CN111748489B

CN111748489B - 海洋灰平链霉菌hn60及其应用

Info

Publication number: CN111748489B
Application number: CN202010493105.0A
Authority: CN
Inventors: 杨革; 孙萍; 车程川; 刘金锋; 巩志金
Original assignee: Qufu Normal University
Current assignee: Qufu Normal University
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2040-06-03
Also published as: CN111748489A; NL2027216B1

Abstract

本发明属于海洋放线菌资源开发与利用领域，具体涉及海洋灰平链霉菌HN60及其应用。所述海洋灰平链霉菌HN60作为放线菌素V、放线菌素D的生产菌株，所述培养基pH为7.2~7.4，所述培养基的组成为麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，酵母浸粉4g，天然海水1L。提取出的放线菌素V、放线菌素D具有良好的抗金黄色葡萄球菌活性。

Description

海洋灰平链霉菌HN60及其应用

技术领域

本发明属于放线菌资源利用领域，涉及海洋灰平链霉菌HN60及其应用，具体涉及一株海洋链霉菌HN60及其在制备抗肿瘤活性物质中的应用。

背景技术

线菌隶属放线菌门，为革兰氏阳性菌，极少为革兰氏阴性菌，DNA具有高（G+C）%含量，生命周期复杂。放线菌因其次级代谢产物的多样性及丰富的生物活性，常被认为是重要的微生物资源。研究表明，目前发现的三万多种微生物次级代谢产物中，40%以上为放线菌所产生，在已知天然抗生素中70%为放线菌所产生，且部分放线菌所产生的次级代谢产物已运用到实际生活中，如用于临床药物的万古霉素等，用于农用抗生素的井岗霉素等。随着抗生素的广泛使用，耐药菌株逐渐增多，但自20世纪80年代中期，陆地微生物所产生的药物数量呈下降趋势，因此海洋微生物受到广泛关注，期望从海洋环境中挖掘出新的放线菌菌株及结构新颖的代谢产物.

病原微生物耐药性的增加，加大了对于新型药物的需求，而化学合成也不能完全解决对于新型药物的需求，微生物次级代谢产物往往具有结构复杂、生物活性强等特点，因此微生物次级代谢产物是药物先导化合物的来源。研究表明，微生物次级代谢产物已发现三万多种，其中放线菌所产生的占40%以上，在已知天然抗生素中70%为放线菌所产生，且部分放线菌所产生的次级代谢产物已运用到实际生活中，如用于临床药物的万古霉素等，用于农用抗生素的井岗霉素等。放线菌次级代谢产物的研究成为目前研究重点。

海洋放线菌可产生丰富的次级代谢产物且呈现各种生物活性，如抗菌、消炎、抗肿瘤、抗氧化、酶、酶抑制剂、杀虫剂、表面活性剂、抗病毒、免疫调节、除草剂等，海洋放线菌可产生不同种类的次级代谢产物，包括：多烯类化合物、生物碱类化合物、萜类化合物、大环内酯类化合物、聚酮类化合物、肽类化合物等。己有的研究表明，由于海洋环境的特殊性,赋予生活在海洋中的放线菌在生理性状和遗传背景上以特殊性，因此海洋放线菌必定能够产生结构新颖的代谢物质，并同陆地放线菌一样,成为抗肿瘤、抗生素等制药业的又一重要微生物资源。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种海洋放线菌HN60，所述放线菌HN60分类命名为Streptomyces griseoplanus，于2019年11月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No . 18948。

本发明的另一发明目的是提供了上述海洋灰平链霉菌HN60在制备抗肿瘤活性物质中的应用。

进一步地，所述抗肿瘤活性物质包含放线菌素V或/和放线菌素D。

进一步地，所述抗肿瘤活性物质的制备采用以下步骤：

（1）海洋放线菌HN60接种于液体YMG培养基，30℃、180 r/min摇床培养2天，得到种子液；

（2）将步骤（1）中的种子液按照8%的接种量接种于YMG培养基中，30℃、180 r/min摇床培养6天，发酵结束后离心去除菌体，收集上清液进行萃取实验；

（3）步骤（2）收集的上清液用乙酸乙酯进行萃取，萃取后乙酸乙酯相旋蒸后溶于95%甲醇用石油醚进行萃取，萃取后甲醇相旋蒸得到粗提物；

（4）将步骤（3）得到的粗提物进行分离纯化即得到所述的抗肿瘤活性物质。

进一步地，步骤（1）所述的液体YMG培养基配方为麦芽浸粉 10g，酵母浸粉 4g，葡萄糖 4g，天然海水 1L，pH 7.2~7.4。

进一步地，步骤（4）所述的分离纯化为依次采用硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、葡聚糖凝胶进行分离纯化。

进一步地，上述海洋灰平链霉菌HN60的分离培养方法：

土壤样品室温下放置14~21 d进行风干，随后用4种不同的培养基对样品进行海洋放线菌的筛选，筛选培养基配方见表1。土壤样品用无菌生理盐水进行系列稀释，浓度分别为10^-1~10^-3。不同浓度稀释液分别取100 μL涂布于不同的筛选培养基（所有筛选培养基分别加入重铬酸钾及萘啶酮酸，终浓度分别75 μg/mL及25 μg/mL，28℃培养14~28 d。采用高氏一号培养基对筛选出的放线菌进行分离纯化，纯化出的放线菌-80℃保存备用。

表1 海洋放线菌筛选培养基配方

有益效果

（1）本发明公布了可以产生抗肿瘤活性物质的海洋放线菌新菌—海洋灰平链霉菌Streptomyces griseoplanus HN60，所述海洋灰平链霉菌的发酵液可同时产生放线菌素V和放线菌素D，抗肿瘤活性好，放线菌素V和放线菌素D对Hela的IC50分别为3.59 μg/mL、7.5μg/mL。。

（2）本发明还提供了抗肿瘤活性物质中放线菌素V和放线菌素D的分离纯化方法，该方法操作简单，成本低廉。

附图说明

图1 化合物分离流程

图2 化合物1结构式

图3 化合物1质谱图

图4 化合物2结构式

图5 化合物2质谱图。

具体实施方式

为了进一步了解本发明的特征、技术手段以及所达到的具体目的、功能，解析本发明的优点和精神，通过下面的实施例和对比例对本发明的上述内容在作进一步的详细说明。但是，不应该将此理解为本发明上述主体范围仅仅局限于以下实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

所述海洋放线菌的菌种保藏信息为：

保藏时间：2019年11月13日，

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，

保藏编号：CGMCC No . 18948，

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码： 100101

分类命名：Streptomyces griseoplanus。

实施例1

称取1 g样品，溶于9 mL无菌水中，28℃摇床震荡30 min。取上层土壤悬液进行梯度稀释，分别稀释为10^-1~10^-3，每一梯度取100 uL分别涂布于高氏一号培养基、YMG培养基、HVA培养基、丙酸钠培养基（所有培养基均在倒制平板前添加25 ug/mL的萘啶酮酸以抑制快速生长的细菌，尤其是革兰氏阴性细菌与75 ug/mL的重铬酸钾以抑制细菌、真菌的生长），挑取单菌落做进一步的纯化，分离单菌落所用的培养基为高氏一号培养基。连续进行3次划线以纯化出单一菌落，得到菌株HN60。

海洋放线菌HN60的16S rDNA鉴定：16S rDNA序列扩增及测序：采用阳性细菌基因组试剂盒提取基因组DNA，引物序列

上游：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，

下游：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

PCR总反应体系50uL：模板2uL，2×Taq Mix 25uL，引物1：2uL，引物2：2uL，ddH₂O：19uL。PCR反应条件：预变性94℃ 5min，变性94℃ 1min，退火55℃ 1min，延伸72℃ 1.5min，35个循环，终延伸72℃ 10min反应结束。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定目标条带无拖尾现象后送公司进行测序。菌株序列NCBI上进行核苷酸序列BLAST比对后，发现与灰平链霉菌（Streptomyces griseoplanus）相似性达到100%。

实施例2

海洋灰平链霉菌HN60发酵及粗提物的获得：采用培养基组成为：麦芽浸粉10 g，葡萄糖4 g，酵母浸粉4 g，天然海水 1L，pH 7.2~7.4。灰平链霉菌按照8%接种量接种于YMG液体培养基终，30℃培养6 d。培养结束后培养液离心去除菌体，用乙酸乙酯对上清液进行萃取，萃取至乙酸乙酯相呈无色状态，收集乙酸乙酯相，脱脂棉过滤得到旋转蒸发得到粗提物I。粗提物I溶于95%甲醇后与等体积石油醚进行萃取，至石油醚相无色后萃取结束，甲醇相经旋转蒸发去除甲醇得到最终粗提物，共得到5.3 g。

实施例3

次级代谢产物的分离纯化：称取60 g硅胶石油醚溶胀硅胶并进行装柱，5 mL二氯甲烷溶解5.3 g粗提物进行上样，上样后进行洗脱，洗脱剂具体为：石油醚-乙酸乙酯（500mL-500 mL）、石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯（130 mL-130 mL-130 mL）、石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯（300 mL-600 mL-600 mL）、二氯甲烷-乙酸乙酯（100mL-200 mL）、二氯甲烷-甲醇（100mL-200mL）。用锥形瓶进行收集，每100 mL收集一瓶。收集液进行硅胶薄层层析检测，将检测结果相同的组分进行合并。最终得到Fr.1（0.3 g）、Fr.2（4.3 g）、Fr.3（0.7 g）。

用4 mL乙腈溶解Fr.2（4.3 g），然后上样进行反相硅胶柱层析，乙腈/水进行梯度洗脱，具体为：超纯水1 L，50%乙腈1L，67%乙腈3 L。流速设置为10 mL/min，洗脱液每20 mL收集一管。收集液进行硅胶薄层层析检测，将检测结果相同的组分进行合并。最终得到Fr.2-A（603.7 mg）、Fr.2-B（936.6 mg）、Fr.2-C（1095.6 mg）、Fr.2-D（952.1 mg）、Fr.2-E（512.3 mg）。

称取28 g硅胶二氯甲烷溶胀硅胶并进行装柱，用1 mL甲醇溶解Fr.2-B（936.6 mg）进行上样，上样后进行洗脱，洗脱剂具体为：二氯甲烷（1000 mL）、二氯甲烷-乙酸乙酯（1000mL-100 mL）、二氯甲烷-乙酸乙酯（1000 mL-200 mL）、二氯甲烷-甲醇（200 mL-100 mL）。洗脱液每50 mL收集一瓶。收集液进行硅胶薄层层析检测，将检测结果相同的组分进行合并。最终得到Fr.2B-1（372.8 mg）、Fr.2B-2（10.3 mg）、Fr.2B-3（98.5mg）、Fr.2B-4（60.5 mg）、Fr.2B-5（389 mg），并得到化合物1（10.3 mg）。

用0.5 mL甲醇溶解Fr.2B-5（389 mg）进行Sephadex LH-20柱层析，甲醇进行洗脱，流速为25~30 s/滴，每1h收集1试管。收集液进行硅胶薄层层析检测，将检测结果相同的组分进行合并。得到化合物2（15.6 mg）。化合物1及化合物2的分离流程见图1。

实施例4

将化合物1和化合物2分别溶解于0.5 mL氘代氯仿中，装入核磁管进行测试，分别测试一维核磁谱和二维核磁谱。化合物溶于色谱级乙腈进行质谱分析。

实验结果：化合物1为放线菌素V，红色晶体，分子式为C₆₂H₈₄N₁₂O₁₇，易溶于二氯甲烷，ESI-MS m/z [M+H]⁺ 1269.3（计算值C₆₂H₈₅N₁₂O₁₇，1269.6156），[M+Na]⁺ 1291.3（计算值C₆₂H₈₄N₁₂NaO₁₇，1291.5975）。化合物1核磁数据分析见表2。化合物1的结构式及质谱图见图2和图3。

化合物2为放线菌素D，红色晶体，分子式为C₆₂H₈₆N₁₂O₁₆，易溶于二氯甲烷，ESI-MSm/z [M+H]⁺ 1255.3（计算值C₆₂H₈₇N₁₂O₁₆，1255.6363），[M+Na]⁺ 1277.3（计算值C₆₂H₈₆N₁₂NaO₁₆，1277.6182）。化合物2核磁数据分析见表2。化合物2的结构式及质谱图见图4和图5。

表2 化合物1核磁数据

注：¹H at 500 MHz in CDCl₃-d，¹³C at 125 MHz in CDCl₃-d，(δ in ppm，J inHz)。

表3 化合物2核磁数据

实施例5

收集对数生长期的Hela细胞，调节细胞悬液浓度（5×104/mL），加入96孔板中，每孔100 μL，每板设置空白组、对照组和实验组。将96孔板在37℃，5% CO₂，饱和湿度的环境中培养24 h后，向实验组的孔中加入5 μL的样品作用24 h，然后再向各孔中加入15 μL MTT溶液，继续培养4-5 h。吸出上清液，向每孔中加入100 μL DMSO，避光充分震荡5 min。最后根据酶标仪测定的各孔溶液在570 nm处的吸光度，按照以下公式对细胞相对存活率进行计算：

公式中A_sample代表实验组在570 nm处的吸光度，A_blank和A_control分别代表空白组和对照组在570 nm处的吸光度。

经测定，化合物1（放线菌素V）和化合物2（放线菌素D）对Hela的IC₅₀分别为3.59 μg/mL、7.5 μg/mL。

<110> 曲阜师范大学

<120> 海洋灰平链霉菌HN60及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1421

<212> DNA

<213> 海洋灰平链霉菌HN60

<400> 1

gtgcttacac atgcaggtcg aacgatgaag ccacttgcgg tggtggatta gtggcgaacg 60

ggtgagtaac acgtgggcaa tctgcccttc actctgggac aagccctgga aacggggtct 120

aataccggat aacactctgt cccgcatggg acggggttga aagctccggc ggtgaaggat 180

gagcccgcgg cctatcagct tgttggtggg gtaatggcct accaaggcga cgacgggtag 240

ccggcctgag agggcgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300

ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga tgcagcgacg ccgcgtgagg 360

gatgacggcc ttcgggttgt aaacctcttt cagcagggaa gaagcgaaag tgacggtacc 420

tgcagaagaa gcgccggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta gggcgcaagc 480

gttgtccgga attattgggc gtaaagagct cgtaggcggc ttgtcacgtc ggatgtgaaa 540

gcccggggct taaccccggg tctgcattcg atacgggcta gctagagtgt ggtaggggag 600

atcggaattc ctggtgtagc ggtgaaatgc gcagatatca ggaggaacac cggtggcgaa 660

ggcggatctc tgggccatta ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt 720

agataccctg gtagtccacg ccgtaaacgt tgggaactag gtgttggcga cattccacgt 780

cgtcggtgcc gcagctaacg cattaagttc cccgcctggg gagtacggcc gcaaggctaa 840

aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcagcggag catgtggctt aattcgacgc 900

aacgcgaaga accttaccaa ggcttgacat ataccggaaa gcatcagaga tggtgccccc 960

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Claims

1.海洋放线菌HN60，其特征在于，所述放线菌HN60分类命名为Streptomyces griseoplanus,于2019年11月13日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No . 18948。

2.一种权利要求1所述的海洋灰平链霉菌HN60在制备抗肿瘤活性物质中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤活性物质为放线菌素V和/或放线菌素D。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤活性物质的制备采用以下步骤：

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述的液体YMG培养基配方为麦芽浸粉 10g，酵母浸粉 4g，葡萄糖 4g，天然海水 1L，pH 7.2~7.4。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（4）所述的分离纯化为依次采用硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、葡聚糖凝胶进行分离纯化。