CN114349762B

CN114349762B - 一类骨架新颖的6/6/6/6/5/5环生物碱类化合物及其在制备抗菌药物中的应用

Info

Publication number: CN114349762B
Application number: CN202011087495.8A
Authority: CN
Inventors: 鞠建华; 宋永相; 杨佳凡
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2020-10-13
Filing date: 2020-10-13
Publication date: 2023-01-03
Anticipated expiration: 2040-10-13
Also published as: CN114349762A

Abstract

本发明公开了一类骨架新颖的6/6/6/6/5/5环生物碱类化合物及其在制备抗菌药物中的应用。该生物碱类化合物的结构如式(Ⅰ)所示：式(Ⅰ)中化合物1：R₁＝H,R₂＝Me；或化合物2：R₁＝H,R₂＝H；或化合物3：R₁＝OH,R₂＝Me；或化合物4：R₁＝OH,R₂＝H。本发明的生物碱类化合物‑化合物1至化合物4是新化合物，对测试细菌具有较好的抑制作用，可以用于制备抑菌药物或作为抑菌药物的前体，用于治疗细菌感染，因此本发明为开发抑菌药物提供了新的备选化合物，对开发中国海洋药物资源具有重要的意义。

Description

一类骨架新颖的6/6/6/6/5/5环生物碱类化合物及其在制备抗菌药物中的应用

技术领域：

本发明属于天然产物领域，具体涉及四个骨架新颖的四氢异喹啉生物碱类化合物及其在制备抗菌药物中的应用。

背景技术：

天然产物作为新药的摇篮，市面上的许多药物都是从天然产物中直接或间接衍生而来， 1981至2014年的1562种新批准的药物中，有710种来自于天然产物，总占比近50％，是新药研发的重要源头。然而，致病微生物感染长久以来始终都困扰着人们的健康问题，随着耐药“超级细菌”的出现，传统抗生素正面临着可能失效的严峻问题，除了杜绝抗生素的滥用外，新型抗生素的开发更是显得尤为重要。在抗生素药物的研发过程中，四氢异喹啉生物碱类化合物因其具有广泛的生物活性，一直以来都是抗生素研发的重要药物先导化合物来源。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供四个具有抑菌活性的生物碱类化合物及其药用盐。

本发明的骨架新颖的6/6/6/6/5/5生物碱类化合物及其药用盐，其结构如式(Ⅰ)所示：

式(Ⅰ)中，化合物1：R₁＝H,R₂＝Me；或化合物2：R₁＝H,R₂＝H；或化合物3：R₁＝OH, R₂＝Me；或化合物4：R₁＝OH,R₂＝H。

本发明人结合高效液相色谱法和抑菌活性筛选法对深海沉积物来源放线菌Streptomyces niveus SCSIO 3406发酵提取物进行分析，发现其在30min的HPLC-DAD分析过程中4-6min 的发酵提取物组分具有明显的抑菌活性。进而，通过摇床放大发酵、萃取、分离纯化，得到 4个四氢异喹啉生物碱类化合物1至化合物4。通过HRESIMS高分辨质谱，1D、2DNMR等技术，确定这4个单体为四氢异喹啉生物碱类化合物。具体结构如式(Ⅰ)所示，化合物1： R₁＝H,R₂＝Me；或化合物2：R₁＝H,R₂＝H；或化合物3：R₁＝OH,R₂＝Me；或化合物4： R₁＝OH,R₂＝H。

通过对化合物1至化合物4的抑菌活性评价，发现化合物2对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis BS01)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus ML01)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 29213)或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA 991、MRSA1862、MRSA SH1)有较好抑制活性，具有开发抗菌药物先导化合物的潜力。

因此本发明的第二个目的是提供化合物1、化合物2、化合物3或化合物4在制备抗菌药物中的应用。

所述的抗菌药物优选为抗枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物。

本发明的第三个目的是提供一种抗菌药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的如式(Ⅰ)所示的化合物1、化合物2、化合物3或化合物4，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

本发明的第四个目的是提供放线菌Streptomyces niveus SCSIO 3406在制备上述化合物1、 2、3和/或4中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种上述化合物1、2、3和/或4的制备方法，其是从放线菌 Streptomyces niveus SCSIO 3406的发酵培养物中分离得到的。

所述的线菌Streptomyces niveus SCSIO 3406的发酵培养物是放线菌Streptomyces niveus SCSIO 3406经过发酵培养基发酵培养得到，所述的发酵培养基为：以总质量分数100％计，包括可溶性淀粉0.5％，大豆粉0.5％，葡萄糖2％，酵母膏0.2％，蛋白胨0.2％，K₂HPO₄ 0.05％， MgSO₄·7H₂O 0.05％，NaCl 0.4％，粗海盐0.3％，CaCO₃ 0.2％，余量为水，pH 7.2-7.4。

优选，具体制备方法为：

制备放线菌Streptomyces niveus SCSIO 3406的发酵培养物，将发酵培养物进行固液分离得到上清发酵液和沉淀菌丝体，上清液用大孔树脂吸附，用无水乙醇洗脱，洗脱液浓缩得发酵提取物浸膏，浸膏用硅胶柱层析分离，采用氯仿/甲醇从100:0,98:2,96:4,94:6,92:8,90:10, 80:20,50:50,v/v梯度洗脱顺序得8个组分A1-A8，将组分A3-A5合并后使用反相ODS中压 MPLC分离，收集各目标馏分，再经纯化分离得到化合物1、2、3、4。

四氢异喹啉生物碱类化合物具有复杂的多环结构，根据其多环特征可分为三种亚型，即以番红霉素为代表的I型(SFM,typeⅠ)、以萘霉素为代表的Ⅱ型(NDM,typeⅡ)和以奎诺卡星为代表的Ⅲ型(QNC,typeⅢ)，本专利所申请的4个生物碱类化合物因其骨架中具有独特的含氧6元环而不同于这三种类型。

本发明的生物碱类化合物-化合物1至化合物4是新化合物，其中化合物2对测试细菌具有较好的抑制作用，可以用于制备抑菌药物，用于治疗细菌感染，因此本发明为开发新的抑菌药物提供了备选化合物，对开发中国海洋药物资源具有重要的意义。

本发明的深海沉积物来源放线菌Streptomyces niveus SCSIO 3406于2013年7月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC NO.7863。

附图说明：

图1是化合物1的¹H NMR(700MHz)图谱，溶剂为：MeOD；

图2是化合物1的¹³C NMR(175MHz)图谱，溶剂为：MeOD；

图3是化合物2的¹H NMR(700MHz)图谱，溶剂为：MeOD；

图4是化合物2的¹³C NMR(175MHz)图谱，溶剂为：MeOD。

图5是化合物3的¹H NMR(700MHz)图谱，溶剂为：MeOD；

图6是化合物3的¹³C NMR(175MHz)图谱，溶剂为：MeOD；

图7是化合物4的¹H NMR(700MHz)图谱，溶剂为：MeOD；

图8是化合物4的¹³C NMR(175MHz)图谱，溶剂为：MeOD。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

如式(Ⅰ)所示的化合物1至化合物4的制备和结构鉴定

一、如式(Ⅰ)所示的化合物1至化合物4的制备

1.种子培养：

(1)种子培养基配方(MAM2ab培养基配方)：以质量分数100％计，包括可溶性淀粉0.5％，大豆粉0.5％，葡萄糖2％，酵母膏0.2％，蛋白胨0.2％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O0.05％，NaCl 0.4％，粗海盐0.3％，CaCO₃ 0.2％，余量为水，pH 7.2-7.4。按照配方将称量好的上述物质溶解、混匀，以每瓶50mL分装于250mL的锥形瓶中，于121℃灭菌20分钟，做为种子培养基。

(2)种子的培养：将菌株Streptomyces niveus SCSIO 3406的菌丝体或孢子接入到上述种子培养基中，以200rpm的转速、在28℃下、摇床培养36小时得种子培养液。

2.放大发酵培养：

(1)放大发酵培养基配方：以总质量分数100％计，包括可溶性淀粉0.5％，大豆粉0.5％，葡萄糖2％，酵母膏0.2％，蛋白胨0.2％，K₂HPO₄ 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，NaCl0.4％，粗海盐0.3％，CaCO₃ 0.2％，余量为水，pH 7.2-7.4。按照配方将称量好的上述物质溶解、混匀，配置总体积约20L，然后以每瓶200mL分装于1000mL的锥形瓶中，于121℃灭菌20 分钟，做为放大发酵培养基。

(2)发酵培养：

在无菌条件下，将培养好的种子培养液分别接种于放大发酵培养基中，每1000ml锥形瓶(含约200mL放大发酵培养基)接种一瓶种子培养液(约50mL)，以200rpm的转速、在28℃下、摇床培养7天得海洋放线菌Streptomyces niveus SCSIO 3406发酵液。

3.提取分离：

将结束发酵的菌株Streptomyces niveus SCSIO 3406的发酵液，以3600rpm离心10min，得上清发酵液和沉淀菌丝体。目的组分主要在上清液中，上清液在填充了2.5L大孔树脂的柱子上吸附3次，用8L无水乙醇洗脱3次，洗脱液馏分在30℃下减压浓缩得发酵提取物浸膏。该浸膏用100-200目硅胶分离，经拌样、干法装柱后，采用氯仿/甲醇(C/M,100:0,98:2,96:4, 94:6,92:8,90:10,80:20,50:50,v/v,350mL)梯度洗脱顺序得8个组分(A1-A8)。将组分A3-A5 合并后使用反相ODS中压MPLC在254nm检测波长，15mL/min的流速下梯度洗脱 (CH₃CN/H₂O在120min内从5/95v/v的比例到100/0v/v洗脱)，每10min收集一个组分，顺序相应得到12个组分(B1-B12)。将组分B5、B6、B8分别装载于Sephadex LH-20凝胶柱(洗脱剂CHCl₃/MeOH,1/1,v/v)上，每10mL收集一个组分，B5组分分离所得组分命名为C1-C8(每10ml为一个组分，顺序得到C1-C8)，B6组分分离所得组分命名为L1-L5(每 10ml为一个组分，顺序得到L1-L5)，B8组分分离所得组分命名为P1-P6(每10ml为一个组分，顺序得到P1-P6)。将组分C5-C8合并后重新装载到Sephadex LH-20凝胶柱上 (CHCl₃/MeOH,1/1,v/v)重复洗脱，每10mL收集一个组分，顺序得到馏分E1-E3。组分E3 从MeCN/H₂O/HAc(在15min内从5/95/0.1v/v到40/60/0.1v/v洗脱)流速为2.5mL/min，检测波长254nm的条件下做半制备(SP)高效液相色谱(HPLC)纯化制备，在保留时间t_R＝10.3 min时得到化合物4，2.6mg。对组分L4采用SP-HPLC纯化，从MeCN/H₂O/HAc(在25min 内从2/98/0.1v/v到20/80/0.1v/v洗脱)流速为2.5mL/min，检测波长254nm的条件下得到含有目标化合物2和3的组分L4.3(t_R＝16min)和L4.4(t_R＝17.8min)。将组分L4.3和L4.4 合并后用SP-HPLC梯度洗脱(2.5mL/min,254nm)的方式(CH₃CN/H₂O/HAc,从5/95/0.1 到10/90/0.1,15min,再从10/90/0.1到70/30/0.1,10min)在保留时间t_R＝19.7min和t_R＝23.9 min时得到化合物2(2.1mg)和化合物3(4.6mg)。化合物1(2.1mg)则为对从B8组分分离得的P5用SP-HPLC(2.5mL/min,254nm)梯度洗脱的方式(CH₃CN/H₂O/HAc,从5/95/0.1 到15/85/0.1,25min)在保留时间t_R＝13.4min时得到。

二、化合物1至化合物4的理化数据

对化合物1至化合物4进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：

化合物1:黄色无定形粉末；[α]²⁰ _D+8.5(c 0.05,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)394(2.50), 280(3.29),203(3.11)nm；IR(ATR)ν_max 3323,2953,2905,2772,1647cm^-1；¹H及¹³CNMR谱图见图1-2；(+)-HRESIMS m/z 391.1497[M+H]⁺(calcd for C₁₉H₂₃N₂O₇,391.1500).

化合物2:黄色无定形粉末；[α]²⁰ _D+11.9(c 0.11,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)392(3.28), 280(4.05),203(3.84)nm；IR(ATR)ν_max 3280,2952,2922,2850,1541cm^-1；¹H及¹³CNMR谱图见图3-4；(+)-HRESIMS m/z 377.1346[M+H]⁺(calcd for C₁₈H₂₁N₂O₇,377.1343).

化合物3:黄色无定形粉末；[α]²⁰ _D+95.0(c 0.18,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)391(3.72), 283(4.39),202(4.06)nm；IR(ATR)ν_max 3749,2924,2852,1550cm^-1；¹H及¹³C NMR谱图见图 5-6；(+)-HRESIMS m/z 407.1448[M+H]⁺(calcd for C₁₉H₂₃N₂O₈,407.1449).

化合物4:黄色无定形粉末；[α]²⁰ _D+38.9(c 0.08,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)389(3.02),283(3.71),204(3.63)nm；IR(ATR)ν_max 3336,2953,2922,2852,1647cm^-1；¹H及¹³CNMR谱图见图7-8；(+)-HRESIMS m/z 393.1301[M+H]⁺(calcd for C₁₈H₂₁N₂O₈,393.1292).

根据以上理化数据分析可知，化合物1至化合物4的结构如式(Ⅰ)。

实施例2：

对实施例1的生物碱类化合物-化合物1至化合物4的抑菌实验。

用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis BS01)、藤黄微球菌(Micrococcus luteusML01)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC 29213)或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA 991、MRSA 1862、MRSA SH1)做为测试细菌，参照CLSI的微孔板法对化合物1-4进行100 μl体系测试活性。具体为：

1)细菌培养：以Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基培养实验菌，当其生长8-12h至约0.5个 Mcfarland浓度(1×10⁸CFU)时备用。并配置好一定浓度的样品溶液和阳性对照溶液，阳性对照选用氨苄西林、万古霉素两种(水溶)。

2)配置样品与稀释菌液。将样品(化合物1-4)配置成3200μg/mL，均以DMSO溶解。将菌液合理稀释，保证最终测试浓度约为5×10⁴CFU。

3)加MH肉汤。用排枪往96孔板中加MH肉汤，第1列加96μl、第12列加100μl无菌 MH肉汤，其余各列加入50μl无菌MH肉汤，第11列和第12列分别作为阳性和阴性对照。

4)加样品(药品)：吸取4μl事先配好的样品溶液或阳性对照溶液(也以DMSO溶解)，加入第1列。将排枪体积设置为50μl，将第1列的测试药物小心上下吸取4-5次，以混合均匀，期间要防止用力过猛溅出。

5)混匀样品(药品)。用排枪从第一列中吸取50μl，加入到对应的第二列中，上下吸取小心4-5次，混匀后再吸取50μl加入第三排。依次类推，直到稀释至第10列，从第10列中取出50μl弃掉。

6)活性测试。向1-11列每孔加入50μl稀释的实验菌液。此时，第1列至第10列药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。盖上盖子，轻微震荡，置于 37℃培养箱培养12-18小时，第11列做阳性对照，第12列做空白对照，确定出每个样品的MIC值。

7)每个样品做3个平行。实验结果见表1。

表1：化合物1-4对6株测试细菌的MIC值(μg/mL)

Amp:氨苄西林.Van:万古霉素.

由表1可见，化合物2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis BS01)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus ML01)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 29213)或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA 991、MRSA 1862、MRSA SH1)有较好的抑菌活性。尤其是其对3株不同耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制活性均优于阳性对照氨苄西林，为以此为基础进行耐药性抗生素的研发提供了支持。

综上所述，本发明为研制新型抗菌药物提供了新的先导化合物，在此基础上，对进一步开发中国海洋药物资源具有重要的意义。

Claims

1.一类6/6/6/6/5/5环生物碱类化合物，或其药用盐，其结构如式（Ⅰ）所示：

式（Ⅰ）

式（Ⅰ）中，化合物1：R1=H, R2= Me；或化合物2：R1= H, R2= H；或化合物3：R1= OH, R2=Me；或化合物4：R1= OH, R2=H。

2.权利要求1所述的化合物1、化合物2、化合物3或化合物4在制备抗菌药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗菌药物为抗枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物。

4.一种抗菌药物，其特征在于，包括有效量的作为活性成份的权利要求1所述的化合物1、化合物2、化合物3或化合物4，或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

5.根据权利要求4所述的抗菌药物，其特征在于，所述的抗菌药物为抗枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物。

6.放线菌Streptomyces niveus SCSIO 3406在制备权利要求1中化合物1、2、3和/或4中的应用，所述的放线菌Streptomyces niveus SCSIO 3406的保藏编号为：CGMCCNO.7862。

7.一种权利要求1中的化合物1、2、3和4的制备方法，其特征在于，制备放线菌Streptomyces niveus SCSIO 3406的发酵培养物，将发酵培养物进行固液分离得到上清发酵液和沉淀菌丝体，上清液用大孔树脂吸附，用无水乙醇洗脱，洗脱液浓缩得发酵提取物浸膏，浸膏用硅胶柱层析分离，采用氯仿/甲醇从100:0, 98:2, 96:4, 94:6, 92:8, 90:10,80:20, 50:50, v/v梯度洗脱顺序得8个组分A1-A8，将组分A3-A5合并后使用反相ODS中压MPLC分离，收集各目标馏分，再经纯化分离得到化合物1、2、3、4；

所述的放线菌Streptomyces niveus SCSIO 3406的保藏编号为：CGMCC NO.7862。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的线菌Streptomyces niveusSCSIO 3406的发酵培养物是放线菌Streptomyces niveus SCSIO 3406经过发酵培养基发酵培养得到，所述的发酵培养基为：以总质量分数100%计，包括可溶性淀粉0.5%，大豆粉0.5%，葡萄糖2%，酵母膏0.2%，蛋白胨0.2%，K2HPO4 0.05%，MgSO4•7H2O 0.05%，NaCl 0.4%，粗海盐0.3%，CaCO3 0.2%，余量为水，pH 7.2-7.4。