CN113881602A - 一种高产c21甾体化合物的蜡样芽孢杆菌x-32及其应用 - Google Patents

一种高产c21甾体化合物的蜡样芽孢杆菌x-32及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产C21甾体化合物的蜡样芽孢杆菌X‑32及其应用。本发明蜡样芽孢杆菌X‑32经理化性状分析及分子鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)，并于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211165，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。本发明蜡样芽孢杆菌X‑32经优化发酵培养后，发酵液中C21甾体浓度达1.280±0.005mg/mL，其代谢产物经鉴定为隔山消苷C1N。本发明为微生物合成C21甾体化合物的新途径，具有合成步骤少、生产周期短、转化率高、发酵过程易调控、更环保等优点。

Description

一种高产C21甾体化合物的蜡样芽孢杆菌X-32及其应用
技术领域
本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种高产C21甾体化合物的蜡样芽孢杆菌X-32及其应用。
背景技术
C21甾体化合物广泛应用于各领域，其在抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、保护肝脏、降血脂、化疗药物增效减毒、抗抑郁等方面具有显著的生物活性。C21甾体化合物主要存在萝蘼、通关藤、白首乌、青阳参和黑蔓藤等植物中。利用植物提取途径制备C21甾体化合物，存在提取过程复杂、生产周期长、溶剂消耗大且回收困难等缺点。
相关研究显示，植物内生菌与植物之间具有相同次生代谢产物合成的途径，能够产生与宿主植物相同或相似的药用活性成分。迄今为止，对植物内生菌次级代谢产物的研究大多为真菌和放线菌，细菌相对较少。目前报道具有C21甾体化合物代谢活性的微生物，其活性表现为能够转化培养体系内的前体物并将其转化为C21甾体苷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高产C21甾体化合物的蜡样芽孢杆菌X-32及其应用，旨在解决上述背景技术中现有技术的不足之处。
本发明是这样实现的，一种高产C21甾体化合物的蜡样芽孢杆菌X-32，该蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)X-32于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211165，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。
本发明进一步公开了一种通过上述蜡样芽孢杆菌X-32发酵制备C21甾体化合物的方法，该方法包括以下步骤：将蜡样芽孢杆菌X-32接种至营养肉汤培养基中培养，接种量为0.5％～2％，在pH为6.0～8.0、温度为28～37℃的条件下，发酵培养48～140h，得到含有C21甾体化合物的发酵液。
优选地，所述接种量为0.5％，pH为8.0，温度为37℃，发酵培养时间为120h。
本发明进一步公开了上述蜡样芽孢杆菌X-32在制备抗癌药物C21甾类化合物中的应用。
优选地，所述抗癌药物C21甾类化合物为隔山消苷C1N。
优选地，所述蜡样芽孢杆菌X-32代谢产出C21甾体化合物的关键酶。
优选地，所述关键酶包括3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR)和鲨烯合酶(SQS)。
本发明克服现有技术的不足，提供一种高产C21甾体化合物的蜡样芽孢杆菌X-32及其应用。本发明从滨海白首乌不同组织部位筛出28株内生细菌，采用改良香草醛比色法测定筛出内生细菌发酵液中C21甾体化合物含量，据此判定具C21甾体化合物合成能力的内生细菌14株，其中蜡样芽孢杆菌X-32发酵液中C21甾体化合物含量显著高于其他菌株(P<0.05)，进一步浓缩及纯化高产蜡样芽孢杆菌X-32发酵液中C21甾体化合物，同时采用LC-MS法对纯化产物进行鉴定。该蜡样芽孢杆菌X-32经理化性状分析及分子鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，目前尚无文献报道该菌可以制备C21甾体化合物。该蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)X-32于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211165，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。
综合蜡样芽孢杆菌X-32胞内、外蛋白多样性分析及代谢关键酶活性及基因检测对蜡样芽孢杆菌X-32中C21甾体化合物合成途径进行探究。设计正交实验优化该菌产C21甾体化合物的能力。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明蜡样芽孢杆菌X-32在培养120h时，发酵液中C21甾体化合物含量为0.52mg/mL，比萝藦中C21甾苷含量0.0033mg/mL高出近150倍(杨蕾等，2012)，发酵条件优化后该菌发酵液中C21甾体浓度达1.280±0.005mg/mL；
(2)本发明的本发明中蜡样芽孢杆菌X-32发酵液的代谢产物经鉴定为隔山消苷C1N，具有较大的市场应用前景；
(3)本发明为微生物合成C21甾体化合物的新途径，具有合成步骤少、生产周期短、转化率高、发酵过程易调控、更环保等优点。
附图说明
图1是本发明蜡样芽孢杆菌X-32的菌落形态；
图2是本发明蜡样芽孢杆菌X-32的LC-MS分析结果；
图3是本发明蜡样芽孢杆菌X-32的胞内、外蛋白含量检测结果；
图4是本发明蜡样芽孢杆菌X-32的胞内蛋白多样性检测结果；
图5是本发明蜡样芽孢杆菌X-32的胞外蛋白多样性检测结果；
图6是本发明蜡样芽孢杆菌X-32的HMGR酶活性检测结果；
图7是本发明蜡样芽孢杆菌X-32内SQS基因检测结果；
图8是本发明蜡样芽孢杆菌X-32发酵优化结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、内生细菌的分离纯化及筛选
1、样品前处理
将采摘自江苏省滨海县果老首乌种植基地的白首乌样品进行预处理。
将自来水清洗过的新鲜白首乌放入超净工作台中，紫外杀菌10min，以无菌水冲洗3次，吸水纸将表面水分吸干后用75％乙醇溶液浸泡根、茎、叶、种子5min，依次经无菌水冲洗，3％次氯酸钠溶液浸泡3min，最后用无菌水冲洗5次。将白首乌根、茎、叶、种子去皮切成小碎块(约5～10g)，置于研钵中，将加入蒸馏水和少量石英砂研磨成匀浆。静置30min后吸取上清液1mL，用蒸馏水依次稀释10～1000倍。
2、内生细菌的分离与纯化
将3种不同浓度的根、茎、叶、种子组织液分别吸取100μL涂布于营养肉汤培养基平板上，恒温培养2～5d。待平板上长出菌落，划线分离纯化得到单一的纯菌落，保存菌种并编号。
营养肉汤培养基：蛋白胨10g、NaCl 10g、牛肉浸出粉3.0g、蒸馏水1 000mL，pH 7.2～7.4，121℃灭菌20min。配制固体培养基时加15～20g琼脂粉。
二、菌种鉴定
1、理化指标检测
对白首乌内生细菌进行革兰氏染色，显微镜观察进行形态鉴定，利用淀粉作为碳源检查其是否能水解淀粉；进行吲哚实验、甲基红试验检测菌种对色氨酸和葡萄糖的利用情况；进行糖发酵实验检测菌株能否使用糖产酸产气情况。置于22℃、27℃、32℃、37℃、60℃恒温培养1～2d后，观察菌株的生长情况。
2、分子鉴定
用营养肉汤培养基过夜培养菌株，收集菌体，提取菌株基因组DNA，PCR扩增菌株16S rRNA基因。
PCR产物测序后，在NCBI上进行核酸序列比对，综合菌株生理生化特性、菌落形态和分子鉴定结果，对筛出内生细菌进行鉴定。
三、白首乌内生细菌发酵液中C21甾体苷含量测定
1、菌种扩选及发酵培养
将筛选出的白首乌内生细菌接入营养肉汤培养基进行扩培，接种量为2％，37℃，150rpm震荡培养24～48h，取样，测OD600值。
将扩培后的细菌转接至营养肉汤培养基，设置3个平行组及对照空白组，接种量为1％，37℃，150rpm。培养72h后，每间隔48h取样，测定发酵液中C21甾体总苷含量。
2、比色法测定发酵液中C21甾体总苷含量
取适量发酵液10,000rpm离心10min，取1mL上清液于试管中，加入新配制的7％香草醛-冰乙酸溶液0.4mL、浓硫酸0.6mL，摇匀，80℃水浴加热30min，反应结束，立刻取出转移至冰水浴，终止反应并加入10mL冰乙酸，摇匀，在450nm波长下测定样品吸光值。从白首乌不同部位分离得到的28株内生细菌，经测定，菌株X-32产C21甾体苷的能力显著高于其他27株菌(P<0.05)，含量为：0.52mg/mL。
四、菌株X-32发酵液中C21甾体化合物的纯化及LC-MS鉴定
1、发酵液中C21甾体的提取
采集菌体发酵液，8,000rpm离心5min，取1mL上清经真空冷冻干燥后，加入8mL乙醇，打匀，10,000rpm离心5min，取上清，按1：4体积比加入混合有机溶剂(乙醚：丙酮(1：1)，摇匀，1,000rpm离心1min，40℃水浴挥发至无液体残留。
2、LC-MS法鉴定C21甾体化合物
将上述纯化样品用60％甲醇水溶液定容至2mL中，摇匀，经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，稀释10倍备用。精密称取各对照品适量，用甲醇溶解定容制成每毫升含告达庭0.165mg、青洋参苷元0.633mg、孕烯醇酮0.5mg的混合溶液，经微孔滤膜(0.22μm)过滤后，稀释10倍备用。利用LC-MS鉴定，对液相色谱得到的结果峰进行质谱分析，色谱条件:Alltima C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；采用乙腈(A)-水(B)梯度洗脱(0～10min，35％A)，流速1mL/min；柱温35℃；检测波长为263nm；进样量10μL。
五、菌株X-32胞内、外蛋白质含量测定及蛋白质多样性分析
1、胞内、外蛋白质含量测定
胞外蛋白质测定样品制备：取一定量的发酵菌液，10,000rpm，离心10min，取上清，4℃保存待用。
胞内蛋白质测定样品制备：取一定量的发酵菌液，10,000rpm，离心10min，去上清。收集菌体沉淀，10mmoL/L Tris-HCL缓冲液清洗，10,000rpm离心10min，去上清，重复2～3次。在菌体沉淀加入20mL 10mmoL/L Tris-HCL缓冲液，冰浴条件下超声破碎(工作5s，停止10s，共40min)。破碎后，8,000rpm，4℃，离心15min，取上清，4℃保存，待用。
取提取液1mL于试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，静置2min。测定并记录OD595的吸光度，并计算胞内、外蛋白含量。
考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90％乙醇中，加入85％(W/V)的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。
2、蛋白质多样性分析
制备所需试剂：分离胶、浓缩胶、电泳缓冲液、染色液、脱色液。
将SDS-PAGE样品前处理，利用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
六、菌株X-32中C21甾体化合物代谢关键酶—HMGR酶活检测
1、样品前处理
10,000rpm，5min离心，收集发酵液或胞内提取液，取1mM乙酰-CoA母液至3倍体积的上述样品中，使其终浓度为0.24mM。37℃反应12h，检测HMGR酶活性。
2、酶活测定
(1)母液制备
1M Tris-HcL：称取1.2114g的Tris加入8mL的超纯水，滴加盐酸，直至pH为7.0，滴定至10mL；
1mM乙酰-CoA母液：1mg样品加1mL的超纯水充分溶解后，再加入0.235mL灭菌超纯水混匀；
7.5mM NADPH母液:10mg样品，加入1mL灭菌超纯水充分溶解后，再加入0.6mL灭菌超纯水混匀；
40mM DTT：10mg样品，加入0.62mL灭菌超纯水充分溶解后，再加入1mL灭菌超纯水混匀。
(2)对照组NADPH的氧化速率(a)
HMGR酶活测定反应体系：5μL1 M Tris-HcL，1μL7.5 mM NADPH，10μL40 mM DTT。
在上述反应体系中加入10μL上清液，立即计时，340nm处每隔30sec检测NADPH的氧化情况，连续测定5min。
(3)试验组NADPH的氧化速率(b)
在反应体系中加入10μL添加乙酰-CoA的处理样品后，立即计时，在340nm处每隔30sec检测NADPH的氧化情况，连续测定5min。
3、酶活计算公式
HMGR相对活性(U/mg-protein)＝酶液稀释倍数×△A340×V1/(ε*d*C*V2)
其中，
△A340＝△A340b-△A340a；
△Ab和△Aa：平均每分钟相对对照组的吸光度变化值；
V1为反应体系体积(μL)；
ε为NADPH的吸光系数(6.22x 10-6pmoL-1cm-1)；
d为测定光源直径(0.67mm)；
C为蛋白浓度(mg/mL)；
V2为加入反应体系中的酶液体积(10μL)。
菌株X-32胞内、外HMGR酶活测定结果见图6。
七、菌株X-32中SQS鲨烯合酶基因检测
设计鲨烯合酶(SQS)特异性引物：
SQS F1231：CTTTTCCATGCTGCCTA，
SQS R1231：GCTGTTCTTTTTTACGC。
对菌株X-32基因组内SQS鲨烯合酶基因进行克隆及检测(见图7)。
八、高产C21甾体化合物菌株的发酵条件优化
采用3因素3水平正交实验，优化菌株X-32发酵液中C21甾体化合物产量。其中，接种量为：0.5％、1％、2％；pH为6、7、8；温度为：28℃、32℃、37℃。
发酵方法：将菌株X-32接种至营养肉汤培养基中培养，接种量为2％，37℃，150rpm。从培养72h起，每间隔48h测定发酵液中C21甾体总苷含量。
本发明中菌株X-32在培养120h时，发酵液中C21甾体化合物含量为0.52mg/mL。
在温度37℃、接种量0.5％、pH 8.0、发酵时间120h时，该菌株发酵液中C21甾体化合物含量为：1.28±0.005mg/mL。
九、结论与分析
本发明中通过对白首乌内生细菌中C21甾体化合物代谢活动的研究，综合菌株生长特征及产C21甾体化合物的能力及稳定性，优选菌株为蜡样芽孢杆菌X-32(图1)。经分析，菌株X-32的发酵液纯化物中含有C21甾体化合物：隔山消苷C1N，菌株的LC-MS鉴定结果判断其代谢C21甾体化合物能力较强(图2)。
本发明中高产菌株X-32的胞内、外蛋白丰富(图3)，SDS-PAGE均能检测出C21甾体化合物代谢两种关键酶(图4、图5)。菌株X-32胞内HMGR酶活性测定结果显著高于胞外(P<0.05)(图6)。
本发明中菌株X-32首先在胞内代谢产生较多且丰富的蛋白后分泌于胞外，通过类异戊二烯生物途径(MVA)利用C21甾体化合物的两种关键酶(HMGR酶和SQS酶)合成C21甾体化合物(图7)。
本发明中菌株X-32产C21甾体化合物最适发酵培养条件为：接种量为0.5％、pH为8、温度为37℃，最高含量为：1.280±0.005mg/mL。对发酵条件优化后白首乌蜡样芽孢杆菌X-32产C21甾体化合物的能力比优化前提高了91％(图8)，比目前传统植株产C21甾体高出将近10倍，将极大缓解工艺生产C21甾体化合物的压力。
因此，白首乌蜡样芽孢杆菌X-32作为新型药物来源，C21甾体化合物能力强，且生长条件和发酵过程易控制，本发明可为C21甾体化合物大规模高产制备提供新途径。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 盐城师范学院
<120> 一种高产C21甾体化合物的蜡样芽孢杆菌X-32及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttttccatg ctgccta 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgttcttt tttacgc 17

Claims (7)

1.一种高产C21甾体化合物的蜡样芽孢杆菌X-32，其特征在于，该蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)X-32于2021年09月13号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211165，保藏地址为：武汉市武昌区珞珈武汉大学保藏中心，邮编为：430072。
2.一种通过权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌X-32发酵制备C21甾体化合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将蜡样芽孢杆菌X-32接种至营养肉汤培养基中培养，接种量为0.5％～2％，在pH为6.0～8.0、温度为28～37℃的条件下，发酵培养48～140h，得到含有C21甾体化合物的发酵液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述接种量为0.5％，pH为8.0，温度为37℃，发酵培养时间为120h。
4.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌X-32在制备抗癌药物C21甾类化合物中的应用。
5.如权利要求4所述的的应用，其特征在于，所述抗癌药物C21甾类化合物为隔山消苷C1N。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌X-32代谢产出C21甾体化合物的关键酶。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述关键酶包括3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR)和鲨烯合酶(SQS)。
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