1或B2组分的洗脱峰并经减压旋蒸或冷冻干燥后，得到鹿色霉素B1和B2组分纯品。
链霉菌CGMCC NO.16425的发酵培养物约30L，经上述分离纯化步骤，可以得到鹿色霉素B1组分纯 品5.4mg，鹿色霉素B2组分纯品1.0mg，鹿色霉素B3组分纯品753.2mg，以及鹿色霉素B4组分纯品9.7mg。
本发明还涉及以鹿色霉素(cervinomycin)B1、B3为底物，通过氧化反应得到鹿色霉素(cervinomycin) B2、B4的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将鹿色霉素B1(或B3)溶解于二氯甲烷-甲醇(1:1)溶液中，加入与待氧化组分质量相等的弱 氧化剂(如氧化银)并室温搅拌，待氧化反应完成后(约需要6或9小时)，滤膜过滤除去弱氧化剂(氧 化银)；
(2)采用硅胶柱对过滤液进行分离纯化，甲醇(0％-10％)-二氯甲烷梯度洗脱，真空旋转蒸发得到鹿 色霉素B2(或B4)组分半纯品。对半纯品进行制备型或半制备型反相HPLC精制；洗脱液为乙腈(70％ 或50％)-水。
本发明还涉及所述的鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4在制备抗革兰氏阳性细菌的药物中 的应用，优选的，所述的革兰氏阳性细菌为葡萄球菌属细菌、肠球菌属细菌，更优选的，所述的革兰氏阳 性细菌为耐药革兰氏阳性细菌，最优选的，所述的耐药革兰氏阳性细菌为耐甲氧西林表皮葡萄球菌 (MRSE)、耐万古霉素肠球菌(VRE)。
本发明还涉及一种用于发酵生产所述鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4的菌株：链霉菌CGMCC NO.16425。链霉菌CGMCC NO.16425由中国医学科学院医药生物技术研究所从四川峨眉山分离得到(原 菌株编号：链霉菌CPCC 204980)。链霉菌CGMCC NO.16425已经于2018年9月4日保藏于中国微生物 菌种保藏委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码100101。该菌株的 分类名称为链霉菌Streptomyces sp.，保藏编号为CGMCC No.16425。
附图说明
图1、鹿色霉素B1、B2、B3、B4的化学结构(突出了结构差异)。
图2、鹿色霉素B组分分离纯化流程图。
图3、鹿色霉素(cervinomycin)B1的1H-NMR核磁谱图。
图4、鹿色霉素(cervinomycin)B1的13C-NMR核磁谱图。
图5、鹿色霉素(cervinomycin)B1的1H-1H COSY核磁谱图。
图6、鹿色霉素(cervinomycin)B1的HSQC核磁谱图。
图7、鹿色霉素(cervinomycin)B1的HMBC核磁谱图。
图8、鹿色霉素(cervinomycin)B1的NOESY核磁谱图。
图9、鹿色霉素(cervinomycin)B2的1H-NMR核磁谱图。
图10、鹿色霉素(cervinomycin)B2的13C-NMR核磁谱图。
图11、鹿色霉素(cervinomycin)B2的1H-1H COSY核磁谱图。
图12、鹿色霉素(cervinomycin)B2的HSQC核磁谱图。
图13、鹿色霉素(cervinomycin)B2的HMBC核磁谱图。
图14、鹿色霉素(cervinomycin)B2的ROESY核磁谱图。
图15、鹿色霉素(cervinomycin)B3的1H-NMR核磁谱图。
图16、鹿色霉素(cervinomycin)B3的13C-NMR核磁谱图。
图17、鹿色霉素(cervinomycin)B3的1H-1H COSY核磁谱图。
图18、鹿色霉素(cervinomycin)B3的HSQC核磁谱图。
图19、鹿色霉素(cervinomycin)B3的HMBC核磁谱图。
图20、鹿色霉素(cervinomycin)B3的NOESY核磁谱图。
图21、鹿色霉素(cervinomycin)B4的1H-NMR核磁谱图。
图22、鹿色霉素(cervinomycin)B4的13C-NMR核磁谱图。
图23、鹿色霉素(cervinomycin)B4的1H-1H COSY核磁谱图。
图24、鹿色霉素(cervinomycin)B4的HSQC核磁谱图。
图25、鹿色霉素(cervinomycin)B4的HMBC核磁谱图。
具体实施方式
实施例1：链霉菌CGMCC NO.16425固态发酵培养
(1)制备新鲜孢子悬液：将零下70℃冰箱中冷冻保藏的链霉菌CPCC NO.204980孢子悬液，融化后 均匀涂布接种于7-10个孢子培养基平板(培养基成分：淀粉20.0g/L，黄豆饼粉20.0g/L，琼脂粉15.0g/L，pH7.0；平板直径9.0cm，每个平板装入约20毫升培养基)。28℃培养8-9天时，在平板培养基表面上长出 一层灰色孢子。每个平板用8.0-10.0ml无菌水把孢子洗下，振荡后获得浓度约1×108孢子/ml的孢子悬液， 用于接种发酵培养基平板。
(2)固态发酵培养：将孢子悬液均匀涂布于发酵培养基平板(培养基组成：玉米淀粉10.0g/L，棉籽 饼粉10.0g/L，苏氨酸10.0g/L，琼脂粉15.0g/L，pH7.0；平板直径15.0cm，每个平板装入约45毫升培 养基)，每个平板涂布约50μl孢子悬液。28℃培养8-9天，收获每个发酵平板的培养物(含琼脂培养基)， 用于鹿色霉素B组分分离纯化。
实施例2：鹿色霉素B组分分离纯化
鹿色霉素B1、B2、B3、B4组分的分离纯化流程，可以参见图2。
(1)乙酸乙酯提取：
链霉菌CPCC NO.204980固态发酵培养物(约30L)，加入等体积乙酸乙酯提取，每次浸泡提取2天， 共提取2次。收集乙酸乙酯提取液，真空旋转蒸发，得到棕色乙酸乙酯提取物(约21g)。
(2)鹿色霉素B组分混合物精制品(反相硅胶色谱柱除杂)：
将棕色乙酸乙酯提取物复溶于适量甲醇(约200ml)中，超声促溶。按照1:1.5比例，称取约31g反 相(ODS)硅胶色谱柱填料，加入甲醇溶液中，混匀合后真空旋转蒸发除去甲醇溶剂，得到拌样后的ODS 粉末。
将拌样后的ODS粉末装入上样柱，然后连接到装有约120g反相硅胶色谱柱填料的分离柱。采用甲醇 -水系统作为流动相，进行反向色谱柱纯化以除去主要杂质。首先用纯水洗脱3-4个柱体积，然后用30％甲 醇-水、50％甲醇-水和70％甲醇-水分别洗脱2-3个柱体积，流速20ml/min；收集各阶段洗脱液，每个收集 管约70ml；HPLC和TLC检测各收集管中的目标产物，合并相同成分收集管。经真空旋转蒸发后，得到 含有鹿色霉素B1、B2、B3组分混合物精制品(1.4g)，以及含有鹿色霉素B3、B4组分混合物精制品(231.1 mg)。
(3)鹿色霉素B3和B4组分纯品(反相制备型HPLC纯化)：
将含有鹿色霉素B3-4组分的混合物精制品溶于少量乙腈中，反相制备型HPLC进行纯化。色谱柱型 号：COSMOSIL packed column，5C18-PAQ，10*250mm。采用50％乙腈-水系统等度洗脱，流速2.0ml/min， 收集254nm波长下出现在14.8min和17.1min附近的色谱峰，得到分别含鹿色霉素B3和B4组分的洗脱 液。真空旋转蒸发除去洗脱液中的乙腈，再经冷冻干燥除去水后分别得到金黄色的鹿色霉素B3纯品(126.4 mg)和砖红色的鹿色霉素B4组分纯品(9.7mg)，HPLC分析纯度95％以上。
(4)鹿色霉素B1、B2组分混合物精制品和鹿色霉素B3组分纯品(正相硅胶柱纯化)：
将含有鹿色霉素B1、B2、B3组分的精制品1.4g用约200ml二氯甲烷溶解，之后加入2.1g硅胶色谱 柱填料，混匀后在真空旋转蒸发仪中除去溶剂，得到拌样后的硅胶粉末。
将拌样后的硅胶粉末装入上样柱中，使用0％-10％甲醇-二氯甲烷梯度洗脱180min，流速10.0ml/min， 收集洗脱液，每个收集管约70ml；HPLC或TLC检测各收集管中的化合物，合并含有鹿色霉素B1、B2 组分混合物收集液，以及含有鹿色霉素B3组分收集液；真空旋转蒸发除去洗脱溶剂后得到含鹿色霉素B1、B2组分混合物精制品(199.3mg)，以及鹿色霉素B3组分纯品626.8mg。
(5)鹿色霉素B1和B2组分半纯品(反相制备型HPLC纯化)：
将上述含鹿色霉素B1、B2组分混合物的精制品用10.0ml DMSO溶解，经0.22μm滤膜过滤后进行制 备型HPLC分离纯化，制备柱型号：YMC-Pack ODS-A column，20×250mm。采用50％-100％乙腈-水系统 梯度洗脱，流速5.0ml/min，分别收集含鹿色霉素B1和鹿色霉素B2组分的洗脱峰，真空旋转蒸发除去洗 脱溶剂后得到含鹿色霉素1组分的半纯品(21.5mg)和鹿色霉素B2组分的半纯品(1.9mg)。
(6)鹿色霉素B1和B2组分纯品(反相半制备型HPLC纯化)：
将鹿色霉素B1组分和鹿色霉素B2组分的半纯品分别溶于少量乙腈中，反相半制备型HPLC纯化。色 谱柱型号：COSMOSIL packed column，5C18-PAQ，10*250mm。采用70％乙腈-水系统等度洗脱，流速2.0 ml/min，收集254nm波长下出现在8.5min和10min附近的色谱峰，得到分别含鹿色霉素B1组分和鹿色 霉素B2组分的洗脱液。洗脱液经真空旋转蒸发除去乙腈，再经冷冻干燥后，得到金黄色的鹿色霉素B1 组分纯品(5.4mg)和砖红色的鹿色霉素B2纯品(1.0mg)；HPLC分析纯度在99％以上。
(7)鹿色霉素B1、B2、B3、B4组分化学结构解析：
根据化合物的紫外-可见光谱和高分辨质谱，特别是对1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H相关谱(1H-1H COSY)、1H-13C相关谱(HSQC)和反向检测远程1H-13C异核多键相关谱(HMBC)的解析，确定了鹿色 霉素B1、B2、B3和B4的化学结构(图1)。根据化学结构解析结果，它们属于多环氧杂蒽酮类抗生素， 其分子结构骨架为多环(ABCDEFG，7环)稠合。更具体地它们属于鹿色霉素(cervinomycin)A组分的 类似物。与鹿色霉素A组分相比，鹿色霉素B组分分子D环上连接C-9,10的双键均被还原为单键(正是 根据这个结构差异，本发明将这些化合物归属并命名为鹿色霉素B组分)。与鹿色霉素A1相比，鹿色霉素 B1的D环上C-9,10为单键；与鹿色霉素A2相比，鹿色霉素B2的D环上C-9,10为单键；鹿色霉素B3 是18-O-去甲基鹿色霉素B1；鹿色霉素B4是18-O-去甲基鹿色霉素B2。鹿色霉素B1、B2、B3和B4的 核磁谱图，见图4-25。鹿色霉素B1、B2、B3、B4的NMR核磁数据，见表1-4。
表1、鹿色霉素B1的NMR核磁数据
Figure BDA0001862664130000071
Figure BDA0001862664130000081
表2、鹿色霉素B2的NMR核磁数据
Figure BDA0001862664130000082
Figure BDA0001862664130000091
表3、鹿色霉素B3的NMR核磁数据
Figure BDA0001862664130000092
Figure BDA0001862664130000101
表4、鹿色霉素B4的NMR核磁数据
Figure BDA0001862664130000102
实施例3：鹿色霉素B2和B4组分的氧化制备
鹿色霉素B2和B4组分分别为鹿色霉素B1和B3组分的氧化产物。实施例2中通过分离纯化制备鹿 色霉素B2和B4组分的得率比较低，因此可以利用实施例2中获得的鹿色霉素B1和B3组分的纯品或半 纯品，经过化学氧化方法更加高效地制备鹿色霉素B2和B4组分。具体如下：
(1)称取鹿色霉素B1(或B3)组分25mg(或5mg)，超声溶解在25.0ml(5.0ml)二氯甲烷-甲醇 (体积比1:1)中；称取25mg(或5mg)氧化银，加入溶液中，室温下搅拌。
(2)每隔1h取反应液上清100μl，用0.22μm滤膜过滤除去氧化银；在真空离心浓缩仪中除去溶剂 后，加入100μl乙腈复溶氧化产物，HPLC分析监测氧化反应进度，约9h(或6h)后氧化反应完全。HPLC 分析监测条件为40％-70％乙腈-水系统，梯度洗脱30min，流速1.0ml/min。反应结束后，用0.22μm微米 滤膜过滤反应液除去氧化银，在真空旋转蒸发仪中除去有机溶剂，得到含鹿色霉素B2(或B4)组分的样 品。
(3)将含鹿色霉素B2(或B4)组分的样品复溶于5.0ml(或3.0ml)二氯甲烷-甲醇(体积比1:1) 中，进行制备型硅胶板TLC分离纯化，样品展开系统为二氯甲烷-甲醇(体积比9:1)。展层后的硅胶板晾 干后，将鹿色霉素B2(或B4)组分条带刮下，含有少量甲醇的二氯甲烷溶液洗脱；洗脱液在真空旋转蒸 发仪中蒸干溶剂，得到鹿色霉素B2(或B4)组分的半纯品18.3mg(或4.3mg)。
(4)将上述鹿色霉素B2(或B4)组分的半纯品用2.0ml DMSO溶解，上制备型HPLC进行精制， 所用色谱柱同实施例2。采用50％(或70％)乙腈-水系统等度洗脱，流速2.0ml/min，收集254nm波长 下出现在14.8min(或8.5min)附近的色谱峰，经真空旋转蒸发除去洗脱溶剂后，得到砖红色的鹿色霉素 B2(或B4)组分的纯品7.1mg(或3.6mg)；HPLC分析纯度在99％以上。
实施例4：鹿色霉素B组分抗革兰氏阳性细菌活性
(1)准备样品：
称取实施例2或3中获得的鹿色霉素B1-B4组分纯品适量并溶于DMSO中，制备浓度为1.28mg/ml 的待测样品母液。按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的微量肉汤稀释法，测定其对常见标 准和临床分离的革兰氏阳性细菌(包括MRSA和VRE)菌株的最低抑制浓度(MIC)。
(2)测定：
用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基倍比稀释溶于DMSO中的鹿色霉素B1-B4组分母液后，分别加 入到无菌的聚苯乙烯96孔板中，第1-11孔加待测样品稀释液(每孔100μl)，，第12孔不加待测样品稀释 液(加MH肉汤培养基)作为细菌生长对照。测定菌株为常见的标准和临床分离的革兰氏阳性细菌。
细菌活性测定培养基使用NCCLS推荐的Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基，pH7.2-7.4。直接取培养 18-24h的细菌菌落，用生理盐水调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液，相当于(1-2)×108CFU/ml。用MH肉 汤将待测细菌的菌悬液按照1:1000稀释后，每孔中加入100μl，密封于35℃培养16-20h。根据培养基浑 浊与否并参照对照判断：浑浊，细菌生长；不浑浊，细菌生长受到抑制。
(3)抗菌活性(MIC)：
完全抑制细菌生长的样品最低浓度为MIC。鹿色霉素B1-B4组分对所有测定的革兰氏阳性细菌菌株、 包括MRSA显示了极强的抑制活性。例如，鹿色霉素B3组分的对所有测定菌株的MIC为0.004-0.03μg/ml， 其中对MRSA和VRE耐药菌株的MIC为0.004-0.03μg/ml，均优于阳性对照药物左氧氟沙星。
表5鹿色霉素B1-4组分对革兰氏阳性细菌的最低抑制浓度(MIC)
Figure BDA0001862664130000121
注：MSSE，甲氧西林敏感表皮葡萄球菌；MRSE，耐甲氧西林表皮葡萄球菌；MSSA，甲氧西林敏感 金黄色葡萄球菌；VSE，万古霉素敏感肠球菌；VRE，耐万古霉素肠球菌。

Claims (9)

1.一组多环氧杂蒽酮类抗生素，分别为鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4，其结构如式(1)、(2)、(3)、(4)所示：
Figure FDA0002458239250000011
(1)鹿色霉素(cervinomycin)B1
Figure FDA0002458239250000012
(2)鹿色霉素(cervinomycin)B2
Figure FDA0002458239250000013
(3)鹿色霉素(cervinomycin)B3
Figure FDA0002458239250000014
(4)鹿色霉素(cervinomycin)B4
所述的鹿色霉素(cervinomycin)B1是一种金黄色无定形粉末，分子式C29H25O9N分子量531，可溶于二甲基亚砜等有机溶剂，难溶于水；
所述的鹿色霉素(cervinomycin)B2是一种砖红色无定形粉末，分子式C29H23O9N，分子量529，微溶于二甲基亚砜等有机溶剂，难溶于水；
所述的鹿色霉素(cervinomycin)B3是一种金黄色无定形粉末，分子式C28H23O9N，分子量517，可溶于二甲基亚砜等有机溶剂，难溶于水；
所述的鹿色霉素(cervinomycin)B4是一种砖红色无定形粉末，分子式C28H21O9N，分子量515，微溶于二甲基亚砜等有机溶剂，难溶于水。
2.发酵生产权利要求1所述鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)发酵培养链霉菌CGMCC NO.16425，收获发酵物；
(2)从发酵物中提取、分离并纯化所述的鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4； 所述发酵培养链霉菌CGMCC NO.16425的步骤为：
(1)种子培养；
孢子培养条件为26～30℃、6-10天；
孢子培养基组成为：淀粉20.0g/L，黄豆饼粉20.0g/L，琼脂粉15.0g/L，pH7.0；
(2)固态或液态发酵所述链霉菌，
所述固态发酵方法为：
接种量为约106个孢子，发酵培养基平板于26～30℃培养8-12天，收获发酵培养物；
发酵培养基的组成为：玉米淀粉10.0g/L，棉籽饼粉10.0g/L，苏氨酸10.0g/L，琼脂粉15.0g/L，pH7.0；
所述的液态发酵方法为：
将新鲜孢子斜面或平板，挖块接种于装有液体发酵培养基的摇瓶中，摇瓶于28℃摇床振荡培养5-6天，收集发酵液；
发酵培养基的组成为：玉米淀粉10.0g/L，棉籽饼粉10.0g/L，苏氨酸10.0g/L，pH7.0。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述从发酵物中提取、分离并纯化所述的鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4的步骤为：
(1)发酵培养物用有机溶剂提取，减压旋蒸提取液得到粗提物；
(2)粗提物采用反相C18色谱柱以除去主要杂质，分别用30％甲醇-水、50％甲醇-水和70％甲醇-水洗脱2-3个柱体积，收集洗脱液；减压旋蒸除去洗脱溶剂后，得到含有鹿色霉素B1、B2、B3组分混合物1，以及含有鹿色霉素B3、B4组分混合物2；
(3)对含鹿色霉素B1、B2、B3组分的混合物1进行正相硅胶色谱柱分离，采用含0-10％甲醇的甲醇-二氯甲烷梯度洗脱；减压旋蒸除去洗脱溶剂后，得到鹿色霉素B3组分纯品，以及含有鹿色霉素B1、B2组分混合物3；
(4)对鹿色霉素B3、B4组分的混合物2进行反相半制备HPLC纯化，分别得到鹿色霉素B3组分和鹿色霉素B4组分纯品；
(5)对鹿色霉素B1、B2组分的混合物3进行反相HPLC纯化，分别得到鹿色霉素B1 组分和鹿色霉素B2组分纯品；所述反相HPLC使用的流动相为70％乙腈-水或50％乙腈-水，收集含鹿色霉素B1或B2组分的洗脱峰并经减压旋蒸或冷冻干燥后，得到鹿色霉素B1和B2组分纯品。
4.以鹿色霉素(cervinomycin)B1为底物，制备鹿色霉素(cervinomycin)B2的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将鹿色霉素B1溶解于二氯甲烷与甲醇比为1：1的溶液中，加入与待氧化组分质量相等的弱氧化剂并室温搅拌，待氧化反应完成后，滤膜过滤除去弱氧化剂得过滤液；
(2)采用硅胶柱对过滤液进行分离纯化，含0-10％甲醇的甲醇-二氯甲烷梯度洗脱，真空旋转蒸发得到鹿色霉素B2组分半纯品；
(3)对鹿色霉素B2半纯品进行反相HPLC精制；洗脱液为70％乙腈-水或50％乙腈-水，得鹿色霉素B2纯品。
5.以鹿色霉素(cervinomycin)B3为底物，制备鹿色霉素(cervinomycin)B4的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将鹿色霉素B3溶解于二氯甲烷与甲醇比为1：1的溶液中，加入与待氧化组分质量相等的弱氧化剂并室温搅拌，待氧化反应完成后，滤膜过滤除去弱氧化剂得过滤液；
(2)采用硅胶柱对过滤液进行分离纯化，含0-10％甲醇的甲醇-二氯甲烷梯度洗脱，真空旋转蒸发得到鹿色霉素B4组分半纯品；
(3)对鹿色霉素B4半纯品进行反相HPLC精制；洗脱液为70％乙腈-水或50％乙腈-水，得鹿色霉素B2纯品。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的氧化剂为氧化银。
7.权利要求1所述的鹿色霉素(cervinomycin)B1、B2、B3、B4在制备抗革兰氏阳性细菌的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的革兰氏阳性细菌为耐药革兰氏阳性细菌。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的耐药革兰氏阳性细菌为耐甲氧西林表皮葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌。
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